Neste trabalho, avaliamos os efeitos da suplementação crônica de leucina e do treinamento de força sobre a miopatia diabética. 40 ratos machos da linhagem Wistar Hannover foram distribuídos em 5 grupos: controle, não diabético (C), diabético não tratado (D), diabético treinado (DT), diabético suplementado com leucina e treinado (DLT). O início das intervenções ocorreu na 4ª semana de vida dos animais, e perdurou por 8 semanas. Foram avaliados: massa corporal, consumo de ração e água, concentrações sanguíneas de glicose, insulina e perfil lipídico; capacidade funcional muscular voluntária através de testes de força de preensão e de ambulação; conteúdo intracelular de proteínas relacionadas à via anabólica mTOR e p70S6K, totais e fosforiladas, no músculo extensor longo dos dedos. Os ratos diabéticos não tratados (grupo D) apresentaram hiperglicemia e hipoinsulinemia moderada, menor massa corporal, maior consumo de ração e água, menor peso absoluto dos músculos extensor longo dos dedos e gastrocnêmio, menor força de preensão, menor capacidade de ambulação e menor atividade das proteínas mTOR e p70S6K comparado ao grupo C, o que caracteriza o quadro de miopatia diabética. O peso relativo do músculo gastrocnêmico (peso absoluto/100g de peso do animal) foi maior nos grupos DT e DLT comparado com o grupo D, e maior no grupo DLT comparado com o grupo DL (p < 0,05). Não houve diferença estatística entre os grupos DL e D sobre os pesos relativos dos músculos, ou seja, a suplementação crônica de leucina não afetou este parâmetro nos ratos diabéticos. Interessantemente, houve diferença estatística entre os grupos DL e D sobre a força muscular (p < 0,05), sem haver diferença entre grupos DL e C quanto à glicemia; ou seja, a dieta suplementada com leucina foi capaz de controlar a glicemia e atenuar a perda de força muscular. O treinamento de força também controlou a glicemia, recuperou a força muscular e melhorou a capacidade de ambulação, bem como a regulação da via mTOR-p70S6K. A fosforilação da via mTOR-p70S6K foi maior nos grupos DT e DLT comparado com o grupo D (p < 0,05), e sem diferença entre estes grupos treinados e o grupo C, sugerindo que o treinamento de força combinado com a suplementação de leucina recuperou a atividade da via do mTOR-p70S6K nos animais diabéticos, que pode refletir em maior síntese proteica muscular. O colesterol total do grupo D foi maior comparado com o do grupo C; e nos grupos diabéticos treinados (DT e DLT), este parâmetro foi menor do que no grupo D (p < 0,05). Adicionalmente, o HDL-c aumentou nos grupos treinados (DT e DLT) quando comparado com o grupo D, mas não alterou no grupo que recebeu apenas a suplementação de leucina (grupo DL). Portanto, neste estudo, a suplementação crônica de leucina por si só normalizou a glicemia e melhorou a força muscular dos animais diabéticos. Além disso, o treinamento de força foi responsável pelo maior aumento de força e da massa muscular, bem como pela normalização da glicemia, pela elevação da concentração de HDL-c e pela redução do colesterol total dos animais diabéticos e ambas foram capaz de recuperar a via mTOR-p70S6K. / In this study, we evaluated the effects of chronic supplementation with leucine and resistance training on diabetic myopathy. 40 Wistar Hannover rats were divided into 5 groups: control, non-diabetic (C), untreated diabetic (D), trained diabetic (DT), diabetic supplemented with leucine and trained (DLT). The beginning of the interventions occurred in the 4th week of life of the animals, and lasted for 8 weeks. Were evaluated: body weight, food and water intake, blood concentrations of glucose, insulin and lipid profile; voluntary muscle functional capacity through grip strength and ambulation test; intracellular content of proteins related to the anabolic mTOR and p70S6K pathway, total and phosphorylated in the extensor digitorum longus muscle. Diabetics untreated mice (group D) had hyperglycemia and moderate hypoinsulinemia, lower body mass, food and water intake, reduced absolute weights of the muscles of the long extensor digitorum, and gastrocnemius, the lower grip strength, lower ambulation capacity and lower activity of mTOR and p70S6K protein compared the C group, featuring diabetic myopathy. The relative weight of the gastrocnemius muscle (absolute weight / 100g of body weight) was greater in DT and DLT groups compared with group D, and higher in the DLT group compared to the DL group (P < 0.05). No statistical difference between the DL and D groups on the relative weights of the muscles, that is, chronic supplementation of leucine did not affect this parameter in diabetic rats. Interestingly, there was statistical difference between the DL and D groups on muscle strength (P < 0.05), with no difference between groups DL and C on the blood glucose; that is, the diet supplemented with leucine was able to control glycemia and avoid loss of muscle strength of diabetic animals. Resistance training also controlled glycemia, recovered muscle strength and improved the capacity of ambulation of diabetic animals and the regulation of the mTOR-p70S6K pathway. The phosphorylation of mTOR-p70S6K pathway was higher only in the DT and DLT groups compared with the D group (P < 0.05), and no difference between the DT and C groups, suggesting that the training recovered muscle mass in diabetic animals. Total cholesterol was greater in Group D compared to the group C; and trained diabetic groups (DLT and DT), this parameter was lower than that of the D group (P < 0.05). In addition, HDL-C increased in trained groups (DT and DLT) as compared to group D, but had no effect the group that received only leucine supplementation (DL group). Therefore, in this study, chronic supplementation of leucine alone normalized glucose and improved muscle strength of diabetic animals. In addition, resistance training was responsible for the largest increase in strength and muscle mass, as well as the normalization of glucose, elevated concentrations of HDL-C and reduction in total cholesterol of animals diabetics and both were able to recover mTOR- p70S6K pathway.

A hiperglicemia crônica no diabetes está relacionada com distúrbios nas vias de sinalização da insulina e do mTOR, e com o desbalanço na secreção de adipocinas pelo tecido adiposo branco (TAB). Em longo prazo, esta disfunção metabólica pode causar uma perda severa de massa adiposa, o que agrava a resistência à insulina (RI). Estudos têm destacado o potencial efeito da suplementação com leucina no tratamento de doenças metabólicas como o diabetes tipo 2 e obesidade. No entanto, os efeitos da leucina sobre a homeostase glicêmica e a sensibilidade à insulina em doenças em que ocorre perda severa de gordura ainda necessitam melhores esclarecimentos. Portanto, foi investigado se a suplementação crônica com leucina pode afetar a adiposidade de ratos diabéticos com perda intensa de TAB, e melhorar a RI e outras desordens metabólicas relacionadas com TAB. Ratos recém-desmamados foram distribuídos em 3 grupos: i) Grupo controle (C) - não diabético e recebiam ração controle; ii) Grupo diabetes (D) - diabético e recebiam ração controle; iii) Grupo diabetes Leucina (DL) - diabético e recebiam ração suplementada com 5% de L-leucina. Após 8 semanas, foram analisados: glicemia e insulinemia de jejum, HOMAIR, citocinas pro- e anti-inflamatórias no soro e tecido adiposo branco, expressão de proteínas (mTOR, p-MTOR, p70S6K1, p-p70S6K1, PPAR&#947, C/EBP&#945;, ACC1, FAS, AKT, p-AKT) nos tecidos adiposos subcutâneo (SC) e retroperitoneal (RP), bem como a expressão de RNAm da adiponectina e leptina no TAB. In vivo, foram realizados testes de tolerância oral à glicose (OGTT) e de sensibilidade à insulina (ITT), glicemia pós prandial e consumo de ração. O tratamento crônico com leucina reverteu a perda de massa adiposa dos coxins subcutâneo e viscerais neste modelo experimental, o que pode ser explicado pelo aumento da expressão da p-p70S6K1, PPAR&#947;, ACC1 e FAS, proteínas que estimulam a adipogênese e lipogênese de novo nos adipócitos. Além disso, houve um aumento da expressão de AKT total no coxim SC no grupo DL, mas não foi alterada no coxim RP, indicando que a leucina também pode melhorar a resistência à insulina por ativar a AKT, que é considerada enzima limitante da cascata de fosforilação da insulina. Por outro lado, a leucina melhorou o perfil de adipocinas secretadas pelo coxim RP, pois aumentou a secreção de adiponectina e IL-10. Estas citocinas, direta ou indiretamente, reduzem a RI em tecidos como fígado, TAB e músculo esquelético. Isto sugere que a ação da leucina sobre a sensibilidade à insulina no coxim subcutâneo parece estar mais relacionada com a recuperação da via de sinalização da insulina, ao passo que, no coxim RP está indiretamente relacionada com a melhora do perfil de adipocinas secretadas por este tecido. Estes dados corroboram com os resultados de HOMAIR, glicemia de jejum e pós prandial, OGTT e ITT, nos quais foi observada uma significativa melhora do quadro de intolerância à glicose e resistência à insulina em ratos diabéticos tratados com leucina. Em conclusão, a suplementação crônica com leucina aumentou a adiposidade corporal em ratos diabéticos induzido por estreptozotocina no período neonatal, o que foi relacionado com a melhora da intolerância à glicose e da resistência à insulina. Isto demonstra que a recuperação trófica do tecido adiposo branco é fundamental para a melhora dos distúrbios metabólicos relacionados ao metabolismo da glicose neste modelo experimental. / The chronic hyperglycemia in diabetes is associated with disturbances in insulin and in mTOR pathways, and changes in adipokine secretion in white adipose tissue (WAT). Long-term, this metabolic dysfunction can cause a severe loss of fat mass, which increases insulin resistance (IR). Studies have highlighted the effect of leucine supplementation in treatment of metabolic diseases as type 2 diabetes and obesity. However, the effects of leucine on glucose homeostasis and insulin sensitivity in diseases with intense fat loss remain unknown. Therefore, was investigated whether chronic leucine supplementation can affect the adiposity of diabetic rats with severe adipose tissue loss, and to improve the IR and other metabolic disorders associated with WAT. After weaning, rats were distributed in 3 groups: i) control group (C) - no diabetic and received control chow ; ii) diabetes group (D) - diabetic and received control chow; iii) Leucine Diabetes Group (DL) - diabetic and received diet supplemented with 5% L-leucine. After 8 weeks, were analyzed: fasting glycaemia and insulin, HOMA>IR, antiinflammatory and proinflammatory cytokines in serum and in WAT, protein expression of mTOR, p-MTOR, p70S6K1, p-p70S6K1, PPAR&#947;, C/EBP&#945;, ACC1, FAS, AKT, p-AKT in subcutaneous (SC) and retroperitoneal adipose tissue, as well as the RNAm expression of adiponectin and leptin in WAT. In vivo, were realized oral glucose tolerance test (OGTT) and insulin sensitivity test (ITT), postprandial glycaemia and chow ingestion. O chronic treatment with leucine recovered the adipose mass in subcutaneous and visceral fat pad in this experimental model, this was explicated by increase of protein expression of p-p70S6K1, PPAR&#947;, ACC1 and FAS that stimulate the adipogenesis and de novo lipogenesis in adipocytes. Moreover, had an increase of protein expression of total AkT in subcutaneous fat pad in group DL, but don\'t change in RP fat pad, indicating that the leucine can to activate the AKT, which is limiting enzyme of phosphorylation cascade of insulin, and improve the insulin resistance. On the other hand, leucine improved the profile of adipokines secreted in RP fat pad, because increased the secretion of adiponectin and IL-10. This cytokines reduced the insulin resistance in tissues as liver, WAT and skeletal muscle. This suggest that action of leucine on insulin sensitivity in subcutaneous fat pad is more related to recovery of insulin signaling, and in RP fat pad is indirectly related to improve of profile of adipokines secretion in this tissue. This data corroborates with results of HOMAIR, postprandial and fasting glycaemia, OGTT and ITT, which showed significant improve of glucose intolerance and insulin resistance in diabetic rats treated with leucine. In conclusion, the chronic leucine supplementation increased adiposity in streptozotocin-induced diabetic rats in neonatal period, which was related to improve of glucose intolerance and insulin resistance. This show that trophic recovery of white adipose tissue is important for improve of metabolic disturbances related to glucose metabolism in this experimental model.

A doença do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio neurometabólico causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos severos, tais como coma e convulsões, bem como edema e atrofia cerebral. Os compostos que se acumulam em maiores concentrações na DXB são o ácido α-cetoisocapróico (CIC), o ácido α- hidroxiisovalérico (HIV) e a leucina (Leu). Considerando que os mecanismos neurotóxicos na DXB não estão completamente esclarecidos, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito in vitro do CIC, HIV e Leu sobre diferentes parâmetros da função em cérebro de ratos jovens, no intuito de verificar alterações que possam esclarecer os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentados pelos pacientes. Foram analisados os parâmetros respiratórios estados 3 e 4, a razão de controle respiratório (RCR) e a razão ADP/O medidos pelo consumo do oxigênio, o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial, o inchamento mitocondrial, além da atividade das enzimas do ciclo do ácido cítrico α-cetoglutarato desidrogenase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase e succinato desidrogenase. Os experimentos realizaram-se na presença de 1 mM e 5 mM de CIC, HIV ou Leu e os substratos respiratórios utilizados foram glutamato/malato (2,5 mM cada), succinato (5 mM) e α-cetoglutarato (5 mM). Observamos que o CIC aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu o RCR com todos os substratos utilizados. Foi também observado que o CIC e a Leu diminuíram o estado 3 da respiração mitocondrial quando foi utilizado α-cetoglutarato como substrato, enquanto que o HIV não modificou nenhum parâmetro respiratório testado. Além disso, o CIC provocou uma redução na razão ADP/O e uma diminuição nos níveis de NAD(P)H mitocondrial utilizando os substratos ligados ao NADH glutamato/malato e α-cetoglutarato. O CIC e a Leu também causaram uma leve redução no ΔΨm quando α-cetoglutarato foi o substrato. Foi também observada uma inibição da atividade da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelo CIC, enquanto que o HIV e a Leu não alteraram a atividade de nenhuma das enzimas estudadas. Por último, os metabólitos testados não foram capazes de induzir o inchamento mitocondrial. Nossos resultados indicam que o CIC, seguido da Leu, sendo estes os compostos que mais se acumulam na DXB, atingindo concentrações plasmáticas de 5 mM, prejudicam a homeostase mitocondrial em cérebro de ratos. Caso os presentes resultados possam ser extrapolados para a condição humana, presume-se que a disfunção mitocondrial pode estar envolvida no dano cerebral observado em pacientes portadores da DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a neurometabolic disorder caused by a deficiency of the mitochondrial enzyme complex branched-chain L-2-keto acid dehydrogenase activity. The affected patients present severe neurological symptoms, such as coma and seizures, as well as edema and cerebral atrophy. The compounds that accumulate in higher concentrations in MSUD are α-ketoisocaproic (KIC), α- hydroxyisovaleric (HIV) e leucine (Leu). Considering that the neurotoxic mechanisms in MSUD are not well established, the purpose of the present study was to investigate the in vitro effect of KIC, HIV and Leu on various parameters of the mitochondrial bioenergetics in brain of young rats, in order to verify alterations that could explain the responsible mechanisms by the brain damage found in MSUD patients. It was analysed the respiratory parameters states 3 and 4, the respiratory control ratio (RCR) and the ADP/O ratio measured by oxygen consumption, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm), the mitochondrial matrix content of NAD(P)H, the mitochondrial swelling, besides the citric acid cycle enzymes activity α-ketoglutarate dehydrogenase, citrate sinthase, isocitrate dehydrogenase, malate dehydrogenase e succinate dehydrogenase. The experiments were performed in the presence of 1 mM and 5 mM of CIC, HIV and Leu and the respiratory substrates used were glutamate/malate (2,5 mM each), succinate (5 mM) e α-ketoglutarate (5 mM). We observed that KIC increased state 4 respiration and decreased RCR with all the substrates used. It was also observed that KIC and Leu decreased state 3 respiration using α-ketoglutarate as substrate, whereas HIV did not modify any respiratory parameter tested. Furthermore, KIC provoked a reduction in the ADP/O ratio and a decrease in NAD(P)H mitochondrial levels using the NADH-linked substrates glutamate/malate and α- ketoglutarate. KIC and Leu also caused a mild reduction in the ΔΨm when α-ketoglutarate was the substrate. It was also observed an inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity provoked by KIC, whereas HIV and Leu did not alter any enzymatic activities studied. Finally, the metabolites tested were not able to inducing mitochondrial swelling. Our results indicate that KIC, followed by Leu, the compounds that most accumulate in DXB, reaching plasma concentrations of 5 mM, impaired the mitochondrial homeostasis in brain of rats. In the case of the present data be extrapolated to human conditions, it may be presumed that the mitochondrial dysfunction might be involved in the brain damage observed in MSUD patients.

A doença da urina do xarope do bordo é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade do complexo enzimático da desidrogenase de α- cetoácidos de cadeia ramificada. Distúrbios neurológicos são comuns em pacientes com esta doença. Apesar de a leucina ser considerada o principal metabolito tóxico, os mecanismos envolvidos na neuropatologia das lesões cerebrais não são bem entendidos. No presente estudo, avaliou-se o possível efeito preventivo da coadministração de creatina e piruvato sobre os efeitos provocados pela administração de leucina a ratas Wistar durante a gestação e lactação sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, bem como sobre as atividades de certas enzimas envolvidas na rede de fosforiltransferência no córtex cerebral e no hipocampo da prole aos 21 dias de idade. A administração de leucina induziu o estresse oxidativo e alterou as atividades das enzimas piruvatocinase, adenilatocinase, creatinacinase citosólica e mitocondrial. A coadministração de creatina e piruvato foi parcialmente eficaz na prevenção de algumas alterações provocadas pela administração de leucina sobre o estresse oxidativo, mas não nas enzimas da rede de fosforiltransferência. Estes resultados sugerem que a hiperleucinemia materna não tratada pode ser tóxica para o cérebro da prole. / Maple Syrup Urine Disease is an inborn error of metabolism caused by severe deficiency in the activity of branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex. Neurological disorders are common in patients with this disease. Although leucine is considered the main toxic metabolite, the mechanisms underlying the neuropathology of brain injury are poorly understood. In the present study, we evaluated the possible preventive effect of the co-administration of creatine plus pyruvate on the effects elicited by leucine administration to female Wistar rats during pregnancy and lactation on some oxidative stress parameters as well as the activities of some enzymes involved in the phosphoryltransfer network in the cerebral cortex and hippocampus of the offspring at 21 days of age. Leucine administration induced oxidative stress and altered the enzymes activities of pyruvate kinase, adenylate kinase, mitochondrial and cytosolic creatine kinase. Co-administration of creatine plus pyruvate was partially effective in the prevention of some alterations provoked by leucine administration on the oxidative stress but not in the enzymes of phosphoryltransfer network. These results suggest that non-treated maternal hyperleucinemia may be toxic to the brain of the offspring.

Nosso objetivo foi investigar o efeito da suplementação de leucina na via intracelular acionada por miostatina, uma proteína reguladora negativa da massa muscular, em um modelo de atrofia gerada por imobilização em ratos. Nossa hipótese inicial contemplava que a expressão de miostatina se elevaria com a imobilização e que a leucina poderia atenuar esse aumento. Nossos resultados, entretanto, mostraram uma regulação gênica no sentido de suprimir a via da miostatina. A suplementação com leucina, associada à imobilização, também provocou queda da expressão gênica de miostatina. Em ambos os grupos a expressão proteica permaneceu inalterada. Em contrapartida, a folistatina, inibidor endógeno da miostatina, apresentou acentuado aumento de expressão no grupo imobilizado e imobilizado/suplementados com leucina. Nossos resultados mostraram que o efeito protetor da leucina no modelo atrófico utilizado não se dá através da sinalização da miostatina. Os dados também sugerem uma resposta biológica coordenada entre o ligante, miostatina, e seu inibidor endógeno, a folistatina. / Our purpose was to investigate the effect of leucine supplementation upon the intracellular pathway triggered by myostatin, a negative regulator of muscle mass, in an atrophic model driven by immobilization in rats. Our initial hypothesis contemplated that myostatin expression would be elevated under immobilization and that leucine supplementation would be able to attenuate this raise. However our results showed a strong downregulation of myostatin gene expression in atrophy induced by cast. The immobilization associated with leucine supplementation also caused mRNA myostatin downregulation. Protein levels were unchanged. On the other hand, follistatin, a myostatin endogenous inhibitor, was markedly upregulated in both immobilized and immobilized/supplemented groups. Our results revealed that leucine protective effect in this atrophic model is not through myostatin signailing. Furthermore, these data suggest a coordinated biological response between ligand, myostatin, and its endogenous inhibitor, follistatin.

Diversos estudos demonstraram que a administração aguda de leucina é capaz de estimular a síntese protéica. Contudo, poucos estudos verificaram os efeitos crônicos dessa suplementação em parâmetros que refletem o estado nutricional protéico (ENP). O presente estudo avaliou o efeito da suplementação crônica com leucina na composição corporal e no estado protéico de ratos submetidos à restrição alimentar (RA) e a período de recuperação nutricional (RN). Foram realizados dois experimentos com 88 ratos Wistar machos e adultos que foram mantidos em gaiolas individuais, em ambiente climatizado e com ciclo biológico de 12 h claro/12 h escuro. No experimento I, 28 animais foram distribuídos em dois grupos: CON (ração AIN93-M) (n = 15) e LEU (ração suplementada com 0,59 % de L-leucina) (n = 13) e submetidos à RA de 50 % por seis semanas. No experimento II, 60 animais foram distribuídos em dois grupos: CON (ração AIN93-M) (n = 30) e LEU (ração suplementada com 0,59 % de L-leucina) (n = 30) e submetidos à RA de 50 % durante uma semana. Findo o período, 15 animais de cada grupo foram sacrificados; o restante dos animais (n = 15 por grupo) foi submetido a duas semanas de RN com suas respectivas rações. No período de RN, as rações foram consumidas ad libitum. Avaliou-se: a composição química da carcaça; a massa de órgãos e do músculo gastrocnêmio; os conteúdos e as concentrações de proteína, RNA e DNA no fígado e no músculo gastrocnêmio; as concentrações séricas de IGF-1, corticosterona, leptina, proteínas totais, albumina e globulina; e as concentrações plasmáticas de uréia e glicose. No experimento I, a suplementação reduziu a gordura corporal e aumentou as concentrações de proteína hepática e de RNA muscular. No experimento II, não houve alterações na massa do intestino e nos conteúdos de proteína e de RNA no fígado dos animais suplementados durante os períodos de RA e RN. A suplementação com leucina aumentou a uremia dos animais do grupo LEU, em relação ao grupo CON, após RN. Não houve diferença significativa na concentração de corticosterona sérica e no conteúdo protéico da carcaça e de tecidos específicos nos animais suplementados. Os resultados obtidos permitem sugerir que a suplementação crônica com leucina aumenta a perda de gordura e melhora alguns parâmetros do ENP na RA em longo prazo, sem alterar o conteúdo protéico da carcaça e de tecidos específicos. Também permitem sugerir que essa suplementação melhora alguns parâmetros do ENP durante variação de peso corporal. / Several studies have demonstrated that the acute administration of leucine is capable of stimulating protein synthesis. However, few studies have investigated the chronic effects of this supplementation as to the parameters that reflect the protein nutritional state (PNS). With this in mind, the aim of this study was o evaluate the effect of the chronic supplementation with leucine on body composition and protein state of rats submitted to food restriction (FR) and a subsequent nutritional recovery period (NR). Two experiments were carried out, using 88 adult male Wistar rats that were kept in individual metabolic cages, in an acclimatized environment with a 12-hour dark-light cycle. In experiment I, 28 animals were distributed into 2 groups: CON (fed an AIN93-M ration, n=15) and LEU (fed a ration supplemented with 0.59% L-leucine, n=13), both groups being submitted to 50% FR with their respective rations, during 6 weeks. In experiment II, 60 animals were distributed into two groups: CON (fed an AIN93-M ration, n=30) and LEU (fed a ration supplemented with 0.59% L-leucine, n=30), both groups being submitted to 50% FR with their respective rations, during 1 week. After this period, 15 animals belonging to each group were sacrificed. The remaining animals (n=15 per group) were submitted to a further 2 weeks of NR each with their respective rations. The period of NR was characterised by ration consumption ad libitum. The chemical composition of the carcass; the mass of the viscera and of the gastrocnemius muscle; protein, RNA and DNA concentration and content of the liver and gastrocnemius muscle; the serum concentrations of IGF-1, corticosterone, leptin, total protein, albumin and globulin; and the plasma concentrations of urea and glucose were determined. The results of experiment I showed that supplementation with leucine reduced the amount of body fat and increased the concentrations of liver protein as well as that of muscle DNA after 6 weeks of FR. The supplementation with leucine also increased uremia of the animals belonging to the LEU group with respect to those of the CON group. However, there was no significant difference in the concentration of serum corticosterone and in the protein content of the carcass and specific tissues of the animals subjected to supplementation. We can therefore suggest that supplementation with leucine increases the loss of body fat and improves parameters of the PNS in FR in the long run, without, however, altering the protein content of the carcass and specific tissues. It can also be said that this supplementation improves some of the parameters of the PNS throughout the variation of body weight.

A deficiência da 3-metilcrotonil-CoA carboxilase (3MCCD) é uma doença autossômica recessiva do metabolismo da leucina, caracterizada bioquimicamente por um acúmulo tecidual de 3-metilcrotonilglicina (3MCG), ácido 3-hidroxi-isovalérico e ácido 3-metilcrotônico (3MCA), bem como de uma deficiência secundária de L-carnitina. A apresentação clínica nos pacientes é bastante variável, mas geralmente apresentam sintomas neurológicos, atraso no desenvolvimento, cardiomiopatia, bem como desenlace fatal em crianças. Tendo em vista que a patogênese da doença ainda é desconhecida, no presente trabalho foram investigados os efeitos da 3MCG e do 3MCA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Demonstrou-se que a 3MCG e o 3MCA aumentaram os níveis das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) bem como a formação de grupamentos carbonila, indicando que esses metabólitos provocam oxidação lipídica e proteica. Além disso, a elevação de TBA-RS provocada pela 3MCG foi prevenida pelos antioxidantes melatonina e trolox, sugerindo o envolvimento de espécies reativas na indução de lipoperoxidação. Considerando que o inibidor da óxido nítrico sintase Nω-nitro-L-arginina metill éster (L-NAME) não alterou os efeitos da peroxidação lipídica e que a produção de óxido nítrico não foi alterada pela 3MCG, presume-se que espécies reativas de oxigênio estão envolvidas nesse efeito. Por outro lado, os níveis de glutationa reduzida (GSH) e a oxidação de grupamentos sulfidrila não foram alterados por 3MCG e 3MCA. Da mesma forma, a atividade de importantes enzimas antioxidantes como a glutationa peroxidase, catalase, superóxido dismutase e glutationa redutase não foi alterada pela 3MCG. Os dados apresentados demonstram que os metabólitos acumulados na 3MCCD induzem oxidação lipídica e proteica e que esses danos podem estar envolvidos, ao menos em parte, na patogênese da doença e nas anormalidades cerebrais apresentadas pelos pacientes. / Isolated 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency (3MCCD) is an autosomal recessive disorder of leucine metabolism biochemically characterized by tecidual accumulation of 3-methylcrotonylglycine (3MCG), 3-hydroxyisovaleric acid and 3-methylcrotonic acid (3MCA), besides that, patients can present a secondary deficiency of L-carnitine. The clinical presentation is highly variable, ranging from severe neurological abnormalities, developmental delay, cardiomyopathy and death in infants, the pathogenesis is poorly known. In the present study, we investigated the in vitro effects of 3MCG and 3MCA on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex of young rats. Considering that pathophysiology of this disorder is poorly known, in this present work we investigated the role of 3MCG and 3MCA on important parameters of oxidative stress in cortex cerebral of young rats. Our results show that 3MCG and 3MCA increased thiobarbituric acid-reactive species (TBA-RS) and carbonyl formation, indicating that these compounds provoke lipid and protein oxidation, respectively. Furthermore, 3MCG-induced elevation of TBA-RS were prevented by melatonin and trolox (soluble α-tocopherol), indicating that these effects were due to reactive species. Considering that the nitric oxide inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) did not alter lipid oxidation and that nitric oxide production was not affected by 3MCG, it is presumed that reactive oxygen species were involved in these effects. In contrast, reduced glutathione (GSH) levels and sulfhydryl oxidation were not changed by 3MCG and 3MCA. Similarly, the activity of important antioxidants enzymes such as glutathione peroxidase, catalase, superoxide dismutase and glutathione reductase were not altered by 3MCG. The present data demonstrate that metabolites accumulating in 3MCCD induce lipid and protein oxidative damage that may be involved, at least in part, in the pathophysiology of the brain abnormalities found in this disorder.

A doença do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio neurometabólico causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos severos, tais como coma e convulsões, bem como edema e atrofia cerebral. Os compostos que se acumulam em maiores concentrações na DXB são o ácido α-cetoisocapróico (CIC), o ácido α- hidroxiisovalérico (HIV) e a leucina (Leu). Considerando que os mecanismos neurotóxicos na DXB não estão completamente esclarecidos, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito in vitro do CIC, HIV e Leu sobre diferentes parâmetros da função em cérebro de ratos jovens, no intuito de verificar alterações que possam esclarecer os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentados pelos pacientes. Foram analisados os parâmetros respiratórios estados 3 e 4, a razão de controle respiratório (RCR) e a razão ADP/O medidos pelo consumo do oxigênio, o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial, o inchamento mitocondrial, além da atividade das enzimas do ciclo do ácido cítrico α-cetoglutarato desidrogenase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase e succinato desidrogenase. Os experimentos realizaram-se na presença de 1 mM e 5 mM de CIC, HIV ou Leu e os substratos respiratórios utilizados foram glutamato/malato (2,5 mM cada), succinato (5 mM) e α-cetoglutarato (5 mM). Observamos que o CIC aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu o RCR com todos os substratos utilizados. Foi também observado que o CIC e a Leu diminuíram o estado 3 da respiração mitocondrial quando foi utilizado α-cetoglutarato como substrato, enquanto que o HIV não modificou nenhum parâmetro respiratório testado. Além disso, o CIC provocou uma redução na razão ADP/O e uma diminuição nos níveis de NAD(P)H mitocondrial utilizando os substratos ligados ao NADH glutamato/malato e α-cetoglutarato. O CIC e a Leu também causaram uma leve redução no ΔΨm quando α-cetoglutarato foi o substrato. Foi também observada uma inibição da atividade da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelo CIC, enquanto que o HIV e a Leu não alteraram a atividade de nenhuma das enzimas estudadas. Por último, os metabólitos testados não foram capazes de induzir o inchamento mitocondrial. Nossos resultados indicam que o CIC, seguido da Leu, sendo estes os compostos que mais se acumulam na DXB, atingindo concentrações plasmáticas de 5 mM, prejudicam a homeostase mitocondrial em cérebro de ratos. Caso os presentes resultados possam ser extrapolados para a condição humana, presume-se que a disfunção mitocondrial pode estar envolvida no dano cerebral observado em pacientes portadores da DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a neurometabolic disorder caused by a deficiency of the mitochondrial enzyme complex branched-chain L-2-keto acid dehydrogenase activity. The affected patients present severe neurological symptoms, such as coma and seizures, as well as edema and cerebral atrophy. The compounds that accumulate in higher concentrations in MSUD are α-ketoisocaproic (KIC), α- hydroxyisovaleric (HIV) e leucine (Leu). Considering that the neurotoxic mechanisms in MSUD are not well established, the purpose of the present study was to investigate the in vitro effect of KIC, HIV and Leu on various parameters of the mitochondrial bioenergetics in brain of young rats, in order to verify alterations that could explain the responsible mechanisms by the brain damage found in MSUD patients. It was analysed the respiratory parameters states 3 and 4, the respiratory control ratio (RCR) and the ADP/O ratio measured by oxygen consumption, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm), the mitochondrial matrix content of NAD(P)H, the mitochondrial swelling, besides the citric acid cycle enzymes activity α-ketoglutarate dehydrogenase, citrate sinthase, isocitrate dehydrogenase, malate dehydrogenase e succinate dehydrogenase. The experiments were performed in the presence of 1 mM and 5 mM of CIC, HIV and Leu and the respiratory substrates used were glutamate/malate (2,5 mM each), succinate (5 mM) e α-ketoglutarate (5 mM). We observed that KIC increased state 4 respiration and decreased RCR with all the substrates used. It was also observed that KIC and Leu decreased state 3 respiration using α-ketoglutarate as substrate, whereas HIV did not modify any respiratory parameter tested. Furthermore, KIC provoked a reduction in the ADP/O ratio and a decrease in NAD(P)H mitochondrial levels using the NADH-linked substrates glutamate/malate and α- ketoglutarate. KIC and Leu also caused a mild reduction in the ΔΨm when α-ketoglutarate was the substrate. It was also observed an inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity provoked by KIC, whereas HIV and Leu did not alter any enzymatic activities studied. Finally, the metabolites tested were not able to inducing mitochondrial swelling. Our results indicate that KIC, followed by Leu, the compounds that most accumulate in DXB, reaching plasma concentrations of 5 mM, impaired the mitochondrial homeostasis in brain of rats. In the case of the present data be extrapolated to human conditions, it may be presumed that the mitochondrial dysfunction might be involved in the brain damage observed in MSUD patients.

A doença da urina do xarope do bordo é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade do complexo enzimático da desidrogenase de α- cetoácidos de cadeia ramificada. Distúrbios neurológicos são comuns em pacientes com esta doença. Apesar de a leucina ser considerada o principal metabolito tóxico, os mecanismos envolvidos na neuropatologia das lesões cerebrais não são bem entendidos. No presente estudo, avaliou-se o possível efeito preventivo da coadministração de creatina e piruvato sobre os efeitos provocados pela administração de leucina a ratas Wistar durante a gestação e lactação sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, bem como sobre as atividades de certas enzimas envolvidas na rede de fosforiltransferência no córtex cerebral e no hipocampo da prole aos 21 dias de idade. A administração de leucina induziu o estresse oxidativo e alterou as atividades das enzimas piruvatocinase, adenilatocinase, creatinacinase citosólica e mitocondrial. A coadministração de creatina e piruvato foi parcialmente eficaz na prevenção de algumas alterações provocadas pela administração de leucina sobre o estresse oxidativo, mas não nas enzimas da rede de fosforiltransferência. Estes resultados sugerem que a hiperleucinemia materna não tratada pode ser tóxica para o cérebro da prole. / Maple Syrup Urine Disease is an inborn error of metabolism caused by severe deficiency in the activity of branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex. Neurological disorders are common in patients with this disease. Although leucine is considered the main toxic metabolite, the mechanisms underlying the neuropathology of brain injury are poorly understood. In the present study, we evaluated the possible preventive effect of the co-administration of creatine plus pyruvate on the effects elicited by leucine administration to female Wistar rats during pregnancy and lactation on some oxidative stress parameters as well as the activities of some enzymes involved in the phosphoryltransfer network in the cerebral cortex and hippocampus of the offspring at 21 days of age. Leucine administration induced oxidative stress and altered the enzymes activities of pyruvate kinase, adenylate kinase, mitochondrial and cytosolic creatine kinase. Co-administration of creatine plus pyruvate was partially effective in the prevention of some alterations provoked by leucine administration on the oxidative stress but not in the enzymes of phosphoryltransfer network. These results suggest that non-treated maternal hyperleucinemia may be toxic to the brain of the offspring.

A doença do xarope do bordo é causada pela deficiência na atividade do complexo desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada, levando ao acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada leucina, isoleucina e valina e de seus α- cetoácidos correspondentes nos tecidos e fluidos corporais. Os pacientes podem apresentar atraso no desenvolvimento psicomotor e retardo mental. A patofisiologia da doença não é bem compreendida, contudo, o acúmulo do metabólito tóxico leucina induz alterações metabólicas associadas aos sintomas clínicos. Além disso, a capacidade antioxidante está reduzida nestes pacientes. Creatina, piruvato e taurina são potentes antioxidantes em sistemas biológicos e protegem a célula contra os danos causados pelo estresse oxidativo. Portanto, neste estudo, investigamos os efeitos da administração de leucina e da coadministração de creatina mais piruvato e de taurina em alguns parâmetros da rede de fosforiltransferência e de estresse oxidativo em córtex e hipocampo de ratos. A administração de leucina induziu estresse oxidativo com o aumento de radicais livres, e diminuiu a atividade das enzimas piruvato cinase, adenilato cinase, hexocinase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, creatina cinase citosólica e creatina cinase mitocondrial. A coadministração de creatina mais piruvato e de taurina foi capaz de prevenir as alterações causadas pela administração de leucina sobre o estresse oxidativo e as enzimas tiólicas da rede de fosforiltransferência. As correlações significativas entre alguns parâmetros de estresse oxidativo e as enzimas da rede de fosforiltranferência sugerem que a diminuição na atividade das enzimas ocorre devido ao aumento das espécies reativas. Portanto, é possível sugerir que os efeitos nocivos que a leucina causa no cérebro possa contribuir para a disfunção neurológica observada em pacientes com a doença do xarope do bordo, e é possível que a suplementação com creatina, piruvato e taurina possa ser benéfica a estes pacientes. / Maple Syrup Urine Disease is caused by the deficiency of branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex activity leading to accumulation of the branched-chain amino acids leucine, isoleucine and valine and their corresponding branched-chain α-keto acids in tissues and body fluids. The affected patients may present psychomotor development delay and mental retardation. The pathophysiology of this disease is not entirely understood. However, the accumulation of toxic metabolite leucine induces profound metabolic alterations and impairment of energy homeostasis associated with clinical symptoms. Moreover, the antioxidant capacity is decreased in these patients. Creatine, pyruvate, and taurine plays a critical role in brain function and are potent antioxidants in biological systems, contributing to cellular protection against oxidative stress. In this study, we investigated the effects of leucine administration and coadministration of creatine plus pyruvate and taurine on some parameters of phosphoryl transfer network and oxidative stress in cerebral cortex and hippocampus of rats. Leucine-induced oxidative stress and diminished the activities of pyruvate kinase, adenylate kinase, hexokinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, cytosolic creatine kinase, and mitochondrial creatine kinase. Coadministration of creatine plus pyruvate and taurine prevented the alterations provoked by leucine administration on the oxidative stress and the thiol-containing enzymes of phosphoryl transfer network. Significant correlations between some parameters of oxidative stress and the enzymes of the phosphoryl transfer network suggest that the diminution of the enzymes activities is possible due to increase in free radicals. It is possible that these effects of leucine may contribute to the neurological dysfunction observed in patients affected by Maple Syrup Urine Disease. In this case, it is possible that creatine plus pyruvate and taurine supplementation could benefit to the patients.