Abstract Small-scale cultivation methods are a necessity for the development of new biotechnological processes. The most common method for submerged microbial cultivation is a shake flask used with a batch operation protocol. Well plate cultivation formats have also increased their importance, due to the need to utilize high-throughput cultivations for efficient product development. However, batch cultivation is often not the optimal method for obtaining high cell densities and good product quality, due to unlimited microbial growth. The aim of this dissertation was to improve small-scale microbial cultivations for microbial growth and product formation. Hydrolytic enzymes were utilized to relieve nutrient limitation by hydrolysis of proteins in lactic acid bacteria cultures to improve lactic acid production from dairy side products. Hydrolytic enzymes were also utilized in the enzymatic release of glucose from starch to create a fed-batch-like cultivation system applicable on small scale. The wireless sensor system developed was applied in shake flask cultivations to monitor oxygen and pH levels. Enzymatic polymer processing was applicable for small-scale cultivations. Lactic acid production by Lactobacillus salivarius ssp. salicinius was enhanced four-fold when the proteins were hydrolyzed either by proteases or by proteolytic microbes. The fed-batch-mimicking controlled glucose feeding and growth control were obtained by means of the simultaneous enzymatic hydrolysis of starch-polymer during cultivation. Controlled growth, higher cell densities, decreased side product formation and increased amount of soluble protein product were obtained in Escherichia coli cultivations. When this method was applied to the cultivation and recombinant protein production of the methylotrophic yeast Pichia pastoris, higher cell densities and higher amounts of active protein were obtained. The glucose concentration remained low enough to avoid the substrate repression of the alcohol oxidase promoter. The fed-batch method is suitable for high-throughput cultivations since the method can be utilized in well plate formats without external feeding devices. The method can be utilized in the development of new biotechnological products, especially when the production system is sensitive to growth conditions, and growth control is preferred. / Tiivistelmä Pienen mittakaavan mikrobikasvatusmenetelmiä tarvitaan kehitettäessä uusia bioteknologisia prosesseja. Tavallisin menetelmä mikrobien liuoksessa tapahtuvaan kasvatukseen on panostyyppisesti tehtävä sekoituspullokasvatus. Kuoppalevykasvatukset ovat myös tulleet entistä tärkeämmiksi, koska tuotekehityksen tehostamiseksi on tarvetta käyttää high-throughput-menetelmiä. Tavoiteltaessa korkeita mikrobisolutiheyksiä ja tuotteen hyvää laatua, panostyyppinen kasvatus ei ole usein paras vaihtoehto, johtuen mikrobien rajoittamattomasta kasvusta. Tämän työn tarkoituksena oli parantaa mikrobien kasvua ja tuotteen muodostusta pienen mittakaavan kasvatuksissa. Meijeriteollisuuden sivutuotteiden proteiineja pilkottiin entsyymien avulla, jotta maitohappobakteerit pystyivät hyödyntämään proteiinit tehokkaammin ja tuottamaan enemmän maitohappoa. Hydrolyyttisiä entsyymejä hyödynnettiin myös glukoosin vapauttamiseen tärkkelyksestä, jolloin saatiin luotua pieneen mittakaavaan sopiva panossyöttötyyppinen kasvatusmenetelmä. Työn aikana kehitettyä langatonta mittausjärjestelmää hyödynnettiin sekoituspullokasvatuksissa happipitoisuuden ja pH:n seurantaan. Entsymaattinen polymeerien käsittely oli soveltuva menetelmä pienen mittakaavan kasvatuksiin. Maitohapon tuotto Lactobacillus salivarius ssp. salicinius -mikrobilla nelinkertaistui, kun ravinneproteiinit pilkottiin joko proteaasien tai proteolyyttisten mikrobien avulla. Panossyöttömenetelmää muistuttava hallittu glukoosin syöttö ja mikrobin kasvun hallinta saavutettiin pilkkomalla tärkkelystä glukoosiksi kasvatuksen aikana. Escherichia coli kasvatuksissa saavutettiin hallittu solumäärän kasvu, korkeammat solutiheydet, vähentynyt sivutuotteiden muodostus ja suurempi liukoisen tuoteproteiinin määrä. Tätä menetelmää sovellettiin myös vierasproteiinin tuottoon metylotrofisella Pichia pastoris -hiivalla, jolloin saavutettiin korkeammat solutiheydet ja suurempi aktiivisen tuoteproteiinin määrä. Glukoosin määrä kasvatusliuoksessa pysyi riittävän alhaisena, jotta se ei repressoinut hiivan alkoholioksidaasi-promoottoria. Panossyöttömenetelmä on sopiva high-throughput-mikrobikasvatuksiin, koska sitä voidaan käyttää kuoppalevyillä ilman syöttölaitteita. Menetelmää voidaan hyödyntää uusien bioteknisten tuotteiden kehittämisessä erityisesti silloin, kun tuottoisäntä on herkkä kasvuolosuhteiden suhteen ja mikrobin kasvua halutaan hallita.

Abstract Efficient production of biologically functional recombinant proteins is a cornerstone of modern biotechnological research. Laboratory-scale protein production is most commonly accomplished in simple shaking bioreactors such as shake flasks. However, productivity of these cultures is often severely limited by low biomass yield and non-optimal growth conditions regarding medium composition, pH and oxygen supply. In many cases, poor culture performance can constitute a major research bottleneck. This study aims to improve recombinant protein production in shaking Escherichia coli cultures by use of enzyme-controlled, fed-batch-like glucose feeding in a rich medium, and by investigating the effects of culture aeration on different aspects of protein production. The results show that the enzymatic fed-batch medium can provide higher cell densities, volumetric protein yields and, in some cases, improved product solubility or activity compared to traditionally used media. While these improvements could be obtained in ordinary shaking vessels, the results also demonstrate that cultivation in shake flasks with elevated aeration capacity can further improve cell density and volumetric productivity in the fed-batch medium. However, enhanced aeration may also have an adverse effect on the expression of certain proteins such as Fab antibody fragments. Maximum volumetric Fab yield was achieved under reduced aeration rates, and lower oxygen availability also contributed to substantially increased accumulation of periplasmically produced Fab fragments into extracellular medium. Hence modification of aeration conditions and medium composition can be used to control periplasmic/extracellular product localization as outlined in this study. Moreover, high aeration was detrimental to expression in a glycerol-based lactose autoinduction medium, but this strict dependency on aeration level could be mitigated and robustness of expression improved by an autoinduction medium based on the enzymatic glucose feeding as the supporting carbon source instead of glycerol. The results of this study can be utilized to improve volumetric productivity, protein solubility and control of product localization in small-scale protein production, as well as to facilitate robust and efficient high-throughput protein expression for such applications as structural and functional characterization. / Tiivistelmä Biologisesti aktiivisten vierasproteiinien tehokas tuottaminen on yksi bioteknologisen tutkimuksen kulmakivistä. Laboratoriomittakaavan proteiinituotto toteutetaan yleisimmin yksinkertaisissa ravistelubioreaktoreissa, kuten ravistelupulloissa. Näiden viljelmien tuottavuutta rajoittaa kuitenkin usein biomassan matala saanto sekä epäoptimaaliset olosuhteet kasvualustan koostumuksen, pH:n ja hapen suhteen. Monissa tapauksissa viljelmän heikko tuottavuus muodostaa tutkimukselle merkittävän pullonkaulan. Tämän tutkimuksen tavoite on parantaa vierasproteiinien tuottoa Escherichia coli –ravisteluviljelmissä hyödyntäen entsymaattisesti kontrolloitua, panossyöttökasvatusta jäljittelevää glukoosisyöttöä rikkaassa kasvualustassa, sekä selvittää ilmastuksen vaikutusta proteiinituoton eri osatekijöihin. Tulosten mukaan glukoosisyöttöön perustuva kasvualusta mahdollistaa korkeamman solutiheyden sekä proteiinituoton verrattuna tavallisimmin käytettyihin kasvualustoihin. Joissain tapauksissa myös proteiinin liukoisuus tai aktiivisuus voi parantua. Vaikka nämä edut pystyttiin saavuttamaan myös tavanomaisissa ravistelupulloissa, voidaan panossyöttökasvualustan solutiheyttä ja tuottoa tilavuutta kohti edelleen lisätä käyttämällä korkeamman ilmastustehokkuuden ravistelupulloja. Toisaalta tehostetun ilmastuksen havaittiin olevan mahdollisesti haitallista tiettyjen proteiinien, kuten Fab-vasta-ainefragmenttien, tuotolle. Fab-fragmenttien maksimaalinen tuotto saavutettiin ilmastustehokkuutta laskemalla. Lisäksi matalampi hapen saatavuus edisti periplasmaan ohjattujen Fab-fragmenttien kerääntymistä solunulkoiseen kasvualustaan. Näin ollen ilmastusolosuhteita ja kasvualustan koostumusta muokkaamalla voidaan vaikuttaa tuotteen lopulliseen sijoittumiseen. Korkean ilmastustehokkuuden havaittiin myös olevan haitallista proteiinituotolle glyserolipohjaisessa autoinduktiokasvualustassa. Tätä riippuvuutta ilmastuksen tasosta pystyttiin vähentämään ja autoinduktion luotettavuutta parantamaan käyttämällä kasvualustaa jossa hiililähteenä toimii glyserolin sijaan entsymaattinen glukoosisyöttö. Tutkimuksen tuloksia hyödyntäen voidaan parantaa vierasproteiinien saantoa, liukoisuutta ja periplasmisen/solunulkoisen kerääntymisen säätelyä, sekä mahdollistaa luotettava ja tehokas proteiinituotto viljelmien suurta lukumäärää vaativiin sovelluksiin, kuten proteiinien rakenteen ja toiminnan tutkimukseen.