Chemoselective poly(oxazolines) (POx) and poly[(oligo ethylene glycol) acrylates] were synthesized. An initiator was produced for the preparation of poly(oxazoline)s capable of participating in click chemistry reactions which allows the functionalization of the polymer at the α terminus which was confirmed by 1H NMR spectroscopy. The initiator was used for the polymerization of hydrophilic 2 methyl 2 oxazoline (MeOx), whereby chemoselective, alkyne functionalized polymers could be prepared for Cu-catalyzed azide–alkyne cycloaddition. The desired molecular weight could be achieved through the living, ring opening cationic polymerization and was confirmed by 1H NMR, SEC and MALDI ToF measurements. Polymers were terminated with piperidine if no further functionalization was needed, or with an ester derivate for enabling amine attachment in a subsequent step. In addition, polymers were functionalized by termination with NaN3 in order to provide the counterpart to the azide–alkyne reaction. IR spectroscopy was suitable for the azide detection. The coupling of polymers showed the reactivity and could be confirmed by SEC, 1H NMR and IR spectroscopy. The composition of cysteine functionalized POx was completed by thiol–ene chemistry. Since the commercially available iso 2 propyl 2 oxazoline is not available for the cationic polymerization, 2 butenyl and 2 decenyl 2 oxazoline (ButenOx and DecenOx) were first prepared. The synthesis of both copolymers, based on MeOx could be confirmed by 1H NMR as well as with SEC, whereby narrow distributions with dispersities of 1.06 could be achieved. The cysteine functionalization of the copolymers was enabled by the creation of a thiazolidine component which could be synthesized by acetal and formyl protection of cysteine and subsequent functionalization with a thiol. The component enabled the reaction with a polymer by thiol–ene reaction which was started by the addition of dimethoxyphenyl-acetophenone and was catalyzed by irradiation with UV light. Both copolymers, with a shorter (polymers with BuenOx) and longer (polymers with DecenOx) hydrophobic sidechain could be functionalized. 1H NMR spectroscopic analysis showed a quantitative reaction with the thiazolidine derivate. After deprotection by acidic workup the desired, cysteine functionalized polymer could be isolated. Quantification of cysteine functions was ensured by a modified TNBSA assay, whereby the thiols were first oxidized in order to confirm an independent measurement of amine functions. Both, the TNBSA assay as well as the NMR measurement showed the desired number of cysteine residues. The cytotoxicity of functionalized polymers with different compositions was tested by a luminescent cell viability assay (LCVA). Both, the amount of cysteine functions (5–10%) in the copolymers as well as the length of the hydrophobic side chain were varied. All polymers did not show cytotoxicity up to concentrations of 10 mg∙mL-1. The cell activity and cell numbers only decreased below 50% and 20% respectively, when copolymers with 5% cysteine and longer sidechains were measured, which was attributed to a contamination of the sample itself. The cooperation partner performed Native Chemical Ligation (NCL) with model peptides and purified the products by HPLC. A sterically non demanding peptide was synthesized, consisting of an aromatic amino acid and four glycine units. The aromatic unit was used for the quantification of the polymer–peptide conjugate in the 1H NMR spectroscopy. A polymer having five cysteine side chains has been fully implemented by NCL to a conjugate of one polymer with five peptides. A sterically more demanding peptide was additionally used and MALDI ToF measurements confirmed the successful conjugation. Furthermore the cysteine functionalized polymer was used for nanogel synthesis. The thiol of the cysteine function was oxidized in an inverse mini-emulsion by H2O2, resulting in nanogels (~500 nm) which could be confirmed by SEM, AFM, DLS and NTA measurements. Besides POx, oligo (ethylene glycol)acrylates (OEGA) were polymerized; by copolymerization with the reactive pentafluorophenyl acrylate (PFPA) reactive and amphiphilic polymers were obtained. The synthesis of PFPA could be confirmed spectroscopically by 1H , 19F NMR, and by FT IR. Copolymers were synthesized by RAFT polymerization with narrow dispersities. Functionalization with an amine functionalized thiazolidine led to a hydrophilic cysteine functionalized polymer after acidic deprotection. Apart from this polymer, a thioester functionalization was successfully performed by reaction of the active polymer with a cyclic amine functionalized thioester which does not release a toxic by product (such as the resulting thiol) during NCL and thus features a very high potential to replace former thioester. / Als hydrophile Polymere wurden chemoselektive Poly(oxazoline) (POx) und Poly(oligoethylenglykol)acrylate synthetisiert. Für die Darstellung von „klickfähigen“ Poly(oxazolinen) wurde ein Initiator synthetisiert, welcher eine Funktionalisierung des Polymers am α Terminus ermöglicht. Die erfolgreiche Darstellung wurde mittels 1H NMR Spektroskopie bewiesen. Der Initiator wurde für die Polymerisation von hydrophilem 2 Methyl 2 oxazoline (MeOx) eingesetzt, wodurch chemoselektive, Alkin funktionalisierte Polymere dargestellt werden konnten. Die gewünschten Molmassen konnten durch die lebende, Polymerisation erreicht werden und durch 1H NMR, GPC und MALDI Messungen bewiesen werden. Die Terminierung der Polymere erfolgte durch Abbruch mit Piperidin oder durch Abbruch mit einem Ester Derivat, um die Anbindung mit Aminen zu ermöglichen. Außerdem wurden Polymere durch die Terminierung mit NaN3 funktionalisiert, um das Pendant zur Azid–Alkin¬-Cycloaddition liefern zu können. Die IR-Spektroskopie eignete sich hierbei für die Azid-Detektion. Die Kopplung beider Polymere, zum Nachweis der Reaktivität, konnte durch die GPC, 1H NMR und IR Spektroskopie bestätigt werden. Die Darstellung von Cystein funktionalisierten POx konnte durch Thiol–en Chemie realisiert werden. Dazu wurde ein Copolymer mit Allylseitenketten synthetisiert. Da das kommerziell erhältliche iso-Propyloxazoline nicht für die kationische Polymerisation zur Verfügung steht, wurden Butenyl und Decenyloxazolin (ButenOx und DecenOx) synthetisiert. Die Darstellung des Copolymers, basierend auf MeOx, konnte mit 1H NMR und der GPC bestätigt werden. Enge Verteilungen bis zu einer Disperistät von 1.06 wurden erreicht. Die Cysteinfunktionalisierung der Copolymere wurde durch die Synthese eines Thiazolidinbausteins ermöglicht. Dieser konnte durch Acetal- und Formylschützung von Cystein und anschließender Funktionalisierung mit einem Thiol dargestellt werden. Der Baustein ermöglichte die Umsetzung des Polymers mit dem geschützten Cysteinderivat. Diese wurde durch Zugabe von Dimethoxyphenyl-acetophenon gestartet und durch Bestrahlung mit UV-Licht katalysiert. Sowohl Copolymere mit einer kürzeren (Einsatz von ButenOx) und langen (Einsatz von DecenOx) hydrophoben Seitenkette konnten mittels Thiol–en Chemie funktionalisiert werden. 1H NMR spektroskopische Analysen zeigten eine quantitative Umsetzung mit dem Thiazolidinderivat. Nach Entschützung konnte das gewünschte, Cystein funktionalisierte Polymer isoliert werden. Die Quantifizierung der Cysteinfunktionen wurde durch einen modifizierten TNBSA assay gewährleistet, wobei die Thiole des Cysteins zunächst oxidiert wurden, damit diese keinen Einfluss auf die Messung haben konnten. Sowohl der TNBSA assay als auch die NMR-spektroskopische Messmethode zeigte die gewünschten Anzahlen von Cysteinresten. Die funktionalisierten Polymere wurden mit unterschiedlichen Zusammensetzungen auf Zelltoxizität geprüft. Der Anteil an Cysteinfunktionen (5 10%) und die Länge der hydrophoben Seitenkette wurden variiert. Alle Polymere waren bis zu einer Konzentration von 10 mg∙mL-1 nicht toxisch. Die Zellaktivität und Zellzahl sank nur beim Copolymer mit 5% Cystein und langer Seitenkette unter einen Wert von 50% bzw. 20%, was auf eine Verunreinigung der Probe zurückgeführt wurde. Der Kooperationspartner führte die Native Chemische Ligation (NCL) mit verschiedenen Modellpeptiden durch und reinigte die Produkte mittels HPLC. Es wurden sterisch unanspruchsvolle Peptide synthetisiert, die aus einer aromatischen Aminosäure und vier Glycineinheiten bestanden. Der Aromat konnte in der 1H NMR Spektroskopie für die Quantifizierung der Polymer–Peptid Konjugate genutzt werden. Ein Polymer mit fünf Cysteinseitenketten wurde vollständig mittels NCL zu einem Konjugat aus einem Polymer mit fünf Peptiden umgesetzt. Ein sterisch anspruchsvolleres Peptid wurde im Nachhinein verwendet, wobei MALDI-ToF Messungen die Konjugation bestätigten. Das cysteinfunktionaliserte Polymer wurde außerdem für die Nanogelsynthese verwendet. Hierbei wurde das Thiol der Cysteinfunktion mittels H2O2 in einer inversen Miniemulsion oxidiert, woraus Nanogele resultierten, die mittels REM, AFM, DLS und NTA bestätigt werden konnten. Neben POx wurden Copolymere aus (Oligoehtylenglykol)acrylate und Pentafluorophenylacrylat synthetisiert und reaktive amphiphile Polymere erhalten. Die Darstellung von Pentafluorophenylacrylat konnte durch 1H und 19F NMR als auch durch FT IR spektroskopisch bestätigt werden. Copolymere wurden mittels RAFT Polymerisation mit engen Dispersitäten und den gewünschten Molmassen synthetisiert. Die Funktionalisierung mit einem aminfunktionalisierten Thiazolidin führte nach saurer Entschützung zu einem hydrophilen cysteinfunktionalisierten Polymer. Neben dieser Komponente konnte eine Thioesterfunktionalisierung durch Reaktion mit einem cyclischen aminfunktionalisierten Thiolacton erfolgreich durchgeführt werden.

Thesis (doctoral)--Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 1994.

In summary, structure-activity relationships in peptide and dendrimer carriers modified with different organometal complexes were studied on a human breast cancer cell line. Variation of the organometal cargo and carrier can significantly influence their biological properties and might open the way to new approaches in chemotherapy. Furthermore, the incorporation of complexes with different C≡O vibrational signatures in a model peptide was explored to examine information encoding in biomolecules in a barcoding strategy for potential imaging applications. In particular for the latter, additional stable metal-carbonyl markers need to be prepared in future work to expand the pool of vibrational labels available. / In der vorliegenden Arbeit konnten also Struktur-Wirkungs-Beziehungen für Organometall-Peptid- und Dendrimer-Konjugate mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen an einer humanen Brustkrebs-Zelllinie untersucht werden. Die Variation der Organometall-Gruppen und des Trägermoleküls führen zu signifikanten Unterschieden in ihrer biologischen Aktivität. Zusätzlich wurden Modell-Peptide mit verschiedenen Metallcarbonyl-basierten IR-Markern versehen um diese in einer Barcoding-Strategie zu labeln. In Zukunft soll das Spektrum der verfügbaren, nicht-überlappenden Schwingungsmarker noch deutlich erweitert werden.

Universiẗat, Diss.--Kaiserslautern, 1994.

Zugl.: Bielefeld, Univ., Diss., 2008

Polymer-Biokonjugationen, vornehmlich mit dem Goldstandard PEG, führen zu einer verbesserten Pharmakokinetik, beeinflussen aber auch die konformative Stabilität von Proteinen. Bisherige Mutationsstudien, in denen überwiegend (Asn)PEG4 -Konjugate der Beta-faltblattstrukturreichen, humanen Pin 1 WW-Domäne untersucht wurden, postulieren auf einer Proteindesolvatation beruhende Stabilisierungsmechanismen: eine Stärkung intramolekularer Salzbrücken und NH-pi-Bindungen, sowie entropisch günstige Wasserverdrängungen um apolare Aminosäuren und Hydroxylgruppen. Ziel dieser Arbeit ist es, die Protein-Polymer-Dynamik auf molekularer Ebene zu charakterisieren, um damit rationale Ansätze zum Design neuer Biokonjugate voranzutreiben und mögliche PEG-Alternativen zu etablieren. Hierzu wurde eine Vielzahl an Deskriptoren mittels Molekulardynamik-Simulationen der WW-Konjugate gewonnen und mit publizierten Stabilitätsdaten in multivariaten Regressions- und logistischen Klassifikationsmodellen korreliert. Die gewonnenen QSPR-Modelle decken im Vergleich zu einer bereits publizierten, kristallstrukturbasierten Richtlinie einen größeren und strukturell vielfältigeren Datensatz an Konjugaten ab und zeigen gleichzeitig, auch für ein Konjugat der Src SH3-Domäne, eine deutlich verbesserte Leistung. Die Modelldeskriptoren beschreiben sowohl eine Modulation der Solvatation als auch Protein-Polymer-Interaktionen. Metadynamik-Simulationen zeigten zudem die Polymerdynamik während einer partiellen Proteinentfaltung auf. Mithilfe weiterer Simulationen von Konjugaten des alpha-helikalen Her2-Affibodys wurde die Dynamik von PEG und verschiedener Alternativen (LPG, PEtOx, PMeOx) systematisch studiert. PEG interagierte mit positiv geladenen Lysinen und Argininen in der Nähe hydrophober Aminosäuren. LPG zeigte zusätzliche Wechselwirkungen der Hydroxylgruppen mit Aspartaten und Glutamaten. POx-Polymere interagierten mit Phenylalaninen, Tyrosinen und über Carbonylgruppen mit HB-Donatoren. Größere Konjugate (10 - 50 kDa PEG/LPG/PEtOx) des antiviralen Biologikums Interferon-alpha2a wurden mittels gaußbeschleunigter MDs und einer CG-Simulation analysiert. Charakteristische Wechselwirkungspartner stimmten mit den Beobachtungen zu Oligomer-Konjugaten überein. In Einklang mit experimentellen Daten der Kooperationspartner zu den 10-kDa-Varianten deuteten zusätzliche Constrained-Network-Analysen, welche die Proteinflexibilität evaluieren, auf eine thermische Destabilisierung hin. Die Bioaktivität der untersuchten Konjugate wurde weiterhin erfolgreich mit den Gyrationsdurchmessern der modellierten Strukturen korreliert. / Bioconjugation of polymers, mainly the gold standard PEG, can improve pharmakokinetic properties but also modulate conformational stability of proteins. Mutation studies on (Asn)PEG4 conjugates of the beta-sheet rich human Pin 1 WW domain suggest various desolvation effects playing a crucial role: strengthening of intramolecular salt-bridges and NH-pi bonds, as well as entropically favorable water expulsion around hydrophobic patches and hydroxyl groups. The goal of this study is to characterize protein-polymer dynamics on a molecular level to drive forward rational design of new bioconjugates and establish viable PEG alternatives. A variety of descriptors was calculated from molecular dynamics simulations of WW conjugates and correlated with published stability data generating multivariate regression and logistic classification models. Compared to a previously published crystal structure-based guideline, QSPR models covered a structurally more diverse and bigger dataset and showed significantly improved predictions, including for a conjugate of the Src SH3 domain. Model descriptors captured modulations of solvation as well as protein-polymer interactions. Metadynamics simulations depicted PEG dynamics upon partial protein unfolding. Combined with simulations for conjugates of the alpha-helical Her2 affibody, data was further used to systematically dissect the dynamics of PEG and its alternatives LPG, PEtOx and PMeOx. PEG interacted with lysines and arginines near hydrophobic patches. LPG additionally adressed aspartates and glutamates via its hydroxyl groups. POx variants interacted with phenylalanines, tyrosines, as well as hydrogen bond donors via carbonyl groups. Larger conjugates (10 - 50 kDa PEG/LPG/PEtOx) of antiviral biologic Interferon-alpha2a were analyzed via Gaussian accelerated MDs and an exemplary CG simulation. Interaction patterns agreed with observations for oligomer conjugates. In accordance with experimental data of collaboration partners for 10 kDa variants, constrained network analyses, assessing protein flexibility, suggested a thermal destabilization upon bioconjugation. Bioactivity of conjugates was further successfully correlated with diameters of gyration of modeled structures.

Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2009

Im Rahmen der Arbeit werden hierarchisch strukturierte Silikakompositfasern präsentiert, deren Bildung ähnlich zu natürlichen Silifizierungsreaktionen verläuft. Als Analoga zu Proteinfilamenten in Silika Morphogeneseorganismen werden selbstorganisierte, funktionale Polyethylenoxid-Peptid-Nanobänder eingesetzt. Mit der Isolierung einheitlicher Nanokompositfasern wird gezeigt, dass die PEO-Peptid-Nanobänder eine starke Bindungsaffinität gegenüber Kieselsäure besitzen, diese aus sehr stark verdünnten Lösungen anreichern und deren Kondensation zu Silikanetzwerken kontrollieren können. In höheren Konzentrationen entstehen durch die peptidgeleitete Silifizierung der PEO-Peptid-Nanobänder spontan makroskopische Kompositfasern mit sechs Hierarchieebenen. Diese verbinden Längen von bis zu 3 cm und Durchmesser von 1-2 mm mit einer definierten Feinstruktur im Submikrometerbereich. Als Resultat der komplexen inneren Struktur und der Kontrolle der Grenzflächen zwischen Nanobändern und Silika wird eine Nanohärte erreicht, die schon ~1/3 der Härte von Bioglasfasern darstellt. Für die Elastizität (reduziertes Eindrückmodul) dagegen konnte durch den relativ hohen Anteil (~40%) an verformbaren, organischen Komponenten ein ~4-mal größer Wert im Vergleich mit Bioglasfasern bestimmt werden. Des Weiteren wird die Prozessierung der makroskopischen Kompositfasern in einem 2D-Plotprozess vorgestellt. Mit Verwendung der PEO-Peptid-Nanobänder als „Tinte“ können Kompositobjekte in beliebigen Formen geplottet werden, deren Linienbreite sowie anisotrope Ausrichtung der Nano- und Submikrometerstrukturelemente direkt mit der Plotgeschwindigkeit korrelieren. Außerdem können die Kompositobjekte als Vorstufen für orientierte, mesoporöse Silikaobjekte verwendet werden. Nachdem Calcinieren werden Silikastrukturen mit einer hohen spezifischen Oberfläche und in Plotrichtung ausgerichteten zylindrischen Poren erhalten. Im Kontrast zu den anorganisch-bioorganischen Kompositfasern sollten unter Ausnutzung ionischer Wechselwirkungen oder Metallkoordination Kompositmaterialien mit anderen mechanischen Eigenschaften dargestellt werden. Es wird gezeigt, dass durch Variationen in der Aminosäuresequenz des Peptidkerns, die Oberflächen der PEO-Peptid-Nanobänder gezielt mit funktionellen Gruppen versehen werden können. Eine gerichtete Vernetzung dieser modifizierten Nanobänder wurde nicht erreicht, dafür könnten die imidazolfunktionalisierten Nanobänder als eindimensionale Protonenleiter, die mit photochromen Gruppen (Spiropyran) funktionalisierten Nanobänder für die Modifizierung von Oberflächenpolaritäten oder für gerichtete Kristallisationsprozesse eingesetzt werden. / In this work hierarchical structured silica-composite fibers are presented, whose formation is similar to natural silicification processes. Self-assembled, functional poly(ethylene oxide) (PEO) peptide nanotapes were utilized as analogue to protein filaments in silicamorphogenese organism. Isolation of homogenous nano composite fibers demonstrates that the PEO peptide nanotapes have a high affinity to bind silicic acid. They are able to enrich silicic acid from very dilute solution and can control the silica condensation process. Macroscopic composite fibers spontaneously arise if the PEO peptide nanotapes in a higher concentration were mixed with the silica precursor. These exhibit six distinguishable levels of hierarchical order, spanning length scales from the nanometer up to millimeters in lateral and even centimeters in longitudinal dimensions. As a result of the inner structure, reinforced composite fibers were obtained, exhibiting 1/3 of the mechanical hardness of natural glass sponge spicules. The elasticity, which is considered as one limiting factor in optical glass fibers, could be enhanced 4-times due to the incorporation of an increased amount of polymer peptide nanotapes (~40%). In addition a 2D-plot process is introduced, in which the polymer peptide nanotapes acts as an ink. By injecting a solution of the nanotapes into a diluted silicic acid solution composite objects can be plotted in any desired way. The width of the plotted lines as well as the anisotropic orientation of the nano- and sub micrometer structure elements correlates directly to the plotting speed. Besides the composite objects can be utilized as precursors for oriented, mesoporous silica objects. After a calcination procedure silica structures with cylindrical pores, aligned in plot direction, and a high specific surface area were received. In contrast to the inorganic-organic composite fibers other composite materials with different mechanical properties should be created exploiting ionic interactions or metal coordination. A variation in the amino acid sequence of the peptide core leads to an aimed functionalisation of the nanotape surfaces. A directed networking of such nanotapes was not observed, but imidazole functionalised nanotapes could maybe be used as one dimensional proton conductors. The nanotapes, which were tagged with photo chromic spiropyran units, have the ability to be used for controlled crystallization processes or the modification of surface polarities.

Controlling interactions in synthetic polymers as precisely as in proteins would have a strong impact on polymer science. Advanced structural and functional control can lead to rational design of, integrated nano- and microstructures. To achieve this, properties of monomer sequence defined oligopeptides were exploited. Through their incorporation as monodisperse segments into synthetic polymers we learned in recent four years how to program the structure formation of polymers, to adjust and exploit interactions in such polymers, to control inorganic-organic interfaces in fiber composites and induce structure in Biomacromolecules like DNA for biomedical applications. / Die Kontrolle von Wechselwirkungen in synthetischen Polymersystemen mit vergleichbarer Präzision wie in Polypeptiden und Proteinen hätte einen dramatischen Einfluss auf die Möglichkeiten in den Polymer- und Materialwissenschaften. Um dies zu erreichen, werden im Rahmen dieser Arbeit Eigenschaften von Oligopeptiden mit definierter Monomersequenz ausgenutzt. Die Integration dieser monodispersen Biosegmente in synthetische Polymere erlaubt z. B. den Aufbau von Peptid-block-Polymer Copolymeren. In solchen sogenannten Peptid-Polymer-Konjugaten sind die Funktionalitäten, die Sekundärwechselwirkungen und die biologische Aktivität des Peptidsegments präzise programmierbar. In den vergangen vier Jahren konnte demonstriert werden, wie in Biokonjugatsystemen die Mikrostrukturbildung gesteuert werden kann, wie definierte Wechselwirkungen in diesen Systemen programmiert und ausgenutzt werden können und wie Grenzflächen zwischen anorganischen und organischen Komponenten in Faserkompositmaterialien kontrolliert werden können. Desweiteren konnten Peptid-Polymer-Konjugate verwendet werden, um für biomedizinische Anwendungen DNS gezielt zu komprimieren oder Zelladhäsion auf Oberflächen zu steuern.

We present the bioconjugation of avidin as a central and/or bridging building block with mono-, bi- and tetravalent biotinylated glycodendrimers to fabricate defined supramolecular nanostructures for future (bio)medical applications. For this purpose mono-, bi- and tetravalent biotinylated glycodendrimers, decorated with short alkyl-linked or long PEG-linked biotin ligands, were synthesized and characterized by NMR, IR and mass spectrometry and HABA displacement assay. Various techniques (UV/Vis, DLS, TEM, LILBID-MS and AF4) were used in order to obtain information about the structural properties of different conjugates of avidin and mono-, bi- and tetravalent biotinylated glycodendrimers. The biotin ligand’s spacer length, its chemical structure and the degree of biotin functionalization are essential parameters in the formation of nanostructures with avidin having a controlled composition and size dimension up to 100 nm. Biohybrid structures with avidin as a central unit require monovalent glycodendrimers with PEG-linked biotin, while bi- and tetravalent glycodendrimers with short alkyl-linked biotin ligands are more efficient than their counterparts with longer PEG–biotin ligands in the fabrication of defined biohybrid structures (∅ up to 100 nm) with avidin as a bridging unit. The most dominating key issue, combined with other conjugation issues, is the optimal ligand–receptor stoichiometry to fabricate biohybrid structures with diameter of <20, <30 or up to 100 nm.