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Resposta imune celular a diferentes antígenos micobacterianos em indivíduos infectados por Mycobacterium tuberculosis: avaliação por elispot, elisa e linfoproliferaçãoTanji, Maury Massani 02 March 2005 (has links)
A tuberculose é uma doença crônica granulomatosa caracterizada por um déficit de imunidade antígeno específica do hospedeiro, cuja resposta imune é ativamente regulada por citocinas. No Brasil há mais de 50 milhões de habitantes infectados pelo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo foi avaliar a linfoproliferação e a produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas por quatro diferentes antígenos do M. tuberculosis, um complexo, o antígeno sonicado, e três purificados, ESAT-6, antígeno 85B e antígeno HBHA, eventuais candidatos à vacina anti-tuberculose. Para avaliação da produção de IFN-g e IL-10 foram utilizados dois métodos: Elispot e Elisa à partir de sobrenadante de cultura de PBMC. Para essas avaliações, os pacientes com tuberculose ativa (TB-A) foram comparados a dois subgrupos de indivíduos controles. O primeiro subgrupo foi constituído por indivíduos saudáveis PPD+ e o segundo por indivíduos curados de um episódio de tuberculose (TB-C). Nossos resultados de linfoproliferação e de Elisa revelaram diminuição da resposta linfoproliferativa e da produção de IFN-g dos pacientes em comparação com os indivíduos PPD+, enquanto os indivíduos TB-C apresentaram em geral resultados intermediários. Observou-se também que as respostas à PHA não diferiam significativamente entre os grupos, ressaltando a natureza antígeno específica da hiporreatividade na tuberculose. Adicionalmente, verificamos maior reatividade ao antígeno complexo, sonicado, que aos antígenos purificados, e entre estes, a reatividade foi maior para ESAT-6 e 85B que para HBHA, A resposta ao HBHA pode ter sido eventualmente subestimada por razões técnicas, como utilização de dose sub-ótima ou perda da atividade biológica. Em relação ao Elispot para IFN-g, não pudemos observar diferenças entre os grupos, tanto quando se considerou o número total de spots, como quando se contou apenas spots com diâmetro > 65 mm, apresentando portanto uma sensibilidade aparentemente menor comparado aos outros 2 métodos. A comparação entre os métodos revelou pouca correlação entre seus resultados, que pode ser eventualmente explicado pela diferente contribuição das populações celulares (T CD4+ e T CD8+) para cada uma das provas munológicas. Finalmente, a análise da produção de IL-10 medida por Elisa no sobrenadante de cultura e por spots de IL10, também não revelou diferenças entre os grupos. Convém notar que o Elisa detectou baixas concentrações de IL-10 nos sobrenadantes, porém o Elispot demonstrou número elevado de spots e boa correlação entre as resposta aos antígenos. Em conclusão, nossos resultados sugerem que métodos \'clássicos\', e já estabelecidos, como linfoproliferação e Elisa, persistem válidos para se avaliar a imunidade celular, e que em nossas condições laboratoriais, a técnica de Elispot não representou, até o momento, uma melhora na qualidade da avaliação imunológica. / Tuberculosis is a chronic granulomatous disease characterized by a deficit of the antigen-specific immunity of the host, whose immune response is actively regulated by cytokines. In Brazil there are 50 million people infected with Mycobacterium tuberculosis. The objective of the present work was to evaluate the lymphoproliferative response e the IFN-g response by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) indiced with 4 different antigens isolated from Mycobacterium tuberculosis: a complex, crude, the sonicate antigen, and 3 other, purified ones, Esat-6, 85B, and HBHA, the last 3 eventual candidates to the design of a vaccine against tuberculosis. We used 2 methods to evaluate the IFN-g and IL-10 productions, namely Elispot and Elisa of supernatant of PBMC cultures. We studied a group of active tuberculosis patients (TB-A), and compared them with controls individuals comprising 2 groups, one made of healthy PPD+ individuals and the second one of individuals who have been cured from an episode of tuberculosis in the past (TB-C). Our results of lymphoproliferation and Elisa revealed decrease in the lymphoproliferative and IFN-g responses by patients\' PBMC as compared to the PPD+ group, with the TB-C group in general presenting intermediate results. We also observed that the responses to the mitogen PHA were not statisically different among the groups, denoting the antigen-specific nature of the immune deficit in tuberculosis. In addition, we verified that stronger reactivity to the complex antigen than with the purified antigens, and, among the latter, the reactivity was stronger with Esat-6 and 85B as compared to HBHA, Reactivity to HBHA may have been understimated due to technical reasons, such as loss of .the biological activity of the molecule or use of a sub-optimal dose. By using the Elispot for IFN-g we were not able to detect differences among the groups, even when we counted all spots formed or spots with more than > 65 mm in diameter. Thus our Elispot for IFN-g apparently showed lower sensitivity than the other 2 methods. Furthermore, comparisons between the methods revealed low correlation between their results, a finding that may be explained by the differning contribution of different subpopulations (T CD4+ and T CD8+) to each of the results. Finally, analysis of the production of IL-10 as measured by Elisa in the culture supernatants as well as by Elispot revealed no differences among the groups. It is noteworthy that the levels of IL-10 detected by Elisa were low, but the Elispot revealed high number of spots and a good correlation between the antigen responses. In conclusion, we may say that our well standardized \'classical\' methods Elisa and lymphoproliferation persist useful to evaluate cellular immunity responses, and that the Elispot technique, up to now and in our laboratorial conditions, did not represent an improvement in the quality of the immunological evaluation.
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Resposta imune celular a diferentes antígenos micobacterianos em indivíduos infectados por Mycobacterium tuberculosis: avaliação por elispot, elisa e linfoproliferaçãoMaury Massani Tanji 02 March 2005 (has links)
A tuberculose é uma doença crônica granulomatosa caracterizada por um déficit de imunidade antígeno específica do hospedeiro, cuja resposta imune é ativamente regulada por citocinas. No Brasil há mais de 50 milhões de habitantes infectados pelo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo foi avaliar a linfoproliferação e a produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas por quatro diferentes antígenos do M. tuberculosis, um complexo, o antígeno sonicado, e três purificados, ESAT-6, antígeno 85B e antígeno HBHA, eventuais candidatos à vacina anti-tuberculose. Para avaliação da produção de IFN-g e IL-10 foram utilizados dois métodos: Elispot e Elisa à partir de sobrenadante de cultura de PBMC. Para essas avaliações, os pacientes com tuberculose ativa (TB-A) foram comparados a dois subgrupos de indivíduos controles. O primeiro subgrupo foi constituído por indivíduos saudáveis PPD+ e o segundo por indivíduos curados de um episódio de tuberculose (TB-C). Nossos resultados de linfoproliferação e de Elisa revelaram diminuição da resposta linfoproliferativa e da produção de IFN-g dos pacientes em comparação com os indivíduos PPD+, enquanto os indivíduos TB-C apresentaram em geral resultados intermediários. Observou-se também que as respostas à PHA não diferiam significativamente entre os grupos, ressaltando a natureza antígeno específica da hiporreatividade na tuberculose. Adicionalmente, verificamos maior reatividade ao antígeno complexo, sonicado, que aos antígenos purificados, e entre estes, a reatividade foi maior para ESAT-6 e 85B que para HBHA, A resposta ao HBHA pode ter sido eventualmente subestimada por razões técnicas, como utilização de dose sub-ótima ou perda da atividade biológica. Em relação ao Elispot para IFN-g, não pudemos observar diferenças entre os grupos, tanto quando se considerou o número total de spots, como quando se contou apenas spots com diâmetro > 65 mm, apresentando portanto uma sensibilidade aparentemente menor comparado aos outros 2 métodos. A comparação entre os métodos revelou pouca correlação entre seus resultados, que pode ser eventualmente explicado pela diferente contribuição das populações celulares (T CD4+ e T CD8+) para cada uma das provas munológicas. Finalmente, a análise da produção de IL-10 medida por Elisa no sobrenadante de cultura e por spots de IL10, também não revelou diferenças entre os grupos. Convém notar que o Elisa detectou baixas concentrações de IL-10 nos sobrenadantes, porém o Elispot demonstrou número elevado de spots e boa correlação entre as resposta aos antígenos. Em conclusão, nossos resultados sugerem que métodos \'clássicos\', e já estabelecidos, como linfoproliferação e Elisa, persistem válidos para se avaliar a imunidade celular, e que em nossas condições laboratoriais, a técnica de Elispot não representou, até o momento, uma melhora na qualidade da avaliação imunológica. / Tuberculosis is a chronic granulomatous disease characterized by a deficit of the antigen-specific immunity of the host, whose immune response is actively regulated by cytokines. In Brazil there are 50 million people infected with Mycobacterium tuberculosis. The objective of the present work was to evaluate the lymphoproliferative response e the IFN-g response by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) indiced with 4 different antigens isolated from Mycobacterium tuberculosis: a complex, crude, the sonicate antigen, and 3 other, purified ones, Esat-6, 85B, and HBHA, the last 3 eventual candidates to the design of a vaccine against tuberculosis. We used 2 methods to evaluate the IFN-g and IL-10 productions, namely Elispot and Elisa of supernatant of PBMC cultures. We studied a group of active tuberculosis patients (TB-A), and compared them with controls individuals comprising 2 groups, one made of healthy PPD+ individuals and the second one of individuals who have been cured from an episode of tuberculosis in the past (TB-C). Our results of lymphoproliferation and Elisa revealed decrease in the lymphoproliferative and IFN-g responses by patients\' PBMC as compared to the PPD+ group, with the TB-C group in general presenting intermediate results. We also observed that the responses to the mitogen PHA were not statisically different among the groups, denoting the antigen-specific nature of the immune deficit in tuberculosis. In addition, we verified that stronger reactivity to the complex antigen than with the purified antigens, and, among the latter, the reactivity was stronger with Esat-6 and 85B as compared to HBHA, Reactivity to HBHA may have been understimated due to technical reasons, such as loss of .the biological activity of the molecule or use of a sub-optimal dose. By using the Elispot for IFN-g we were not able to detect differences among the groups, even when we counted all spots formed or spots with more than > 65 mm in diameter. Thus our Elispot for IFN-g apparently showed lower sensitivity than the other 2 methods. Furthermore, comparisons between the methods revealed low correlation between their results, a finding that may be explained by the differning contribution of different subpopulations (T CD4+ and T CD8+) to each of the results. Finally, analysis of the production of IL-10 as measured by Elisa in the culture supernatants as well as by Elispot revealed no differences among the groups. It is noteworthy that the levels of IL-10 detected by Elisa were low, but the Elispot revealed high number of spots and a good correlation between the antigen responses. In conclusion, we may say that our well standardized \'classical\' methods Elisa and lymphoproliferation persist useful to evaluate cellular immunity responses, and that the Elispot technique, up to now and in our laboratorial conditions, did not represent an improvement in the quality of the immunological evaluation.
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"Células mononucleares de sangue de cordão umbilical e de sangue periférico estimulado com fator de crescimento granulocítico (G-CSF) : análise da proliferação e de apoptose in vitro" / Mononuclear cells from umbilical cord blood and from granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) mobilized peripheral blood. Analysis of proliferation and apoptosis in vitroRibeiro, Andreza Alice Feitosa 08 September 2003 (has links)
Células mononucleares de sangue de cordão umbilical (SCU) e sangue periférico mobilizado (SPM) com G-CSF, foram cultivadas in vitro com citocinas, na presença ou não de estroma de medula óssea. Os objetivos foram avaliar a capacidade proliferativa de células progenitoras, a ocorrência de apoptose e expressão de integrina. Nas culturas sem estroma, a celularidade aumentou 5 vezes (SCU) e não se alterou nas de SPM. O total de células CD34+ caiu em ambas culturas. Com estroma, o total de células nucleadas aumentou 7 vezes (SCU) e 2,3 vezes (SPM). O total de células CD34+ permaneceu o mesmo. A apoptose foi menor nas culturas de SCU. A expressão de integrina caiu, na população de células CD34+ e de CD45+ / Mononuclear cells from umbilical cord blood (UCB) and G-CSF mobilized peripheral blood (MPB), were cultured in vitro, in the presence of cytokines, with or without bone marrow stroma. The aims were to evaluate the proliferative response of progenitor cells, occurrence of apoptosis and expression of adhesion molecule. In cultures without stroma, cellularity increased 5-fold for UCB, but has not changed for MPB. The number of CD34+ cells has dropped in both culture. With stroma, total nucleated cells had a 7-fold increse (UCB) and a 2,3-fold (MBP), however, CD34+ cells number has not changed. Apoptosis was lower in UCB culture. The expression of integrin decreased, in the CD34+ and CD45+ population
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"Células mononucleares de sangue de cordão umbilical e de sangue periférico estimulado com fator de crescimento granulocítico (G-CSF) : análise da proliferação e de apoptose in vitro" / Mononuclear cells from umbilical cord blood and from granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) mobilized peripheral blood. Analysis of proliferation and apoptosis in vitroAndreza Alice Feitosa Ribeiro 08 September 2003 (has links)
Células mononucleares de sangue de cordão umbilical (SCU) e sangue periférico mobilizado (SPM) com G-CSF, foram cultivadas in vitro com citocinas, na presença ou não de estroma de medula óssea. Os objetivos foram avaliar a capacidade proliferativa de células progenitoras, a ocorrência de apoptose e expressão de integrina. Nas culturas sem estroma, a celularidade aumentou 5 vezes (SCU) e não se alterou nas de SPM. O total de células CD34+ caiu em ambas culturas. Com estroma, o total de células nucleadas aumentou 7 vezes (SCU) e 2,3 vezes (SPM). O total de células CD34+ permaneceu o mesmo. A apoptose foi menor nas culturas de SCU. A expressão de integrina caiu, na população de células CD34+ e de CD45+ / Mononuclear cells from umbilical cord blood (UCB) and G-CSF mobilized peripheral blood (MPB), were cultured in vitro, in the presence of cytokines, with or without bone marrow stroma. The aims were to evaluate the proliferative response of progenitor cells, occurrence of apoptosis and expression of adhesion molecule. In cultures without stroma, cellularity increased 5-fold for UCB, but has not changed for MPB. The number of CD34+ cells has dropped in both culture. With stroma, total nucleated cells had a 7-fold increse (UCB) and a 2,3-fold (MBP), however, CD34+ cells number has not changed. Apoptosis was lower in UCB culture. The expression of integrin decreased, in the CD34+ and CD45+ population
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