La pause transcriptionnelle marquée par les ARN polymérases (RNAP) est un mécanisme clé pour réguler l'expression des gènes dans tous les règnes de la vie et est une condition préalable à la terminaison de la transcription. Le facteur de transcription bactérien essentiel NusA stimule à la fois la pause et la terminaison de la transcription, jouant ainsi un rôle central. Ici, je présente des reconstructions par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à une seule particule de NusA lié à des complexes d'élongation en présence et en absence d’ARN en épingle à cheveux dans le canal de sortie de l'ARN. Les structures révèlent quatre interactions entre NusA et RNAP qui suggèrent comment NusA stimule le repliement de l’ARN, la pause et la terminaison de la transcription. Un intermédiaire de translocation asymétrique de l'ARN et de l'ADN convertit le site actif de l'enzyme en un état inactif, fournissant une explication structurelle pour l'inhibition de la catalyse. La comparaison de RNAP à différentes étapes de la mise en pause donne un aperçu de la nature dynamique du processus et du rôle de NusA en tant que facteur de régulation. / Transcriptional pausing by RNA polymerases (RNAPs) is a key mechanism to regulate gene expression in all kingdoms of life and is a prerequisite for transcription termination. The essential bacterial transcription factor NusA stimulates both pausing and termination of transcription, thus playing a central role. Here, I present single-particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) reconstructions of NusA bound to paused elongation complexes with and without a pause-enhancing hairpin in the RNA exit channel. The structures reveal four interactions between NusA and RNAP that suggest how NusA stimulates RNA folding, pausing, and termination. An asymmetric translocation intermediate of RNA and DNA converts the active site of the enzyme into an inactive state, providing a structural explanation for the inhibition of catalysis. Comparing RNAP at different stages of pausing provides insights on the dynamic nature of the process and the role of NusA as a regulatory factor.

Pour mon travail de thèse Doctorat j'ai rejoint l'hôpital Saint Louis à Paris sous la direction scientifique Dr. Fabien Calvo. L'objectif principal de mon travail de doctorat Es Science était de développer des modèles cellulaires de cancer du sein humain afin d'étudier les effets d'agents anticancéreux. En parallèle, j'ai étudié l'expression des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) dans les cellules d'adénocarcinome mammaire humain ainsi que leur modulation par l'IFN-g. J'ai montré que l'induction de l'expression des antigènes du CMH était associée à la résistance à la lyse par les cellules NK et cellules LAK et à l'augmentation de la susceptibilité à la lyse mediée par l'anticorps (Antibody Dependent Cytotoxicity ADCC). Ces travaux ont fait l'objet de plusieurs publications dans des journaux avec comité de sélection (Jabrane-Ferrat 1-6 et de thèse de Doctorat de l'Université Scientifique et Médicale de Grenoble en Juin 1988).<br />Lors de mon travail post-doctoral à l'université de Californie San Francisco, j'ai travaillé sur les aspects moléculaires de la régulation de l'expression des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII).<br />Dans une première phase nous avons définit les aspects structuraux des gènes CMHII et leur niveau de méthylation et du compactage de la chromatine. Nous avons montré que MDBP forme un complexe avec la boîte X du DRA et que le complexe MDBP qui est équivalent à l'activité EF-C (protéine qui se lie sur la séquence enhancer du virus du polyome), EP (protéine qui se lie sur la séquence enhancer de l'hépatite B) et MIF (une séquence intronique de c-myc) contient RFX-1 (Zhang, Jabrane-Ferrat et al. 1993).<br />Ensuite, j'ai montré que la boîte pyrimidine tract contenait une séquence GGAAG présente dans les séquences consensus reconnues par la famille de protéines de l'oncogène Ets-1. Ainsi, j'ai démontré le rôle de l'oncogène Ets-1 dans l'expression d'un taux élevé des gènes du CMH II dans les cellules B et les cellules dendritiques. Ce travail a été publié dans MCB (Jabrane-Ferrat et al. 1994).<br />En plus de la séquence TATA, le promoteur HLA-DRA possède une séquence Octamer qui fixe les facteurs Oct1 (expression ubiquitaire) et Oct2 (expression spécifique aux cellules B). Les mutations du site TATA ne semblent pas affecter l'expression du promoteur, alors que toutes mutations du site octamer réduisent l'expression du promoteur. Nous avons substitué la séquence Octamer-TATA par la boîteTATA de l'adénovirus E1b et montré que cette mutation par substitution enlève la dépendance du site octamer. Nous avons également montré que la boîteTATA de E1b fixe le facteur TBP, tandis que celle du promoteur DRA ne le fixe pas. Cela nous a permis de conclure qu'au niveau du promoteur HLA-DRA, la boîteTATA n'est pas fonctionnelle et que la séquence Octamer joue un rôle dans le recrutement du TBP à la machinerie de transcription basale (TBP, Pol II et TAFs) (Voliva, Jabrane-Ferrat and Peterlin 1995).<br />Après clonage du facteur OCA-B, activateur spécifique des cellules B qui interagit de façon équivalente avec les protéines Oct-1 et Oct-2 liée au site octamer, nous avons décrit la première interaction entre deux co-activateurs tissu-spécifiques: CIITA et OCA-B. Nous avons montré que le CIITA et OCA-B interagissent directement et agissent de facon synergique au niveau du promoteur HLA-DRA. Nos résultats suggèrent qu'au niveau des promoteurs de classe II le CIITA permet de recruter un second activateur OCA-B ceci permet d'exposer deux surfaces d'activation pour une interaction avec les TAFs (TBP associated factors [12]) et la machinerie de transcription de base. Ou encore que OCA-B via son interaction avec TBP et d'autres TAFs créerait un complexe qui fixerait le CIITA avec une plus grande affinité et activerait la transcription avec une plus grande éfficacité. La formation d'un complexe multiprotéique entre les protéines régulatrices et le complexe de préinitiation serait responsable de l'expression des gènes de classe II et probablement d'autres gènes impliqués dans la réponse immunitaire. L'absence de l'expression d'OCA-B dans les cellules traitées par l'IFN-g pourrait-être responsable en partie du faible niveau d'expression des gènes de classe II dans les cellules présentatrices d'antigènes et dans les cellules somatiques (Fontes, Jabrane-Ferrat et al. 1996).<br />Des observations préliminaires nous ont permis de postuler que la boîte S est une duplication ancestrale de la boîteX. Dont le but de confirmer ce postulat, j'ai montré que la délétion de la boîte S est nécessaire à l'expression du promoteur DRA dans les cellules B et que les promoteurs du CMHII sont soumis à des contraintes spaciales très rigides. L'espace entre les boîtes S et X ne peut pas être modifié. De plus nous travaux nous permis de suggérer que non seulement les séquences X et S fixent la même protéine mais en plus il existe des interactions entre les protéines se fixant au niveau de la boîte X et au niveau de de la boîte S (Jabrane-Ferrat et al. 1996).<br />Pour confirmer que le rôle de la boîte S in vivo et déterminer son importance dans la régulation de l'expression des gènes CMHII, nous avons montré que RFX1 peut lier la séquence X en l'absence des autres séquences promotrices. La présence de la boîte Y permet de favoriser et d'augmenter la fixation de RFX5 par rapport à celle de RFX1. La boîte S quand à elle, elle augmente la fixation de RFX1 et de RFX5. Nos résultats ont suggéré que les boîtes S et Y permettent de sélectionner spécifiquement RFX5 (Fontes, Jabrane-Ferrat et al. 1996 et 1997). <br />L'ensemble des travaux résumés ici sont repris en détail dans ce mémoire d'habilitation à diriger des recherches.<br /><br /><br /><br /><br /><br /> <br /><br /><br />EXPOSE DES TRAVAUX DE RECHERCHE<br /><br />I. INTRODUCTION<br /><br />Les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII) ainsi que ceux nécessaires à la dégradation et à la présentation de l'antigène sont régulés de manière coordonnée dans les cellules. Leurs promoteurs contiennent des séquences régulatrices en cis (CUS) qui lient les complexes protéiques composés du facteur régulateur X (RFX) et le facteur nucléaire Y (NFY) (Reith et al. 2000, revue). Ces facteurs sont non seulement recrutés au niveau du promoteur de manière coopérative mais ils forment également une plateforme capable de recruter le trans-activateur du CMHII (CIITA). Le recrutement de CIITA permet ainsi l'initiation et l'élongation de la transcription des gènes du CMHII localisés sur le bras court du chromosome 6 (Fontes et al. 1999, Kanazawa et al. 2000). Notre compréhension, de ce système de régulation, a été favorisée par des analyses génétiques et biochimiques du syndrome du lymphocyte nu (BLS) (Gricelli et al. 1989, Lisowska-Gropierre et al. 1994) dont les patients ont été répértoriés en différents groupes de complémentation. Les mutations responsables de cette immunodéficience, ont été identifiées pour quatres groupes de complémentation et affectent les trois sous-unités de RFX (Steimle et al. 1995, Masternak et al. 1998, Nagarajan et al. 1999) ainsi que le CIITA (Steimle et al. 1993). Dans le dernier groupe (5eme) de BLS, seuls les promoteurs en direction du télomère sont transcrits et par conséquent ils se traduisent par l'absence d'expression de certains isotypes du CMHII. La transcription des gènes impliqués dans la dégradation et la présentation de l'antigène par les déterminants du CMHII est une nécessite absolue pour une immunité adaptative. L'équipe que je souhaite créer aura pour but de pousuivre la dissection des mécanismes moléculaires qui permettent les interactions ADN-protéines et protéine-protéine au niveau du promoteur, leurs fonctions, la régulation du CIITA et sa capacité à coordonner différentes activités de l'ARN polymerase II (ARNPII), recréer ce complexe de régulation dans un système de transcription in vitro. Notre but à long terme est d'utiliser les connaissances que nous allons acquérir pour l'obtention d'un vaccin anti-tumoral.