Trotz einer Vielzahl neuer Therapieansätze in den letzten Jahren, die ein längeres Überleben der Patienten ermöglichen, stellt das multiple Myelom weiterhin eine unheilbare Krankheit dar. Der Großteil der Patienten entwickelt letztlich ein rezidiviertes oder refraktäres multiples Myelom (RRMM). Bei Erstdiagnose und bei RRMM sind immunmodulierende Medikamente (IMiDs), wie Lenalidomid, eine bedeutende Therapieoption. Durch die Bindung von Lenalidomid an den CRL4CRBN Ligase Komplex entwickelt dieser eine modifizierte Substratspezifität: die Transkriptionsfaktoren IKZF1 (Ikaros) und IKZF3 (Aiolos) werden ubiquitinyliert und proteasomal abgebaut. Von Krönke et al. (2014) wurde eine 30 Aminosäuren lange Sequenz (Degron) am N-Terminus von IKZF1/3 definiert, die essenziell für die Lenalidomid-Sensitivität ist. Durch Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien wurde ein signifikanter Anstieg der Mutationsfrequenz unter Therapie verzeichnet und vier Missense-Mutationen in IKZF1 und eine in IKZF3 bei Patienten mit RRMM identifiziert. Die Mutationen IKZF1-A152T und IKZF3-G159R sind innerhalb der Degron-Sequenz lokalisiert, IKZF1-E170D liegt unmittelbar daneben und IKZF1-Y413C bzw. IKZF1-R439H befinden sich am C-Terminus des Proteins. Für diese mutierten IKZF-Proteine wurden im Rahmen dieser Arbeit Expressionsvektoren kloniert und stabil in humane Myelomzelllinien transfiziert. Durch Western Analysen und funktionelle Assays der Zellviabilität (alamarBlue) bzw. des Zelltods (Annexin V-PI) wurden diese polyklonalen Sublinien bezüglich ihrer Implikationen für die Lenalidomid-Sensibilität untersucht. Nur die IKZF1-Mutationen A152T und E170D führten zu einer verminderten, bei A152T geradezu aufgehobenen, Degradierung von Ikaros nach Lenalidomid-Behandlung. In den funktionellen Analysen führte A152T ebenfalls zu stark verminderter Lenalidomid-Aktivität und zu deutlich höherem Überleben. Obwohl Sleeping Beauty Vektoren mit unterschiedlichen Expressionskassetten für Aiolos eingesetzt wurden, war keine eindeutige Überexpression von IKZF3 feststellbar, daher sind diese Ergebnisse nur eingeschränkt zu verwerten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in vivo bei Patienten aufgetretene und in vitro analysierte Mutationen, gezeigt an der in der Degron-Sequenz lokalisierten Mutation IKZF1-A152T, im Zellmodell eine Resistenz vermitteln und damit Einfluss auf mögliche Therapieresistenzen haben können. / Numerous therapeutic approaches were developed in recent years and have made a longer survival of patients possible. Nevertheless, multiple myeloma still is an incurable disease, and most patients progress to relapsed and refractory multiple myeloma (RRMM). Immunomodulatory drugs (IMiDs) such as lenalidomide are an important therapeutic option in the treatment of RRMM and newly diagnosed multiple myeloma. Lenalidomide binds to the CRL4CRBN ubiquitin ligase complex and modifies its substrate specificity. As a result, ubiquitination and degradation of the neo-substrates IKZF1 (Ikaros) and IKZF3 (Aiolos), both transcription factors, is induced. Krönke et al. (2014) defined a 30 amino acid sequence (termed degron) at the N-terminal end of IKZF1/3 that is essential for lenalidomide sensitivity. A significant increase in the mutation frequency during therapy was shown through next-generation sequencing (NGS) diagnostics and four missense mutations in IKZF1 and one in IKZF3 in patients with RRMM were identified. The mutations IKZF1-A152T and IKZF3-G159R are located within the degron sequence described by Krönke, IKZF1-E170D lies close to the border of this region and the position of IKZF1-Y413C and IKZF1-R439H is C-terminal. In this thesis, expression vectors were cloned for these mutated IKZF proteins and then stably transfected in human myeloma cell lines. The implications of these identified mutations for their sensitivity to lenalidomide were examined using Western blotting and functional assays: alamarBlue (cell viability assay) and Annexin V-PI (cell death assay). Only the IKZF1 mutations A152T and E170D led to a reduced, for A152T even abrogated, degradation of Ikaros following lenalidomide-incubation. In the functional analyses A152T also strongly diminished lenalidomide activity and caused a considerably higher survival in this subline. Although Sleeping Beauty vectors with different expression cassettes for IKZF3 were used, no distinct overexpression of Aiolos was achieved, and the results obtained for IKZF3 are therefore of limited interpretability. In summary, it was shown that mutations that occurred in patients, namely IKZF1-A152T located within the degron sequence, can confer resistance to lenalidomide-treatment in cell models and implications for therapy resistances are possible.

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Hintergrund: Während die Monotherapie mit Lenalidomid (Revlimid®) bei der Behandlung von rezidivierten/refraktären Patienten mit Multiplem Myelom (MM) bewährt ist, werden Kombinationstherapien mit Lenalidomid immer noch untersucht. In der vorliegenden Dosisfindungsstudie wurde eine Kombinationstherapie bestehend aus Lenalinomid, Bendamustin und Prednisolon (RBP) an Patienten mit fortgeschrittenem MM getestet. Methoden: Die erste Patientenkontrollgruppe erhielt eine Anfangsdosis Lenalidomid von 10 mg/d d1-21, Bendamustin von 60 mg/m²/d d1-2 und Prednisolon von 100 mg/d d1-4. Weitere Patientengruppen (jeweils 3-6 Personen) erhielten in Stufen eine steigende Lenalidomid-Dosis von 15, 20 sowie 25 mg und nach Erreichen von 25 mg Lenalidomid eine ansteigende Dosis Bendamustin von zunächst 60 mg/m² und dann 75 mg/m². Ergebnisse: 21 Patienten (jeweils 3 in den ersten drei Dosierungsstufen und jeweils 6 in den beiden letzten Dosierungsstufen) wurden in dieser Phase-I-Studie eingeschlossen. Alle Patienten erhielten mindestens 2 Zyklen der Therapie. Zwei Patienten entwickelten eine dosislimitierende Hämatotoxizität, ein Patient bei 25 mg/d Lenalidomid in Kombination mit 60 mg/m² Bendamustin und ein Patient in der höchsten Dosierungsstufe (25 mg/d Lenalidomid in Kombination mit 75 mg/m² Bendamustin). Die maximal tolerable Dosis wurde nicht erreicht. 16 Patienten (76%) sprachen nach mindestens zwei Zyklen RBP mit 1 sCR, 1 nCR, 5 VGPR und 9 RP an. Nach einer medianen Beobachtungszeit von 16 Monaten lag das PFS nach 18 Monaten bei 48% und OS bei 64%. Schlussfolgerung: RBP mit einer Dosis von 25 mg Lenalidomid (d 1-21) und 75 mg/m² Bendamustin (d 1-2) ist gut verträglich bei Patienten mit rezidiviertem/refraktärem MM.:Zusammenfassung II Abstract III Inhaltsverzeichnis IV Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis VII Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 1.1 Multiples Myelom 1 1.1.1 Terminologie 1 1.1.2 Epidemiologie 1 1.1.3 Ätiologie 2 1.1.4 Pathogenese 2 1.1.5 Klinik 3 1.1.5.1 Symptome des Skelettsystems 3 1.1.5.2 Anämiesymptome 3 1.1.5.3 Nierenbeteiligung 4 1.1.5.4 Infektionen 4 1.1.6 Diagnostik 5 1.1.6.1 Labordiagnostik 5 1.1.6.1.1 Myelomproteindiagnostik 5 1.1.6.1.2 Blutbild 6 1.1.6.1.3 Nierenwerte 6 1.1.6.1.4 ß2-Mikroglobulin 6 1.1.6.1.5 Knochenmarkdiagnostik 7 1.1.6.1.6 Knochenmarkmorphologie 7 1.1.6.1.7 Durchflusszytometrie 7 1.1.6.1.8 Zytogenetik 7 1.1.6.2 Radiologische Diagnostik 8 1.1.7 Diagnosekriterien, Differentialdiagnose, Klassifikation und Stadieneinteilung 9 1.2 Therapie 12 1.2.1 Konventionelle Chemotherapie 12 1.2.2 Neue Substanzen 13 1.2.2.1 Immunmodulatorische Substanzen 13 1.2.2.1.1 Thalidomid 13 1.2.2.1.2 Lenalidomid 14 1.2.2.1.3 Pomalidomid 14 1.2.2.2 Proteasom-Inhibitoren 15 1.2.2.2.1 Bortezomib 15 1.2.2.2.2 Carfilzomib 15 1.2.2.2.3 Ixazomib 16 1.2.2.3 HDAC-Inhibitoren 16 1.2.2.4 Monoklonale Antikörper 16 1.2.2.4.1 Daratumomab 17 1.2.2.4.2 Elotuzumab 17 1.2.3 Transplantationen 17 1.2.3.1 Autologe Stammzelltransplantation 17 1.2.3.2 Allogene Stammzelltransplantation 18 1.3 Zielstellung der Arbeit 19 2 Material und Methoden 21 2.1 Patienten 21 2.1.1 Einschlusskriterien 21 2.1.2 Ausschlusskriterien 23 2.2 Studiendesign 24 2.3 Behandlungsprotokoll 25 2.4 Definition des Therapieansprechens 26 2.5 Bestimmung der Therapieeffektivität und Toxizität 26 2.6 Statistische Methoden 27 3 Ergebnisse 28 3.1 Patientencharakteristika 28 3.2 Dosiseskalation 30 3.3 Remission und Überleben 31 3.4 Toxizität 34 4 Diskussion 36 Literaturverzeichnis 40 Erklärung über den Anteil an der Promotionsarbeit 51 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 52 Danksagung 53

Myelodysplastic syndrome (MDS) with deletion of the long arm of the chromosome 5 (5q - syndrome, del( 5q)) can be characterized by anemia, macrocytosis, a normal or high platelet count, and hypolobulated megakaryocytes in the bone marrow. 5q - syndrome belongs to low - risk MDS, which means low risk to transform to acute myeloid leukemia. 5q - syndrome is ass ociated with female predominance and older age. Another sign is transfusion burden that is treated by erythropoiesis - stimulating agents (ESA) as erythropoietin (EPO). Moreover, the response of MDS patients is around 30 - 60% with the median of the response b eing ~ 24 months. The second line of treatment is lenalidomide (LEN) which is a derivate of teratogenic analog thalidomide. LEN increases erythropoiesis and inhibits the growth of del(5q) erythroid progenitors in vivo and it does not have a significant effe ct on the growth of normal CD34+ progenitors or cytogenetically normal progenitors in MDS with del(5q) clones. LEN is used as therapy in multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, and lymphoma. LEN is an expensive agent and not every MDS patient re sponds to this therapy. This is a reason why is a need to find a biomarker for the determination of successful treatment. Some multiple myeloma studies showed that cereblon can be the biomarker...