Paderborn, Universiẗat, Diss., 2003.

Zugl.: München, Techn. Universiẗat, Diss., 2009.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2001. / Computerdatei im Fernzugriff.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2001. / Computerdatei im Fernzugriff.

Zugl.: Dresden, Techn. Universiẗat, Diss., 2005.

Notre projet s'inscrit dans le cadre de la lutte contre la résistance bactérienne et considère une approche radicalement opposée à tout ce qui a été fait jusqu'à présent dans le but de créer de nouveaux antibiotiques. En nous basant sur l'hypothèse qu'il existe d'autres façons pour obtenir un composé réactif que d'inclure le noyau beta-lactame dans une structure bicyclique très tendue (ou de l'activer par des effets électrocapteurs), nous avons imaginé une famille de molécules où l'adaptabilité conformationnelle pourrait être à l'origine de l'activité antibiotique. Il s'agit de beta–lactames bicycliques pontés obtenus au départ de l'acétoxy-azétidin-2-one commerciale, où les positions N1 et C3 sont connectées par des cycles de tailles variables (à partir de n et m = 1), incluant éventuellement des fonctions "activantes" de type carbonyle et/ou une double liaison C=C. La stratégie choisie fait intervenir la métathèse des oléfines (RCM) pour la formation du cycle pontant. Nos dérivés ont fait l'objet d'évaluations théoriques grâce à des modèles d'hydrolyses chimique et enzymatique, et expérimentales grâce à des suivis RMN-1H de l'hydrolyse en milieu basique et à des tests in vitro sur enzymes bactériennes et mammaliennes.

Universiẗat, Diss., 1998--Bremen.

Cet ouvrage porte sur la conception, la synthèse et la caractérisation de sphères supramoléculaires auto-assemblées. Si le groupe Dory a, par le passé, été en mesure d’effectuer la synthèse d’un type de sphères avec 4 unités monomères, le but de cette recherche a été de développer des monomères qui tendraient vers des sphères à 8 unités voire même 20. Suite à de nombreuses idées, nous avons orienté notre recherche davantage sur un type de monomère afin de pouvoir le synthétiser en quantité suffisamment importante pour pouvoir le caractériser. Une idée aussi novatrice a nécessité plusieurs mois de travail pour parvenir à un produit satisfaisant et suffisamment pur pour commencer la caractérisation.

Metallo-beta-lactamases (MBLs) are members of the metallohydrolases family and constitute a very effective resistance mechanism employed by bacteria to escape the action of most beta-lactam antibiotics. Emergence of acquired MBLs among pathogenic species represents a major clinical threat, especially since no efficient inhibitors are available. On the basis of their primary structures, these enzymes have been subdivided in three subclasses (B1, B2 and B3). The enzyme studied in this work, termed BcII, is produced by Bacillus cereus, strain 569/H/9, and is the most studied MBL so far (class B1 ; 227 a.a. ; M.W. 24960 Da). It displays a binuclear active site centre, which can bind various metal ions (e.g. Co2+ and Cd2+), although Zn2+ is the natural cofactor used for beta-lactams hydrolysis. The first part of this work was dedicated to the characterization of the equilibrium folding properties of both the apo and holo forms of BcII. We used a variety of biophysical techniques, including absorbance, circular dichroism and intrinsic fluorescence spectroscopy, nuclear magnetic resonance (NMR), and mass spectrometry (MS). Interestingly, optical measurements revealed that although the apo and dizinc species exhibit undistinguishable tertiary structural organizations, the metal-depleted enzyme shows a significant decrease in its α-helical content, presumably associated with enhanced flexibility. The holoenzyme was found to be much more stable than the zinc-depleted form. Whereas the latter unfold according to a simple two-state mechanism, unfolding of the holoenzyme was found to be non-cooperative, with the population of intermediate species showing 3D structures very similar to the native species. Besides folding studies, we investigated the process of metal binding to BcII. Zinc binding was monitored using complementary techniques, including circular dichroism in the far UV, enzymatic activity measurements, competition with a chromophoric chelator, MS and NMR. Most noticeably, MS and NMR experiments, together with catalytic activity measurements demonstrated that two zinc ions bind cooperatively to the enzyme active site (with K1/K2 ≥ 5, indicating positive cooperativity) and hence that catalysis is associated with the dizinc enzyme species only. Furthermore, competitive experiments with the chromophoric chelator Mag-Fura-2 indicated K2 < 80 nM.

L'étape finale de biosynthèse du peptidoglycane est catalysée par les D,D-transpeptidases (PBPs), l'une des cibles principales des antibiotiques de type beta-lactame. Récemment, il a été montré qu'une nouvelle classe d'enzymes, les L,D-transpeptidases (LDts), permet de contourner l'inhibition des PBPs. Ces LDts ont été identifiées tant dans des bactéries résistantes aux beta-lactames que dans des formes dormantes de Mycobacterium tuberculosis. Les seuls beta-lactames capables de les inhiber, les carbapénèmes, forment une liaison covalente avec la cystéine catalytique des LDts. Ni le mécanisme de cette inactivation, ni la spécificité de ces enzymes pour les carbapénèmes ne sont toutefois expliqués à ce jour. Le but du présent travail consiste en l'investigation par RMN du mécanisme d'acylation des LDts par ces antibiotiques. Dans ce contexte, la première partie de cette thèse s'intéresse à la compréhension actuelle de l'émergence de ce phénomène de résistance. La seconde partie traite des principes de la RMN et des implémentations développées pour étudier la structure, la thermodynamique et la dynamique des LDts. La troisième et dernière partie démontre le succès de l'approche RMN dans l'étude des diverses étapes de la réaction d'acylation, à travers une étude détaillée de l'apoenzyme, de complexes non covalents avec différents beta-lactames, et de l'enzyme acylée par un carbapénème. Au cours de cette étude, la structure du site actif de l'apoenzyme de Bacillus subtilis a été affinée par rapport à une étude cristallographique antérieure. Pour cette enzyme et son pendant chez Enterococcus faecium, nous avons démontré que la spécificité pour les carbapénèmes n'intervient pas au stade de la formation du complexe non covalent. Pour finir, la formation de la liaison covalente entre LDt et carbapénème induit un réarrangement conformationnel substantiel et une augmentation de la flexibilité de l'enzyme. / The final cross-linking step of the peptidoglycan synthesis is usually catalyzed by D,D-transpeptidases (PBPs), one of the main targets of beta-lactam antibiotics. Recently, it was shown that these PBPs can be by-passed by a novel class of enzymes, the L,D-transpeptidases (LDts), identified in beta-lactam-resistant bacteria as well as in dormant forms of Mycobacterium tuberculosis. The only beta-lactams enable to inactivate these enzymes belong to the carbapenem class. The beta-lactam ring of this antibiotic family then covalently binds the catalytic cysteine of the LDt. Neither the mechanism of this reaction nor the specificity for carbapenems are yet understood. The aim of the present work is to investigate the acylation mechanism of LDts with carbapenems by NMR. In this context, the first part of this thesis focuses on the current biological understanding of the emergence of this resistance pathway. The second part deals with the NMR principles and the implementations developed to study the structure, thermodynamics and dynamics of LDts. The third part demonstrates that NMR is successful in studying all the steps of the acylation reaction. For this purpose, the LDt apoenzyme, the non-covalent complex with various beta-lactams, and the LDt-carbapenem acylenzyme were thoroughly investigated. The structure of the active site of the Bacillus subtilis apoenzyme was refined with respect to a previous crystallographic study. For the latter and the Enterococcus faecium enzymes, we showed that the carbapenem specificity does not occur at the stage of the non-covalent binding. In contrast to non-covalent interactions, the formation of the covalent bond between LDts and carbapenems induces substantial conformational rearrangement and increased flexibility in the enzyme.