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Inibição in vivo das óxido nítrico sintases: efeitos sobre a expressão de moléculas de adesão e secreção de mediadores inflamatórios / In vivo inhibition of nitric oxide synthases: effects on expressions of adhesion molecules and secretion of inflammatory mediatorsHebeda, Cristina Bichels 17 September 2008 (has links)
Resultados preliminares do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a inibição da síntese de NO por período de tempo prolongado reduz o recrutamento de leucócitos para focos inflamatórios, dependente, pelo menos em parte, da inibição da interação leucócito-endotélio e da expressão de L-selectina. 0 presente trabalho visou complementar os estudos sobre os mecanismos envolvidos nesta ação antiinflamatória. Para tanto, ratos Wistar machos (180 a 220g) receberam L-NAME (20mg/Kg; v.o.; 14 dias) ou água pela mesma via e período de tempo. Foi avaliada a atividade das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) no tecido cerebral por radioimunoensaio; o recrutamento leucocitário para cavidade peritoneal induzido pelo LPS (5mg/kg, 4 horas); as expressões de moléculas de adesão em leucócitos do sangue circulante, no músculo cremaster e nos sinusóides hepáticos por ensaios de citometria de fluxo ou imunohistoquímica; as expressões gênicas de moleculas de adesão, quantificadas por PCR e a secreção/produção de mediadores inflamatórios em leucócitos por ensaios imunoenzimáticos, reacao de Griess ou quimiluminescência. Os resultados obtidos mostraram que: 1) o tratamento com L-NAME reduziu em torno de 90% a atividade das NOS dependentes de Ca+2 em condições basais ou após estimulação in vivo com LPS; 2) as concentrações de NO no plasma e no peritônio inflamado estavam reduzidos em animais tratados com L-NAME (30% vs. controles); 3) a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMN) para o peritônio inflamado estava reduzida em animais tratados com L-NAME (40% vs. controles); 4) as expressões de L-selectina e PECAM-1 em leucócitos circulantes; de PECAM-1 no endotélio do músculo cremaster e de VAP-1 no endotélio dos sinusóides hepáticos e músculo cremaster de animais tratados com L-NAME estavam reduzidas; 5) a redução na expressão de L-selectina foi dependente de inibição de sua síntese; 6) a concentração de IL-10 estava major no soro de animais tratados com L-NAME em relação aos controles; 7) a maior concentração de IL-10 circulante pode refletir a produção desta citocina por leucócitos na circulação, uma vez que a concentração de IL-10 também estava maior no sobrenadante de leucócitos circulantes de animais tratados com L-NAME; 8) concentrações reduzidas de IL-1β e LTB4 foram detectadas nos sobrenadantes de neutrófilos obtidos de animais tratados com L-NAME; 9) macrófagos obtidos de animais tratados com L-NAME produziram maiores concentrações de IL-1β, TNF-α e IL-6, e menores concentrações de IL-10 na ausência de estimulação; na vigência estimulação in vitro com LPS os macrófagos de animais tratados com L-NAME produziram menores concentrações de NO. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho mostram que o tratamento com L-NAME por período prolongado de tempo inibe a atividade das NOS dependentes de Ca+2 e nesta condição reduz as concentrações de NO circulante e no foco da inflamação, além de inibir a migração de leucócitos para o foco inflamatório, confirmando propriedades pro-inflamatórias do NO. Os mecanismos envolvidos na inibição da migração celular parecem compreender a modulação da expressão e/ou síntese das moléculas de adesão constitutivas expressas em leucócitos e no endotélio, além da modulação da secreção de mediadores pró ou antiinflamatórios em leucócitos circulantes e neutrófilos. Por outro lado, os efeitos do tratamento com L-NAME sobre a secreção de mediadores químicos por macrófagos induzem a secreção destes e corroboram a dualidade dos efeitos do NO no processo de recrutamento celular. / Our previous results have demonstrated that in vivo chronic inhibition of nitric oxide synthesis reduces leukocyte recruitment into inflammatory focus, dependent, at least in part, on impaired leukocyte-endothelial interactions and expression of L-selectin. This study aimed to clarify the mechanisms involved in the reduced leukocyte migration observed in L-NAME-treated rats. For this purpose, male Wistar rats (180-220g) were treated with L-NAME (20 mg/kg, oral route, 14 days, dissolved in drinking water); controls animals received water by the same route and period of time. The effectiveness of L-NAME treatment was investigated by examining the activity of nitric oxide synthases (NOS) in the brain tissue using radioimmunoassay. In addition, effects of L-NAME treatment were evaluated in LPS-induced leukocyte recruitment into peritoneal cavity (5mg/kg, 4 hours); expression of adhesion molecules was determined in circulating leukocytes, cremaster muscle and liver sinusoids by flow cytometry and immunohistochemistry assay; gene expressions of adhesion molecules were quantified by PCR and leukocyte secretion of inflammatory mediators was measured by immunoenzimatics assays, Griess reaction or chemiluminescence. Our results show that: 1) L-NAME treatment reduced, around 90%, Ca+2 - dependent NOS activity in the presence or not of in vivo inflammation; 2) concentrations of NO in the plasma and into inflamed peritoneum were reduced in L-NAME-treated animals (30% vs. control animals); 3) migration of PMN leukocytes into inflammed peritoneum was impaired in L-NAME-treated rats (40% vs. control animals); 4) expressions of L-selectin and PECAM-1 in circulating leukocytes, PECAM-1 in endothelium from cremaster muscle and VAP-1 in endothelium from liver sinusoids and cremaster muscle were reduced in L-NAME-treated rats; 5) decrease in L-selectin expression was dependent on inhibition of its synthesis; 6) concentrations of IL-10 was higher in serum from L-NAME-treated rats in comparison to control rats; 7) these higher concentrations of circulating IL-10 can reflect the production of this cytokine by leukocytes from circulation, as IL-10 levels was greater in the supernatant of circulating leukocytes obtained from L-NAME-treated animals; 8) L-NAME treatment disturbed neutrophils ability to secrete IL-1β e LTB4, since these concentrations were lower in the supernatants of neutrophils from L-NAME-treated animals; 9) in absence of stimulation, macrophages obtained from L-NAME-treated rats produced higher concentrations of IL-1β, TNF-α e IL-6, and lower concentrations of IL-10, whereas in presence of in vitro LPS these cells produced lower concentrations of NO. Taken together, our results show that L-NAME treatment administrated for a prolonged period of time inhibits Ca+2 -dependent NOS activity, and in this condition, reduces concentrations of NO in plasma and into inflammatory focus and decreases leukocyte migration to the inflammatory focus thus confirming pro-inflammatory properties of NO. The mechanisms involved in impaired cellular migration seem to involve the modulation of expression and/or synthesis of constitutive adhesion molecules in leukocytes and endothelium, and to interfere in the secretion of pro or anti inflammatory mediators. On the other hand, actions of NO in secreation of chemical mediators by macrophages induces the production of inflammatory mediators and support the duality of NO in the cellular recruitment process.
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Inibição in vivo das óxido nítrico sintases: efeitos sobre a expressão de moléculas de adesão e secreção de mediadores inflamatórios / In vivo inhibition of nitric oxide synthases: effects on expressions of adhesion molecules and secretion of inflammatory mediatorsCristina Bichels Hebeda 17 September 2008 (has links)
Resultados preliminares do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a inibição da síntese de NO por período de tempo prolongado reduz o recrutamento de leucócitos para focos inflamatórios, dependente, pelo menos em parte, da inibição da interação leucócito-endotélio e da expressão de L-selectina. 0 presente trabalho visou complementar os estudos sobre os mecanismos envolvidos nesta ação antiinflamatória. Para tanto, ratos Wistar machos (180 a 220g) receberam L-NAME (20mg/Kg; v.o.; 14 dias) ou água pela mesma via e período de tempo. Foi avaliada a atividade das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) no tecido cerebral por radioimunoensaio; o recrutamento leucocitário para cavidade peritoneal induzido pelo LPS (5mg/kg, 4 horas); as expressões de moléculas de adesão em leucócitos do sangue circulante, no músculo cremaster e nos sinusóides hepáticos por ensaios de citometria de fluxo ou imunohistoquímica; as expressões gênicas de moleculas de adesão, quantificadas por PCR e a secreção/produção de mediadores inflamatórios em leucócitos por ensaios imunoenzimáticos, reacao de Griess ou quimiluminescência. Os resultados obtidos mostraram que: 1) o tratamento com L-NAME reduziu em torno de 90% a atividade das NOS dependentes de Ca+2 em condições basais ou após estimulação in vivo com LPS; 2) as concentrações de NO no plasma e no peritônio inflamado estavam reduzidos em animais tratados com L-NAME (30% vs. controles); 3) a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMN) para o peritônio inflamado estava reduzida em animais tratados com L-NAME (40% vs. controles); 4) as expressões de L-selectina e PECAM-1 em leucócitos circulantes; de PECAM-1 no endotélio do músculo cremaster e de VAP-1 no endotélio dos sinusóides hepáticos e músculo cremaster de animais tratados com L-NAME estavam reduzidas; 5) a redução na expressão de L-selectina foi dependente de inibição de sua síntese; 6) a concentração de IL-10 estava major no soro de animais tratados com L-NAME em relação aos controles; 7) a maior concentração de IL-10 circulante pode refletir a produção desta citocina por leucócitos na circulação, uma vez que a concentração de IL-10 também estava maior no sobrenadante de leucócitos circulantes de animais tratados com L-NAME; 8) concentrações reduzidas de IL-1β e LTB4 foram detectadas nos sobrenadantes de neutrófilos obtidos de animais tratados com L-NAME; 9) macrófagos obtidos de animais tratados com L-NAME produziram maiores concentrações de IL-1β, TNF-α e IL-6, e menores concentrações de IL-10 na ausência de estimulação; na vigência estimulação in vitro com LPS os macrófagos de animais tratados com L-NAME produziram menores concentrações de NO. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho mostram que o tratamento com L-NAME por período prolongado de tempo inibe a atividade das NOS dependentes de Ca+2 e nesta condição reduz as concentrações de NO circulante e no foco da inflamação, além de inibir a migração de leucócitos para o foco inflamatório, confirmando propriedades pro-inflamatórias do NO. Os mecanismos envolvidos na inibição da migração celular parecem compreender a modulação da expressão e/ou síntese das moléculas de adesão constitutivas expressas em leucócitos e no endotélio, além da modulação da secreção de mediadores pró ou antiinflamatórios em leucócitos circulantes e neutrófilos. Por outro lado, os efeitos do tratamento com L-NAME sobre a secreção de mediadores químicos por macrófagos induzem a secreção destes e corroboram a dualidade dos efeitos do NO no processo de recrutamento celular. / Our previous results have demonstrated that in vivo chronic inhibition of nitric oxide synthesis reduces leukocyte recruitment into inflammatory focus, dependent, at least in part, on impaired leukocyte-endothelial interactions and expression of L-selectin. This study aimed to clarify the mechanisms involved in the reduced leukocyte migration observed in L-NAME-treated rats. For this purpose, male Wistar rats (180-220g) were treated with L-NAME (20 mg/kg, oral route, 14 days, dissolved in drinking water); controls animals received water by the same route and period of time. The effectiveness of L-NAME treatment was investigated by examining the activity of nitric oxide synthases (NOS) in the brain tissue using radioimmunoassay. In addition, effects of L-NAME treatment were evaluated in LPS-induced leukocyte recruitment into peritoneal cavity (5mg/kg, 4 hours); expression of adhesion molecules was determined in circulating leukocytes, cremaster muscle and liver sinusoids by flow cytometry and immunohistochemistry assay; gene expressions of adhesion molecules were quantified by PCR and leukocyte secretion of inflammatory mediators was measured by immunoenzimatics assays, Griess reaction or chemiluminescence. Our results show that: 1) L-NAME treatment reduced, around 90%, Ca+2 - dependent NOS activity in the presence or not of in vivo inflammation; 2) concentrations of NO in the plasma and into inflamed peritoneum were reduced in L-NAME-treated animals (30% vs. control animals); 3) migration of PMN leukocytes into inflammed peritoneum was impaired in L-NAME-treated rats (40% vs. control animals); 4) expressions of L-selectin and PECAM-1 in circulating leukocytes, PECAM-1 in endothelium from cremaster muscle and VAP-1 in endothelium from liver sinusoids and cremaster muscle were reduced in L-NAME-treated rats; 5) decrease in L-selectin expression was dependent on inhibition of its synthesis; 6) concentrations of IL-10 was higher in serum from L-NAME-treated rats in comparison to control rats; 7) these higher concentrations of circulating IL-10 can reflect the production of this cytokine by leukocytes from circulation, as IL-10 levels was greater in the supernatant of circulating leukocytes obtained from L-NAME-treated animals; 8) L-NAME treatment disturbed neutrophils ability to secrete IL-1β e LTB4, since these concentrations were lower in the supernatants of neutrophils from L-NAME-treated animals; 9) in absence of stimulation, macrophages obtained from L-NAME-treated rats produced higher concentrations of IL-1β, TNF-α e IL-6, and lower concentrations of IL-10, whereas in presence of in vitro LPS these cells produced lower concentrations of NO. Taken together, our results show that L-NAME treatment administrated for a prolonged period of time inhibits Ca+2 -dependent NOS activity, and in this condition, reduces concentrations of NO in plasma and into inflammatory focus and decreases leukocyte migration to the inflammatory focus thus confirming pro-inflammatory properties of NO. The mechanisms involved in impaired cellular migration seem to involve the modulation of expression and/or synthesis of constitutive adhesion molecules in leukocytes and endothelium, and to interfere in the secretion of pro or anti inflammatory mediators. On the other hand, actions of NO in secreation of chemical mediators by macrophages induces the production of inflammatory mediators and support the duality of NO in the cellular recruitment process.
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