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INTRODUÇÃO: A conjuntivite alérgica é a forma mais comum de doença alérgica que afeta o olho. Neste trabalho, desenvolvemos um modelo murino reprodutível e simular a doença humana, para possibilitar o estudo dos mecanismos fisiopatológicos da conjuntivite alérgica crônica. MÉTODOS: Imunizamos os camundongos BALB/c e C57Bl/6 com extrato do ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt). Foi realizada a dissecção dos linfonodos ilíacos e para-aórticos, e a enucleação dos olhos. O plasma obtido pela punção cardíaca foi utilizado para a dosagem de IgE e IgG totais e específicas para Dpt. Os olhos enucleados foram enviados para estudo anátomo-patológico da conjuntiva e córnea. RESULTADOS: 1) Houve uma diferença estatisticamente significante entre as duas linhagens (BALB/c e C57Bl/6) para os grupos imunizados com 5 ?g e 500 ?g na gradação clínica e histopatológica, dosagens de IgE Total e Específica, proliferação de linfócitos específica para Dpt e IgG Específica, e na dosagem das IL-5, IL-8 e IL-13; 2) Os níveis de IgG Total não se mostraram significantes para as duas linhagens nos grupos imunizados com 5 ?g e 500 ?g; 3) Os níveis de IL-4 e IL-10 tiveram uma diferença significante nos animais da linhagem BALB/c imunizados com 5 ?g e 500 ?g, mas não nos camundongos da linhagem C57BI/6; 4) Os níveis de IFN-? foram maiores nos camundongos C57BI/6 que receberam as menores quantidades de antígeno. Porém nos camundongos BALB/c o fenômeno foi o inverso; 5) O exame histológico revelou afilamento corneano, infiltrado linfocítico corneano e conjuntival, degeneração da conjuntiva e úlceras de córnea nos animais que obtiveram as maiores gradações clínicas da doença (camundongos BALB/c imunizados com 500 ?g de Dpt e camundongos C57Bl/6 imunizados com 5 ?g. CONCLUSÃO: Desenvolveu-se um modelo simples e reprodutível de conjuntivite alérgica crônica do Dermatophagoides pteronyssinus depois de repetidas exposições ao antígeno, o qual apresenta manifestações clínicas similares à doença humana, e serve como modelo de estudo dos mecanismos imunológicos envolvidos no desenvolvimento da doença / INTRODUCTION: Allergic conjunctivitis is the most common form of allergic disease that affects the eye. In this study we developed a reproducible mouse model and simulated human disease to enable the study of physiopathologic mechanisms of chronic allergic conjunctivitis. METHODS: We immunized BALB/c and C57B1/6 mice with Dermatophagoides Pteronyssinus (Dpt) dust mite extract. The iliac and paraaortic lymph nodes were dissected and the eyes were enucleated. The plasma obtained by cardiac puncture was used to measure Total and Specific IgE and IgG and Dpt-specific. Lymph node cells were used to measure Dpt specific proliferation cytokine detection in the culture supernatant. Eyes were enucleated for histopathological analysis of the conjunctiva and cornea. RESULTS: 1) There was a statistically significant difference between the 2 strains (BALB/c and C57B1/6) for the 2 groups immunized with 5?g and 500?g in the clinical and histopathological score, Total and Specific IgE dosages, proliferation Dpt-specific lymphocytes, dust mite Specific IgG, and in the levels of IL-5, IL-8 and IL-13; 2) The level of Total IgG was not significantly different between the 2 lineages in the groups immunized with 5?g and 500?g; 3) The levels of IL-4 and IL-10 showed a significant difference in BALB/c mice sensitized with 5?g and 500?g, but not in C57B1/6 mice; 4) The IFN-? levels were higher in C57B1/6 mice that received the smallest quantity of antigen. But among BALB/c mice the phenomenon was inversed; 5) The histological examination revealed that there was a tapering of the cornea, lymphocytic infiltration of the cornea and conjunctiva, conjunctival degeneration and corneal ulcers in the animals that developed the highest clinical scores of disease (BALB/c immunized with 500 ug of Dpt and C57Bl/6 immunized with 5 ?g of Dpt). Conclusion: A simple and reproducible model of chronic allergic conjunctivitis to Dermatophagoide pteronyssinus was developed after repeated exposure to the allergen, which exhibit similar clinical manifestations as human disease, therefore serving as a template to study the immunological mechanisms involved in the development of disease

INTRODUÇÃO: A conjuntivite alérgica é a forma mais comum de doença alérgica que afeta o olho. Neste trabalho, desenvolvemos um modelo murino reprodutível e simular a doença humana, para possibilitar o estudo dos mecanismos fisiopatológicos da conjuntivite alérgica crônica. MÉTODOS: Imunizamos os camundongos BALB/c e C57Bl/6 com extrato do ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt). Foi realizada a dissecção dos linfonodos ilíacos e para-aórticos, e a enucleação dos olhos. O plasma obtido pela punção cardíaca foi utilizado para a dosagem de IgE e IgG totais e específicas para Dpt. Os olhos enucleados foram enviados para estudo anátomo-patológico da conjuntiva e córnea. RESULTADOS: 1) Houve uma diferença estatisticamente significante entre as duas linhagens (BALB/c e C57Bl/6) para os grupos imunizados com 5 ?g e 500 ?g na gradação clínica e histopatológica, dosagens de IgE Total e Específica, proliferação de linfócitos específica para Dpt e IgG Específica, e na dosagem das IL-5, IL-8 e IL-13; 2) Os níveis de IgG Total não se mostraram significantes para as duas linhagens nos grupos imunizados com 5 ?g e 500 ?g; 3) Os níveis de IL-4 e IL-10 tiveram uma diferença significante nos animais da linhagem BALB/c imunizados com 5 ?g e 500 ?g, mas não nos camundongos da linhagem C57BI/6; 4) Os níveis de IFN-? foram maiores nos camundongos C57BI/6 que receberam as menores quantidades de antígeno. Porém nos camundongos BALB/c o fenômeno foi o inverso; 5) O exame histológico revelou afilamento corneano, infiltrado linfocítico corneano e conjuntival, degeneração da conjuntiva e úlceras de córnea nos animais que obtiveram as maiores gradações clínicas da doença (camundongos BALB/c imunizados com 500 ?g de Dpt e camundongos C57Bl/6 imunizados com 5 ?g. CONCLUSÃO: Desenvolveu-se um modelo simples e reprodutível de conjuntivite alérgica crônica do Dermatophagoides pteronyssinus depois de repetidas exposições ao antígeno, o qual apresenta manifestações clínicas similares à doença humana, e serve como modelo de estudo dos mecanismos imunológicos envolvidos no desenvolvimento da doença / INTRODUCTION: Allergic conjunctivitis is the most common form of allergic disease that affects the eye. In this study we developed a reproducible mouse model and simulated human disease to enable the study of physiopathologic mechanisms of chronic allergic conjunctivitis. METHODS: We immunized BALB/c and C57B1/6 mice with Dermatophagoides Pteronyssinus (Dpt) dust mite extract. The iliac and paraaortic lymph nodes were dissected and the eyes were enucleated. The plasma obtained by cardiac puncture was used to measure Total and Specific IgE and IgG and Dpt-specific. Lymph node cells were used to measure Dpt specific proliferation cytokine detection in the culture supernatant. Eyes were enucleated for histopathological analysis of the conjunctiva and cornea. RESULTS: 1) There was a statistically significant difference between the 2 strains (BALB/c and C57B1/6) for the 2 groups immunized with 5?g and 500?g in the clinical and histopathological score, Total and Specific IgE dosages, proliferation Dpt-specific lymphocytes, dust mite Specific IgG, and in the levels of IL-5, IL-8 and IL-13; 2) The level of Total IgG was not significantly different between the 2 lineages in the groups immunized with 5?g and 500?g; 3) The levels of IL-4 and IL-10 showed a significant difference in BALB/c mice sensitized with 5?g and 500?g, but not in C57B1/6 mice; 4) The IFN-? levels were higher in C57B1/6 mice that received the smallest quantity of antigen. But among BALB/c mice the phenomenon was inversed; 5) The histological examination revealed that there was a tapering of the cornea, lymphocytic infiltration of the cornea and conjunctiva, conjunctival degeneration and corneal ulcers in the animals that developed the highest clinical scores of disease (BALB/c immunized with 500 ug of Dpt and C57Bl/6 immunized with 5 ?g of Dpt). Conclusion: A simple and reproducible model of chronic allergic conjunctivitis to Dermatophagoide pteronyssinus was developed after repeated exposure to the allergen, which exhibit similar clinical manifestations as human disease, therefore serving as a template to study the immunological mechanisms involved in the development of disease

A tuberculose é uma doença crônica granulomatosa caracterizada por um déficit de imunidade antígeno específica do hospedeiro, cuja resposta imune é ativamente regulada por citocinas. No Brasil há mais de 50 milhões de habitantes infectados pelo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo foi avaliar a linfoproliferação e a produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas por quatro diferentes antígenos do M. tuberculosis, um complexo, o antígeno sonicado, e três purificados, ESAT-6, antígeno 85B e antígeno HBHA, eventuais candidatos à vacina anti-tuberculose. Para avaliação da produção de IFN-g e IL-10 foram utilizados dois métodos: Elispot e Elisa à partir de sobrenadante de cultura de PBMC. Para essas avaliações, os pacientes com tuberculose ativa (TB-A) foram comparados a dois subgrupos de indivíduos controles. O primeiro subgrupo foi constituído por indivíduos saudáveis PPD+ e o segundo por indivíduos curados de um episódio de tuberculose (TB-C). Nossos resultados de linfoproliferação e de Elisa revelaram diminuição da resposta linfoproliferativa e da produção de IFN-g dos pacientes em comparação com os indivíduos PPD+, enquanto os indivíduos TB-C apresentaram em geral resultados intermediários. Observou-se também que as respostas à PHA não diferiam significativamente entre os grupos, ressaltando a natureza antígeno específica da hiporreatividade na tuberculose. Adicionalmente, verificamos maior reatividade ao antígeno complexo, sonicado, que aos antígenos purificados, e entre estes, a reatividade foi maior para ESAT-6 e 85B que para HBHA, A resposta ao HBHA pode ter sido eventualmente subestimada por razões técnicas, como utilização de dose sub-ótima ou perda da atividade biológica. Em relação ao Elispot para IFN-g, não pudemos observar diferenças entre os grupos, tanto quando se considerou o número total de spots, como quando se contou apenas spots com diâmetro > 65 mm, apresentando portanto uma sensibilidade aparentemente menor comparado aos outros 2 métodos. A comparação entre os métodos revelou pouca correlação entre seus resultados, que pode ser eventualmente explicado pela diferente contribuição das populações celulares (T CD4+ e T CD8+) para cada uma das provas munológicas. Finalmente, a análise da produção de IL-10 medida por Elisa no sobrenadante de cultura e por spots de IL10, também não revelou diferenças entre os grupos. Convém notar que o Elisa detectou baixas concentrações de IL-10 nos sobrenadantes, porém o Elispot demonstrou número elevado de spots e boa correlação entre as resposta aos antígenos. Em conclusão, nossos resultados sugerem que métodos \'clássicos\', e já estabelecidos, como linfoproliferação e Elisa, persistem válidos para se avaliar a imunidade celular, e que em nossas condições laboratoriais, a técnica de Elispot não representou, até o momento, uma melhora na qualidade da avaliação imunológica. / Tuberculosis is a chronic granulomatous disease characterized by a deficit of the antigen-specific immunity of the host, whose immune response is actively regulated by cytokines. In Brazil there are 50 million people infected with Mycobacterium tuberculosis. The objective of the present work was to evaluate the lymphoproliferative response e the IFN-g response by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) indiced with 4 different antigens isolated from Mycobacterium tuberculosis: a complex, crude, the sonicate antigen, and 3 other, purified ones, Esat-6, 85B, and HBHA, the last 3 eventual candidates to the design of a vaccine against tuberculosis. We used 2 methods to evaluate the IFN-g and IL-10 productions, namely Elispot and Elisa of supernatant of PBMC cultures. We studied a group of active tuberculosis patients (TB-A), and compared them with controls individuals comprising 2 groups, one made of healthy PPD+ individuals and the second one of individuals who have been cured from an episode of tuberculosis in the past (TB-C). Our results of lymphoproliferation and Elisa revealed decrease in the lymphoproliferative and IFN-g responses by patients\' PBMC as compared to the PPD+ group, with the TB-C group in general presenting intermediate results. We also observed that the responses to the mitogen PHA were not statisically different among the groups, denoting the antigen-specific nature of the immune deficit in tuberculosis. In addition, we verified that stronger reactivity to the complex antigen than with the purified antigens, and, among the latter, the reactivity was stronger with Esat-6 and 85B as compared to HBHA, Reactivity to HBHA may have been understimated due to technical reasons, such as loss of .the biological activity of the molecule or use of a sub-optimal dose. By using the Elispot for IFN-g we were not able to detect differences among the groups, even when we counted all spots formed or spots with more than > 65 mm in diameter. Thus our Elispot for IFN-g apparently showed lower sensitivity than the other 2 methods. Furthermore, comparisons between the methods revealed low correlation between their results, a finding that may be explained by the differning contribution of different subpopulations (T CD4+ and T CD8+) to each of the results. Finally, analysis of the production of IL-10 as measured by Elisa in the culture supernatants as well as by Elispot revealed no differences among the groups. It is noteworthy that the levels of IL-10 detected by Elisa were low, but the Elispot revealed high number of spots and a good correlation between the antigen responses. In conclusion, we may say that our well standardized \'classical\' methods Elisa and lymphoproliferation persist useful to evaluate cellular immunity responses, and that the Elispot technique, up to now and in our laboratorial conditions, did not represent an improvement in the quality of the immunological evaluation.

A tuberculose é uma doença crônica granulomatosa caracterizada por um déficit de imunidade antígeno específica do hospedeiro, cuja resposta imune é ativamente regulada por citocinas. No Brasil há mais de 50 milhões de habitantes infectados pelo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo foi avaliar a linfoproliferação e a produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas por quatro diferentes antígenos do M. tuberculosis, um complexo, o antígeno sonicado, e três purificados, ESAT-6, antígeno 85B e antígeno HBHA, eventuais candidatos à vacina anti-tuberculose. Para avaliação da produção de IFN-g e IL-10 foram utilizados dois métodos: Elispot e Elisa à partir de sobrenadante de cultura de PBMC. Para essas avaliações, os pacientes com tuberculose ativa (TB-A) foram comparados a dois subgrupos de indivíduos controles. O primeiro subgrupo foi constituído por indivíduos saudáveis PPD+ e o segundo por indivíduos curados de um episódio de tuberculose (TB-C). Nossos resultados de linfoproliferação e de Elisa revelaram diminuição da resposta linfoproliferativa e da produção de IFN-g dos pacientes em comparação com os indivíduos PPD+, enquanto os indivíduos TB-C apresentaram em geral resultados intermediários. Observou-se também que as respostas à PHA não diferiam significativamente entre os grupos, ressaltando a natureza antígeno específica da hiporreatividade na tuberculose. Adicionalmente, verificamos maior reatividade ao antígeno complexo, sonicado, que aos antígenos purificados, e entre estes, a reatividade foi maior para ESAT-6 e 85B que para HBHA, A resposta ao HBHA pode ter sido eventualmente subestimada por razões técnicas, como utilização de dose sub-ótima ou perda da atividade biológica. Em relação ao Elispot para IFN-g, não pudemos observar diferenças entre os grupos, tanto quando se considerou o número total de spots, como quando se contou apenas spots com diâmetro > 65 mm, apresentando portanto uma sensibilidade aparentemente menor comparado aos outros 2 métodos. A comparação entre os métodos revelou pouca correlação entre seus resultados, que pode ser eventualmente explicado pela diferente contribuição das populações celulares (T CD4+ e T CD8+) para cada uma das provas munológicas. Finalmente, a análise da produção de IL-10 medida por Elisa no sobrenadante de cultura e por spots de IL10, também não revelou diferenças entre os grupos. Convém notar que o Elisa detectou baixas concentrações de IL-10 nos sobrenadantes, porém o Elispot demonstrou número elevado de spots e boa correlação entre as resposta aos antígenos. Em conclusão, nossos resultados sugerem que métodos \'clássicos\', e já estabelecidos, como linfoproliferação e Elisa, persistem válidos para se avaliar a imunidade celular, e que em nossas condições laboratoriais, a técnica de Elispot não representou, até o momento, uma melhora na qualidade da avaliação imunológica. / Tuberculosis is a chronic granulomatous disease characterized by a deficit of the antigen-specific immunity of the host, whose immune response is actively regulated by cytokines. In Brazil there are 50 million people infected with Mycobacterium tuberculosis. The objective of the present work was to evaluate the lymphoproliferative response e the IFN-g response by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) indiced with 4 different antigens isolated from Mycobacterium tuberculosis: a complex, crude, the sonicate antigen, and 3 other, purified ones, Esat-6, 85B, and HBHA, the last 3 eventual candidates to the design of a vaccine against tuberculosis. We used 2 methods to evaluate the IFN-g and IL-10 productions, namely Elispot and Elisa of supernatant of PBMC cultures. We studied a group of active tuberculosis patients (TB-A), and compared them with controls individuals comprising 2 groups, one made of healthy PPD+ individuals and the second one of individuals who have been cured from an episode of tuberculosis in the past (TB-C). Our results of lymphoproliferation and Elisa revealed decrease in the lymphoproliferative and IFN-g responses by patients\' PBMC as compared to the PPD+ group, with the TB-C group in general presenting intermediate results. We also observed that the responses to the mitogen PHA were not statisically different among the groups, denoting the antigen-specific nature of the immune deficit in tuberculosis. In addition, we verified that stronger reactivity to the complex antigen than with the purified antigens, and, among the latter, the reactivity was stronger with Esat-6 and 85B as compared to HBHA, Reactivity to HBHA may have been understimated due to technical reasons, such as loss of .the biological activity of the molecule or use of a sub-optimal dose. By using the Elispot for IFN-g we were not able to detect differences among the groups, even when we counted all spots formed or spots with more than > 65 mm in diameter. Thus our Elispot for IFN-g apparently showed lower sensitivity than the other 2 methods. Furthermore, comparisons between the methods revealed low correlation between their results, a finding that may be explained by the differning contribution of different subpopulations (T CD4+ and T CD8+) to each of the results. Finally, analysis of the production of IL-10 as measured by Elisa in the culture supernatants as well as by Elispot revealed no differences among the groups. It is noteworthy that the levels of IL-10 detected by Elisa were low, but the Elispot revealed high number of spots and a good correlation between the antigen responses. In conclusion, we may say that our well standardized \'classical\' methods Elisa and lymphoproliferation persist useful to evaluate cellular immunity responses, and that the Elispot technique, up to now and in our laboratorial conditions, did not represent an improvement in the quality of the immunological evaluation.

INTRODUÇÃO: A endomiocardiofibrose (EMF) é uma doença típica de países tropicais, na qual ocorre a deposição de uma capa fibrosa na região endomiocárdica com graves consequências clínicas. A patogenia da EMF ainda não foi elucidada, mas uma das principais hipóteses etiológicas sugere que a EMF seja consequência de um processo inflamatório crônico com envolvimento de respostas imunes Th2 pós-infestação helmíntica, mediada por eosinófilos nas fases iniciais da doença. Neste estudo avaliamos o perfil da resposta imune e inflamatória, assim como o perfil de proteínas expressas no endomiocárdio afetado, para compreender melhor os mecanismos envolvidos na patogênese da EMF. MÉTODOS: Foram coletadas amostras de plasma e soro de pacientes com diagnóstico de EMF e de indivíduos saudáveis, para dosagens de 6 citocinas plasmáticas do perfil Th1/Th2, Proteína C Reativa ultrassensível (PCRus), IgE total e IgE específico contra aero-alérgenos prevalentes e alérgenos de helmintos. A análise proteômica do endomiocárdio afetado de quatro pacientes com EMF submetidos à ressecção cirúrgica da fibrose, levou à identificação por espectrometria de massas, de proteínas separadas previamente por gel 1D e 2D. Análises in silico de vias funcionais e redes ligando as proteínas identificadas também foram realizadas. Eosinofilia em sangue periférico, assim como dados clínicos e ecocardiográficos, foram avaliados retrospectivamente. RESULTADOS: Foram selecionados 27 pacientes em estágio avançado da EMF, portadores de disfunção diastólica e/ou valvar. Todas as amostras de plasma analisadas apresentaram níveis detectáveis de pelo menos uma das citocinas avaliadas. As citocinas IL-6, TNF-?, IL-10 e IL-4 foram detectadas em pelo menos 74% das amostras, sendo que os níveis de IL-6, TNF-? e IL-10 se apresentaram significantemente elevados em comparação com os detectados nos indivíduos saudáveis. Foi observada correlação positiva entre os níveis de todas as citocinas avaliadas. Apenas 33% dos pacientes apresentaram algum episódio isolado de eosinofilia periférica ao longo do tempo, sendo que 11% apresentaram hipereosinofilia. Os níveis de IgE total foram semelhantes aos observados na população controle. A análise proteômica permitiu identificar 140 proteínas distintas no tecido endomiocárdico, das quais 18 eram provenientes da matriz extracelular. As análises in silico indicaram IL-6 e TNF-? como dois dos principais indutores da expressão das proteínas identificadas e a principal via canônica envolvida nas proteínas identificadas foi a: \"Resposta de Fase Aguda\". Coincidentemente, os níveis de PCRus encontraram-se significativamente aumentados nos portadores de EMF. CONCLUSÕES: Elevados níveis de citocinas pró e anti-inflamatórias e de PCRus sugerem a presença de perfil inflamatório misto (Th1/Th2) nas fases avançadas da patogênese da EMF. A pouca expressão da eosinofilia descarta sua participação ativa na patogênese da fase avançada da doença, mas não é possível excluir sua participação nas fases iniciais. Nossos dados permitem levantar a hipótese que os níveis elevados de citocinas inflamatórias modulem a expressão de proteínas- incluindo as de fase aguda- no tecido endomiocárdico de pacientes portadores de EMF / INTRODUCTION: Endomyocardial fibrosis (EMF) is a typical disease in tropical countries, characterized by the fibrous deposition in the endomyocardium, with severe clinical manifestations. EMF pathogenesis is still unclear, but one of the major hypothesis suggests that EMF could be a consequence of a chronic inflammatory process with possible involvement of a Th2 immune responses after helminthiasis, mediated by eosinophils, which could contribute to pathogenesis in the early stages of the disease. In this study, we evaluated the inflammatory response profile and the protein expression profile of the affected endomyocardium, to understand the mechanisms involved in this pathogenesis. METHODS: Plasma and serum samples were collected from the 27 patients diagnosed with advanced stage EMFand from healthy controls, to mensured plasma levels of 6 cytokines belonging to the Th1/Th2 cytokine profiles, ultrasensitive C Reactive Protein (CRP), total and allergen-specific serum IgE against prevalent and helminthic allergens. Proteomic analysis of tissue samples obtained from 4 EMF patients submitted to surgical resection of affected endomyocardial tissue allowed the identification of proteins by mass spectrometry, after separation by 1D and 2D electroforesis. In silico analysis of functional pathways and networks connecting the proteins identified in the EMF cardiac tissue was also performed. Blood peripheral eosinophilia, clinical and echocardiography data were evaluated retrospectively. RESULTS: All EMF patients displayed detectable plasma levels of at least one of the cytokines tested. We found that TNF-?, IL-6, IL-4 and IL-10 were each detected in at least 74% of tested sera, and plasma levels of IL10, IL6 and TNF-? were significantly higher than controls. Plasma levels of such cytokines positively correlated with each other. Only 33% of the patients presented any episode of blood eosinophilia along time, and 11% of these patients presented hypereosinophilia. Total IgE levels were similar to those from healthy subjects. Proteomic analysis allowed the identification of 140 distinct proteins from the resected endomiocardium of the EMF patients, 18 of which belonging to the extracellular matrix. In silico analysis indicated IL-6 and TNF-? as two of the major gene expression inducers of the identified proteins in our analysis, and the Acute Phase Response was identified as the major canonical pathway involved with the identified set of proteins. Similarly, CRP levels were significantly increased in the EMF patients. CONCLUSIONS: Increased levels of an inflammatory/anti-inflammatory circulating cytokines (Th1/Th2), along with increased CRP levels, suggested the presence of a mixed inflammatory profile in EMF advanced stage. The number of EMF patients with blood eosinophilia does not support the active participation of eosinophils in pathogenesis of advanced EMF. However, it is not possible to exclude the participation in the pathogenesis early stages. Our data support the hypothesis that the increased levels of inflammatory cytokines modulate protein expression -including proteins of the acute phase response - in the endomyocardial tissue of EMF patients

INTRODUÇÃO: A endomiocardiofibrose (EMF) é uma doença típica de países tropicais, na qual ocorre a deposição de uma capa fibrosa na região endomiocárdica com graves consequências clínicas. A patogenia da EMF ainda não foi elucidada, mas uma das principais hipóteses etiológicas sugere que a EMF seja consequência de um processo inflamatório crônico com envolvimento de respostas imunes Th2 pós-infestação helmíntica, mediada por eosinófilos nas fases iniciais da doença. Neste estudo avaliamos o perfil da resposta imune e inflamatória, assim como o perfil de proteínas expressas no endomiocárdio afetado, para compreender melhor os mecanismos envolvidos na patogênese da EMF. MÉTODOS: Foram coletadas amostras de plasma e soro de pacientes com diagnóstico de EMF e de indivíduos saudáveis, para dosagens de 6 citocinas plasmáticas do perfil Th1/Th2, Proteína C Reativa ultrassensível (PCRus), IgE total e IgE específico contra aero-alérgenos prevalentes e alérgenos de helmintos. A análise proteômica do endomiocárdio afetado de quatro pacientes com EMF submetidos à ressecção cirúrgica da fibrose, levou à identificação por espectrometria de massas, de proteínas separadas previamente por gel 1D e 2D. Análises in silico de vias funcionais e redes ligando as proteínas identificadas também foram realizadas. Eosinofilia em sangue periférico, assim como dados clínicos e ecocardiográficos, foram avaliados retrospectivamente. RESULTADOS: Foram selecionados 27 pacientes em estágio avançado da EMF, portadores de disfunção diastólica e/ou valvar. Todas as amostras de plasma analisadas apresentaram níveis detectáveis de pelo menos uma das citocinas avaliadas. As citocinas IL-6, TNF-?, IL-10 e IL-4 foram detectadas em pelo menos 74% das amostras, sendo que os níveis de IL-6, TNF-? e IL-10 se apresentaram significantemente elevados em comparação com os detectados nos indivíduos saudáveis. Foi observada correlação positiva entre os níveis de todas as citocinas avaliadas. Apenas 33% dos pacientes apresentaram algum episódio isolado de eosinofilia periférica ao longo do tempo, sendo que 11% apresentaram hipereosinofilia. Os níveis de IgE total foram semelhantes aos observados na população controle. A análise proteômica permitiu identificar 140 proteínas distintas no tecido endomiocárdico, das quais 18 eram provenientes da matriz extracelular. As análises in silico indicaram IL-6 e TNF-? como dois dos principais indutores da expressão das proteínas identificadas e a principal via canônica envolvida nas proteínas identificadas foi a: \"Resposta de Fase Aguda\". Coincidentemente, os níveis de PCRus encontraram-se significativamente aumentados nos portadores de EMF. CONCLUSÕES: Elevados níveis de citocinas pró e anti-inflamatórias e de PCRus sugerem a presença de perfil inflamatório misto (Th1/Th2) nas fases avançadas da patogênese da EMF. A pouca expressão da eosinofilia descarta sua participação ativa na patogênese da fase avançada da doença, mas não é possível excluir sua participação nas fases iniciais. Nossos dados permitem levantar a hipótese que os níveis elevados de citocinas inflamatórias modulem a expressão de proteínas- incluindo as de fase aguda- no tecido endomiocárdico de pacientes portadores de EMF / INTRODUCTION: Endomyocardial fibrosis (EMF) is a typical disease in tropical countries, characterized by the fibrous deposition in the endomyocardium, with severe clinical manifestations. EMF pathogenesis is still unclear, but one of the major hypothesis suggests that EMF could be a consequence of a chronic inflammatory process with possible involvement of a Th2 immune responses after helminthiasis, mediated by eosinophils, which could contribute to pathogenesis in the early stages of the disease. In this study, we evaluated the inflammatory response profile and the protein expression profile of the affected endomyocardium, to understand the mechanisms involved in this pathogenesis. METHODS: Plasma and serum samples were collected from the 27 patients diagnosed with advanced stage EMFand from healthy controls, to mensured plasma levels of 6 cytokines belonging to the Th1/Th2 cytokine profiles, ultrasensitive C Reactive Protein (CRP), total and allergen-specific serum IgE against prevalent and helminthic allergens. Proteomic analysis of tissue samples obtained from 4 EMF patients submitted to surgical resection of affected endomyocardial tissue allowed the identification of proteins by mass spectrometry, after separation by 1D and 2D electroforesis. In silico analysis of functional pathways and networks connecting the proteins identified in the EMF cardiac tissue was also performed. Blood peripheral eosinophilia, clinical and echocardiography data were evaluated retrospectively. RESULTS: All EMF patients displayed detectable plasma levels of at least one of the cytokines tested. We found that TNF-?, IL-6, IL-4 and IL-10 were each detected in at least 74% of tested sera, and plasma levels of IL10, IL6 and TNF-? were significantly higher than controls. Plasma levels of such cytokines positively correlated with each other. Only 33% of the patients presented any episode of blood eosinophilia along time, and 11% of these patients presented hypereosinophilia. Total IgE levels were similar to those from healthy subjects. Proteomic analysis allowed the identification of 140 distinct proteins from the resected endomiocardium of the EMF patients, 18 of which belonging to the extracellular matrix. In silico analysis indicated IL-6 and TNF-? as two of the major gene expression inducers of the identified proteins in our analysis, and the Acute Phase Response was identified as the major canonical pathway involved with the identified set of proteins. Similarly, CRP levels were significantly increased in the EMF patients. CONCLUSIONS: Increased levels of an inflammatory/anti-inflammatory circulating cytokines (Th1/Th2), along with increased CRP levels, suggested the presence of a mixed inflammatory profile in EMF advanced stage. The number of EMF patients with blood eosinophilia does not support the active participation of eosinophils in pathogenesis of advanced EMF. However, it is not possible to exclude the participation in the pathogenesis early stages. Our data support the hypothesis that the increased levels of inflammatory cytokines modulate protein expression -including proteins of the acute phase response - in the endomyocardial tissue of EMF patients