In der vorliegenden Arbeit werden drei neue Klassen von modular zugänglichen Elektrophilen für die Biokonjugation von Cystein vorgestellt. Diethynyl-phosphinate (DPs) wurden als bisreaktive Elektrophile für die cysteinselektive Markierung von Peptiden, Proteinen und Antikörpern entwickelt. In diesen Molekülen können beide elektronenarmen Dreifachbindungen unter physiologischen Bedingungen mit Thiol-Nukleophilen reagieren und die erhaltenen Konjugate sind in menschlichem Plasma und in Gegenwart großer Mengen an reduziertem Glutathion stabil. Darüber hinaus wurden DPs in der selektiven Herstellung verschiedener Protein-(Doppel)-Konjugate angewandt. Neben der klassischen Proteinmodifikation können DPs auch zur kovalenten Verbrückung der Disulfidbrücken von Antikörpern eingesetzt werden. Weiters wurde mit Hilfe von Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen werden Ethinyl-triazolyl-phosphinate (ETP) als eine neue Klasse hochreaktiver Elektrophile für die Cystein-Biokonjugation entdeckt. Die Berechnungen zeigen, dass sowohl die elektronenziehenden als auch die π-Elektronen donierenden Eigenschaften des Triazolrings die Reaktivität erhöhen. Vor allem aber wird gezeigt, dass ETP-Elektrophile über die chemoselektive Cu(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition in ein azidhaltiges Molekül eingebaut werden können. Da diese Reaktion problemlos in wässrigen Puffersystemen abläuft, konnte eine Vielzahl funktioneller Elektrophile, einschließlich elektrophiler Peptide und Proteine, aus DPs erzeugt werden. Schließlich wurden Diethinylphosphinoxide als chemoselektive Reagenzien zur Disulfidvererbrückung untersucht. Insbesondere Diethinyl-Triazolyl-Phosphinoxide (DTP) sind vielversprechende Kandidaten, da sie die modulare Synthese von ETP-Elektrophilen mit den beiden reaktiven Gruppen in DPs kombinieren. Die Fähigkeit der DTP-Reagenzien, Disulfide zu verbrücken, wurde durch die Bildung mehrerer funktioneller Antikörperkonjugate gezeigt. / The present work introduces three new classes of modular accessible electrophiles for cysteine bioconjugation. Diethynyl-phosphinates (DPs) were developed as bisreactive electrophiles for the cysteine-selective modification of peptides, proteins and antibodies. Both electrophilic alkynes can react with thiol-nucleophiles under physiological conditions. The corresponding double-conjugates are stable in human plasma and in the presence of a large excess reduced glutathione. Furthermore, the general applicability of diethynyl phosphinates for cysteine selective bioconjugation was established by the generation of various protein-(double)-conjugates and their application in cell experiments. Additionally, DPs can be employed to covalently rebridge the interchain disulfides of therapeutically relevant IgG1 antibodies. Furthermore, with the help of density functional theory based calculations, ethynyl-triazolyl-phosphinates (ETP) were discovered as a new class of highly reactive electrophilic warheads for cysteine bioconjugation. According to the calculations, both the electron withdrawing as well as the π-electron donating properties of the triazole-ring enhance the reactivity of the electrophile. Most importantly, it was demonstrated that ETP electrophiles can be incorporated into a given azide containing molecule via the chemoselective CuI-catalyzed azide alkyne cycloaddition. ETP-reagents were used to obtain functional peptide-, protein- and antibody-conjugates, as well as site-specifically linked diubiquitins. Finally, diethynyl phosphine oxides were explored as chemoselective reagents for disulfide rebridging. Especially diethynyl-triazolyl-phosphine oxides (DTP) are promising candidates since they combine the modular synthesis of ETP-electrophiles with the two reactive groups present in diethynyl phosphinates. The capability of DTP-reagents to rebridged disulfides was proven by the formation several functional antibody conjugates.

Ein Schlüsselprozess in der Immunantwort ist die durch das proinflammatorische Zytokin Interferon-gamma (IFNg) induzierte transiente Akkumulation von neu synthetisierten defekten Proteinen, die durch Anknüpfen von Polymeren des Proteins Ubiquitin (Ub) post-translational modifiziert werden. Die Ubiquitinierung ist das Schlüsselsignal für den Abbau dieser Proteine. Die Abbauprodukte dienen unter anderem als Quelle für die Prozessierung von Antigenen. Um die frühe Immunantwort besser zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit die Identität und Charakteristika dieser neu synthetisierten Proteine, sowie die Topologie ihrer post-translationalen Modifizierung durch Ub untersucht. Dazu wurde die massenspektrometrischen Analyse ubiquitinierter Proteine weiterentwickelt, indem die experimentellen Konditionen auf deren Analyse optimiert wurden. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass die kombinierte Verdauung der Ub-Konjugate mittels zweier Peptidasen die Identifizierung der Proteinpeptide und der Indikatorpeptide für Ubiquitinierungsstellen entscheidend verbessert. Es wurde demonstriert, dass eine selektive Isotopenmarkierung der neu synthetisierten Proteine möglich ist. Mit Hilfe dieser Methode gelang es, Veränderungen der Ub Modifikationen bezüglich der Topologie sowie quantitative Unterschiede der ubiquitinierten Proteine aus humanen HeLa-Zellen in An- und Abwesenheit von IFNg zu identifizieren. Nach Induktion durch IFNg wurden drei polyubiquitinierte, drei mono- oder polyubiquitinierte und 111 potentiell ubiquitinierte Proteine identifiziert. Diese Proteine zeigten, dass keine generelle Ubiquitinierungspräferenz für die durch IFNg verstärkt transkribierten Gene besteht. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das Verständnis der frühen zellulären Immunantwort und tragen zum Verständnis von Krebs- und Autoimmunerkrankungen sowie chronischen Entzündungsprozessen bei. Möglicherweise bilden sie die Grundlage für die Weiterentwicklung entsprechender Therapien. / A key process within the immune response of organisms is the transient accumulation of newly synthesized defective proteins affected by the proinflammatory cytokine interferon-gamma(IFNg). These proteins are post-translationally modified by attachment of polymers of the protein ubiquitin (Ub), which represents the key signal for targeting them to degradation. The resulting peptides can serve as sources for antigen processing. In order to get an insight into the details of the cellular early immune response, the identity and characteristics of the newly synthesized proteins and the topology of their post-translational modification with Ub were investigated. An essential progress of the mass spectrometric approach was achieved by optimizing the experimental conditions with regard to the requirements of the analysis of the targeted proteins. In particular, it could be shown that a combined digestion of Ub-conjugates with two peptidases leads to an improved detection of protein peptides and indicator peptides for ubiquitination sites. It was shown that a selective isotopic labeling of the newly synthesized proteins was possible. With this method, a decisive step forward was made in the understanding of changes of the Ub modifications with respect to the topology and in clarifying the quantitative differences between Ub-conjugates from IFNg treated and untreated human HeLa cells. Three IFNg induced polyubiquitinated proteins, three mono- or polyubiquitinated as well as 111 potential Ub-substrates could be identified. These proteins did not show any general ubiquitination preference for genes whose transcription is enhanced in presence of IFNg. The results obtained in this work help to broaden and refine the general picture of the early cellular immune response. They contribute to the knowledge on molecular processes of cancer, autoimmune diseases or chronic inflammation and, potentially, can give hints for the continued development of corresponding therapies.

Inspiriert durch natürliche Grenzflächenproteine in Knochen wurden bifunktionale Biokonjugate für verschiedene Grenzflächenstabilisierungen genutzt. In einem kombinatorischen Ansatz wurden materialspezifische Peptid-block-Polyethylenglycol-Konjugate eingesetzt, um die Grenzflächen von Nanopartikeln in Lösung sowie in Polymerkompositen zu stabilisieren. Dazu wurden biokombinatorisch ausgewählte Peptid-Sequenzen mit einer Affinität für MgF2-Oberflächen in Form eines MgF2-bindenden Konjugats (MBC) synthetisiert, welches die materialaffine Bindung der monodispersen Peptid-Domäne mit der zusätzlichen Funktion des synthetischen Polymer-Blocks verbindet. Aus detaillierten Untersuchungen der Bindungseigenschaften von MBC und davon abgeleiteten Konjugaten mit variierten Peptidarchitekturen bzw. Polymer-Blocklängen bei verschiedenen Inkubationsbedingungen ging hervor, dass das sequenzspezifisch bindende MBC das Potenzial zur Stabilisierung von MgF2-Nanopartikeln hat. Das Konjugat verhinderte die Agglomeration der Partikel und ermöglichte im Gegensatz zu etablierten Stabilisatoren die vollständige Redispergierbarkeit sogar nach Eintrocknung. Die Stabilisierung in Lösung wurde auf die Kompatibilisierung von Partikeln in Polycaprolacton (PCL)-Kompositen übertragen, in denen das grenzflächenaktive MBC die Materialeigenschaften von bioabbaubaren PCL/MgF2-Kompositen optimierte. Die Grenzflächenstabilisierung führte zur gleichzeitigen Erhöhung der Steifigkeit und der Zähigkeit der Materialien bis in den Bereich natürlicher Knochen. Durch die gemeinsame Zugabe von MBC-kompatibilisiertem MgF2 und Hyxdroxylapatit zu PCL wurde ein bioaktives Material geschaffen, das nachweislich die osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen und die Mineralisierung von neuem Knochengewebe unterstützte. Damit stellt es ein vielversprechendes Komposit für die Regeneration von Knochengewebe und weitere Anwendungen dar. / Inspired by natural interface proteins in bone, bifunctional bioconjugates were exploited for different interface stabilization applications. The interfaces of nanoparticles both in solution and in polymeric composites were stabilized by combinatorially selected, material specific peptide-polymer conjugates. Peptide sequences showing affinity to MgF2 particle surfaces were selected from a phage display library and translated into a MgF2-binding peptide-block-poly(ethylene glycol) conjugate (MBC). The MBC combined the material-affine binding of the monodisperse peptide domain with an additional function of a synthetic polymer block. Detailed studies of the binding properties of MBC and congeneric conjugates with other peptide architectures or different polymer block lengths, as well as varied incubation conditions revealed the potential of the sequence-specific MBC to stabilize MgF2 nanoparticles in solution. The conjugate inhibited the agglomeration of the particles. In contrast to established stabilizers, it enabled fully redispersable nanoparticles even after complete drying. The stabilization approach in solution was expanded to the compatibilization of the particles in polycaprolactone (PCL) composites. Inspired by the structure of highly specific interface proteins, MBC optimized the material properties of biodegradable PCL/MgF2 composites. Additionally, the interface stabilization simultaneously increased both the stiffness and the toughness of the composites up to the range of natural bone. The addition of hydroxyapatite alongside MBC-compatibilized MgF2 to PCL created a bioactive material that showed enhanced osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and the mineralization of new bone tissue. Therefore, a mechanically reinforced, osteoinductive material was prepared showing high potential in extensive in vitro studies for biomedical applications such as guided bone regeneration, yet not limited to that.

In der vorliegenden Arbeit wird eine modulare Reaktionssequenz von zwei aufeinanderfolgenden chemoselektiven Umwandlungen vorgestellt: Es wird gezeigt, dass Vinyl- und Ethynylphosphonamidate chemoselektiv mit Cysteinen von Proteinen und Antikörpern reagieren. Weiterhin wird gezeigt, dass elektrophile Phosphonamidate durch eine vorhergehende chemoselektive Staudinger-Phosphonit Reaktion zwischen Aziden und ungesättigten Phosphoniten in das gewünschte Molekül eingebaut werden können. Hierbei wird ein elektronenreiches Phosphonit in ein elektronenarmes Phosphonamidat umgewandelt, welches somit für die nachfolgende Thiol-Addition aktiviert wird. Die beschriebene Methode erweitert das bestehende Repertoire von Biokonjugationen durch die Einführung eines neuen Konzepts: Eine chemoleselektive Reaktion, die Reaktivität für eine nachfolgende Biokonjugation induziert. Da Phosphonamidat-Konjugationen an Cysteine herausragende Eigenschaften, wie hohe Selektivität für Cysteine, saubere Reaktionsprodukte und eine hervorragende Stabilität mitbringen, wird im zweiten Teil beschrieben wie Phosphonamidate für die Anbindung von zytotoxischen Wirkstoffen an tumor-bindende Antikörper genutzt werden können um Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) herzustellen. Ein einfaches Syntheseprotokoll für die Herstellung, ausgehend von einem nicht gentechnisch veränderten Antikörper mit nur geringen Überschüssen des Wirkstoffs wird vorgestellt. Phosphonamidat-verbundene ADCs zeigen im direkten Vergleichen zum zugelassenen, Maleimid-verbundenen Adcetris überlegende Eigenschaften, wie eine erhöhte Stabilität in Serum und eine erhöhte in vivo Wirksamkeit in einem Tumor Mausmodel. Zusammenfassend verbindet die hier vorgestellte Methode einen einfachen synthetischen Zugang mit hoher Selektivität, überragender Konjugat-Stabilität und der Möglichkeit hochwirksame Wirkstoffkonjugate herzustellen und wird daher aller Voraussicht nach einen großen Beitrag zum Gebiet der zielgerichteten Therapie leisten. / The present work introduces a modular reaction sequence of two chemoselective manipulations in a row. It is shown that vinyl- and ethynylphosphonamidates react selectively with cysteine residues on proteins and antibodies. Most importantly, those electrophilic phosphonamidates can be incorporated into a given molecule in another preceding chemoselective Staudinger-phosphonite reaction (SPhR) from unsaturated phosphonites and azides. During this reaction, an electron-rich phosphonite is transformed into an electron-deficient phosphonamidate that is thereby activated for the subsequent thiol addition. The described technique thereby extends the existing repertoire of bioconjugations by introducing a new concept in protein synthesis: A chemoselective reaction that induces reactivity for a subsequent bioconjugation. Since phosphonamidate conjugations to cysteine hold outstanding features such as high selectivity for cysteine, clean reaction products and excellent stability of the protein adducts in biological environments, it is described in the second part of the present work how ethynylphosphonamidates can be employed for the conjunction of tumor-sensing antibodies and cytotoxic drugs to generate Antibody-Drug-Conjugates (ADCs). A simple synthetic protocol starting from unengineered antibodies, using only a slight excess of the desired drug in a one-pot synthesis protocol is introduced. In a direct comparison to the maleimide containing FDA-approved Adcetris, phosphonamidate linked ADCs show a superior behaviour in terms of linkage stability in serum, combined with an increased in vivo efficacy in a tumor xenograft mouse model. Taken together, the method described herein combines simple synthetic access with high selectivity, superior conjugate stability and the possibility to synthesize highly efficacious drug conjugates and is therefore likely to have a great contribution to the field of targeted therapeutics.