A doença do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio neurometabólico causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos severos, tais como coma e convulsões, bem como edema e atrofia cerebral. Os compostos que se acumulam em maiores concentrações na DXB são o ácido α-cetoisocapróico (CIC), o ácido α- hidroxiisovalérico (HIV) e a leucina (Leu). Considerando que os mecanismos neurotóxicos na DXB não estão completamente esclarecidos, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito in vitro do CIC, HIV e Leu sobre diferentes parâmetros da função em cérebro de ratos jovens, no intuito de verificar alterações que possam esclarecer os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentados pelos pacientes. Foram analisados os parâmetros respiratórios estados 3 e 4, a razão de controle respiratório (RCR) e a razão ADP/O medidos pelo consumo do oxigênio, o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial, o inchamento mitocondrial, além da atividade das enzimas do ciclo do ácido cítrico α-cetoglutarato desidrogenase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase e succinato desidrogenase. Os experimentos realizaram-se na presença de 1 mM e 5 mM de CIC, HIV ou Leu e os substratos respiratórios utilizados foram glutamato/malato (2,5 mM cada), succinato (5 mM) e α-cetoglutarato (5 mM). Observamos que o CIC aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu o RCR com todos os substratos utilizados. Foi também observado que o CIC e a Leu diminuíram o estado 3 da respiração mitocondrial quando foi utilizado α-cetoglutarato como substrato, enquanto que o HIV não modificou nenhum parâmetro respiratório testado. Além disso, o CIC provocou uma redução na razão ADP/O e uma diminuição nos níveis de NAD(P)H mitocondrial utilizando os substratos ligados ao NADH glutamato/malato e α-cetoglutarato. O CIC e a Leu também causaram uma leve redução no ΔΨm quando α-cetoglutarato foi o substrato. Foi também observada uma inibição da atividade da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelo CIC, enquanto que o HIV e a Leu não alteraram a atividade de nenhuma das enzimas estudadas. Por último, os metabólitos testados não foram capazes de induzir o inchamento mitocondrial. Nossos resultados indicam que o CIC, seguido da Leu, sendo estes os compostos que mais se acumulam na DXB, atingindo concentrações plasmáticas de 5 mM, prejudicam a homeostase mitocondrial em cérebro de ratos. Caso os presentes resultados possam ser extrapolados para a condição humana, presume-se que a disfunção mitocondrial pode estar envolvida no dano cerebral observado em pacientes portadores da DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a neurometabolic disorder caused by a deficiency of the mitochondrial enzyme complex branched-chain L-2-keto acid dehydrogenase activity. The affected patients present severe neurological symptoms, such as coma and seizures, as well as edema and cerebral atrophy. The compounds that accumulate in higher concentrations in MSUD are α-ketoisocaproic (KIC), α- hydroxyisovaleric (HIV) e leucine (Leu). Considering that the neurotoxic mechanisms in MSUD are not well established, the purpose of the present study was to investigate the in vitro effect of KIC, HIV and Leu on various parameters of the mitochondrial bioenergetics in brain of young rats, in order to verify alterations that could explain the responsible mechanisms by the brain damage found in MSUD patients. It was analysed the respiratory parameters states 3 and 4, the respiratory control ratio (RCR) and the ADP/O ratio measured by oxygen consumption, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm), the mitochondrial matrix content of NAD(P)H, the mitochondrial swelling, besides the citric acid cycle enzymes activity α-ketoglutarate dehydrogenase, citrate sinthase, isocitrate dehydrogenase, malate dehydrogenase e succinate dehydrogenase. The experiments were performed in the presence of 1 mM and 5 mM of CIC, HIV and Leu and the respiratory substrates used were glutamate/malate (2,5 mM each), succinate (5 mM) e α-ketoglutarate (5 mM). We observed that KIC increased state 4 respiration and decreased RCR with all the substrates used. It was also observed that KIC and Leu decreased state 3 respiration using α-ketoglutarate as substrate, whereas HIV did not modify any respiratory parameter tested. Furthermore, KIC provoked a reduction in the ADP/O ratio and a decrease in NAD(P)H mitochondrial levels using the NADH-linked substrates glutamate/malate and α- ketoglutarate. KIC and Leu also caused a mild reduction in the ΔΨm when α-ketoglutarate was the substrate. It was also observed an inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity provoked by KIC, whereas HIV and Leu did not alter any enzymatic activities studied. Finally, the metabolites tested were not able to inducing mitochondrial swelling. Our results indicate that KIC, followed by Leu, the compounds that most accumulate in DXB, reaching plasma concentrations of 5 mM, impaired the mitochondrial homeostasis in brain of rats. In the case of the present data be extrapolated to human conditions, it may be presumed that the mitochondrial dysfunction might be involved in the brain damage observed in MSUD patients.

A disfunção neurológica é um sintoma comum em pacientes com Doença do Xarope do Bordo. Entretanto, os mecanismos que levam à neuropatologia dessa doença são pouco conhecidos. Neste trabalho, nós investigamos os efeitos do ácido α-cetoisocapróico (CIC) na incorporação in vitro de proteínas do tipo filamento intermediário de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de tecido de ratos de 09, 12, 15, 17, 21 e 60 dias foram incubadas com 32P-ortofosfato na presença ou na ausência de CIC. A fração citoesquelética foi isolada e a radioatividade incorporada nas proteínas de filamento intermediário foi medida. Nós observamos que o CIC diminui a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas até 12 dias, entretanto, a fosforilação aumentou nas fatias de tecido de ratos de 17, 21 e 60 dias e nenhuma alteração ocorreu nas fatias cerebrais dos animais de 15 dias. Nós também testamos a influência do sistema glutamatérgico na incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas, incubando fatias de córtex cerebral na presença de glutamato, agonistas e antagonistas glutamatérgicos. O glutamato apresentou um efeito similar ao observado para o CIC na fosforilação das proteínas de filamento intermediário durante o desenvolvimento, mas não afetou a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas nos ratos de 60 dias, sugerindo que nos animais adultos o CIC aumenta a incorporação in vitro nas proteínas estudadas por outros mecanismos. Além disso, nós observamos que os agonistas glutamatérgicos ionotrópicos NMDA, AMPA e cainato mimetizam o efeito inibitório do CIC, enquanto os agonistas metabotrópicos 1S, 3R ACPD e L-AP4 não induziram alterações na incorporação in vitro de 32P nas proteínas de filamento intermediário estudadas nos animais de 09 dias. Nos ratos de 21 dias, somente os agonistas ionotrópicos NMDA e AMPA mimetizaram o efeito estimulatório do CIC. Também observamos que quando fatias de córtex cerebral de ratos de 09 e 21 dias foram incubadas com 1mM CIC seguidas de incubação com o DL-AP5, um antagonista específico para receptores NMDA, ou com CNQX, antagonista de receptores ionotrópicos AMPA e cainato, o efeito inibitório ou estimulatório do ácido na fosforilação in vitro de ratos de 09 e 21 dias foi revertido. Estes resultados demonstram que o CIC, nas mesmas concentrações encontradas no sangue de crianças afetadas por DXB, altera o sistema de fosforilação associado com as proteínas do citoesqueleto, via sistema glutamatérgico, de maneira regulada pelo desenvolvimento. Portanto, é provável que a alteração de fosforilação das proteínas de citoesqueleto cerebral seja importante para o entendimento da patofisiologia da disfunção neuronal e das alterações estruturais observadas do SNC dos pacientes com DXB.

A doença do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio neurometabólico causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos severos, tais como coma e convulsões, bem como edema e atrofia cerebral. Os compostos que se acumulam em maiores concentrações na DXB são o ácido α-cetoisocapróico (CIC), o ácido α- hidroxiisovalérico (HIV) e a leucina (Leu). Considerando que os mecanismos neurotóxicos na DXB não estão completamente esclarecidos, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito in vitro do CIC, HIV e Leu sobre diferentes parâmetros da função em cérebro de ratos jovens, no intuito de verificar alterações que possam esclarecer os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentados pelos pacientes. Foram analisados os parâmetros respiratórios estados 3 e 4, a razão de controle respiratório (RCR) e a razão ADP/O medidos pelo consumo do oxigênio, o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial, o inchamento mitocondrial, além da atividade das enzimas do ciclo do ácido cítrico α-cetoglutarato desidrogenase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase e succinato desidrogenase. Os experimentos realizaram-se na presença de 1 mM e 5 mM de CIC, HIV ou Leu e os substratos respiratórios utilizados foram glutamato/malato (2,5 mM cada), succinato (5 mM) e α-cetoglutarato (5 mM). Observamos que o CIC aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu o RCR com todos os substratos utilizados. Foi também observado que o CIC e a Leu diminuíram o estado 3 da respiração mitocondrial quando foi utilizado α-cetoglutarato como substrato, enquanto que o HIV não modificou nenhum parâmetro respiratório testado. Além disso, o CIC provocou uma redução na razão ADP/O e uma diminuição nos níveis de NAD(P)H mitocondrial utilizando os substratos ligados ao NADH glutamato/malato e α-cetoglutarato. O CIC e a Leu também causaram uma leve redução no ΔΨm quando α-cetoglutarato foi o substrato. Foi também observada uma inibição da atividade da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelo CIC, enquanto que o HIV e a Leu não alteraram a atividade de nenhuma das enzimas estudadas. Por último, os metabólitos testados não foram capazes de induzir o inchamento mitocondrial. Nossos resultados indicam que o CIC, seguido da Leu, sendo estes os compostos que mais se acumulam na DXB, atingindo concentrações plasmáticas de 5 mM, prejudicam a homeostase mitocondrial em cérebro de ratos. Caso os presentes resultados possam ser extrapolados para a condição humana, presume-se que a disfunção mitocondrial pode estar envolvida no dano cerebral observado em pacientes portadores da DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a neurometabolic disorder caused by a deficiency of the mitochondrial enzyme complex branched-chain L-2-keto acid dehydrogenase activity. The affected patients present severe neurological symptoms, such as coma and seizures, as well as edema and cerebral atrophy. The compounds that accumulate in higher concentrations in MSUD are α-ketoisocaproic (KIC), α- hydroxyisovaleric (HIV) e leucine (Leu). Considering that the neurotoxic mechanisms in MSUD are not well established, the purpose of the present study was to investigate the in vitro effect of KIC, HIV and Leu on various parameters of the mitochondrial bioenergetics in brain of young rats, in order to verify alterations that could explain the responsible mechanisms by the brain damage found in MSUD patients. It was analysed the respiratory parameters states 3 and 4, the respiratory control ratio (RCR) and the ADP/O ratio measured by oxygen consumption, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm), the mitochondrial matrix content of NAD(P)H, the mitochondrial swelling, besides the citric acid cycle enzymes activity α-ketoglutarate dehydrogenase, citrate sinthase, isocitrate dehydrogenase, malate dehydrogenase e succinate dehydrogenase. The experiments were performed in the presence of 1 mM and 5 mM of CIC, HIV and Leu and the respiratory substrates used were glutamate/malate (2,5 mM each), succinate (5 mM) e α-ketoglutarate (5 mM). We observed that KIC increased state 4 respiration and decreased RCR with all the substrates used. It was also observed that KIC and Leu decreased state 3 respiration using α-ketoglutarate as substrate, whereas HIV did not modify any respiratory parameter tested. Furthermore, KIC provoked a reduction in the ADP/O ratio and a decrease in NAD(P)H mitochondrial levels using the NADH-linked substrates glutamate/malate and α- ketoglutarate. KIC and Leu also caused a mild reduction in the ΔΨm when α-ketoglutarate was the substrate. It was also observed an inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity provoked by KIC, whereas HIV and Leu did not alter any enzymatic activities studied. Finally, the metabolites tested were not able to inducing mitochondrial swelling. Our results indicate that KIC, followed by Leu, the compounds that most accumulate in DXB, reaching plasma concentrations of 5 mM, impaired the mitochondrial homeostasis in brain of rats. In the case of the present data be extrapolated to human conditions, it may be presumed that the mitochondrial dysfunction might be involved in the brain damage observed in MSUD patients.

A doença do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio neurometabólico causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos severos, tais como coma e convulsões, bem como edema e atrofia cerebral. Os compostos que se acumulam em maiores concentrações na DXB são o ácido α-cetoisocapróico (CIC), o ácido α- hidroxiisovalérico (HIV) e a leucina (Leu). Considerando que os mecanismos neurotóxicos na DXB não estão completamente esclarecidos, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito in vitro do CIC, HIV e Leu sobre diferentes parâmetros da função em cérebro de ratos jovens, no intuito de verificar alterações que possam esclarecer os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentados pelos pacientes. Foram analisados os parâmetros respiratórios estados 3 e 4, a razão de controle respiratório (RCR) e a razão ADP/O medidos pelo consumo do oxigênio, o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial, o inchamento mitocondrial, além da atividade das enzimas do ciclo do ácido cítrico α-cetoglutarato desidrogenase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase e succinato desidrogenase. Os experimentos realizaram-se na presença de 1 mM e 5 mM de CIC, HIV ou Leu e os substratos respiratórios utilizados foram glutamato/malato (2,5 mM cada), succinato (5 mM) e α-cetoglutarato (5 mM). Observamos que o CIC aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu o RCR com todos os substratos utilizados. Foi também observado que o CIC e a Leu diminuíram o estado 3 da respiração mitocondrial quando foi utilizado α-cetoglutarato como substrato, enquanto que o HIV não modificou nenhum parâmetro respiratório testado. Além disso, o CIC provocou uma redução na razão ADP/O e uma diminuição nos níveis de NAD(P)H mitocondrial utilizando os substratos ligados ao NADH glutamato/malato e α-cetoglutarato. O CIC e a Leu também causaram uma leve redução no ΔΨm quando α-cetoglutarato foi o substrato. Foi também observada uma inibição da atividade da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelo CIC, enquanto que o HIV e a Leu não alteraram a atividade de nenhuma das enzimas estudadas. Por último, os metabólitos testados não foram capazes de induzir o inchamento mitocondrial. Nossos resultados indicam que o CIC, seguido da Leu, sendo estes os compostos que mais se acumulam na DXB, atingindo concentrações plasmáticas de 5 mM, prejudicam a homeostase mitocondrial em cérebro de ratos. Caso os presentes resultados possam ser extrapolados para a condição humana, presume-se que a disfunção mitocondrial pode estar envolvida no dano cerebral observado em pacientes portadores da DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a neurometabolic disorder caused by a deficiency of the mitochondrial enzyme complex branched-chain L-2-keto acid dehydrogenase activity. The affected patients present severe neurological symptoms, such as coma and seizures, as well as edema and cerebral atrophy. The compounds that accumulate in higher concentrations in MSUD are α-ketoisocaproic (KIC), α- hydroxyisovaleric (HIV) e leucine (Leu). Considering that the neurotoxic mechanisms in MSUD are not well established, the purpose of the present study was to investigate the in vitro effect of KIC, HIV and Leu on various parameters of the mitochondrial bioenergetics in brain of young rats, in order to verify alterations that could explain the responsible mechanisms by the brain damage found in MSUD patients. It was analysed the respiratory parameters states 3 and 4, the respiratory control ratio (RCR) and the ADP/O ratio measured by oxygen consumption, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm), the mitochondrial matrix content of NAD(P)H, the mitochondrial swelling, besides the citric acid cycle enzymes activity α-ketoglutarate dehydrogenase, citrate sinthase, isocitrate dehydrogenase, malate dehydrogenase e succinate dehydrogenase. The experiments were performed in the presence of 1 mM and 5 mM of CIC, HIV and Leu and the respiratory substrates used were glutamate/malate (2,5 mM each), succinate (5 mM) e α-ketoglutarate (5 mM). We observed that KIC increased state 4 respiration and decreased RCR with all the substrates used. It was also observed that KIC and Leu decreased state 3 respiration using α-ketoglutarate as substrate, whereas HIV did not modify any respiratory parameter tested. Furthermore, KIC provoked a reduction in the ADP/O ratio and a decrease in NAD(P)H mitochondrial levels using the NADH-linked substrates glutamate/malate and α- ketoglutarate. KIC and Leu also caused a mild reduction in the ΔΨm when α-ketoglutarate was the substrate. It was also observed an inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity provoked by KIC, whereas HIV and Leu did not alter any enzymatic activities studied. Finally, the metabolites tested were not able to inducing mitochondrial swelling. Our results indicate that KIC, followed by Leu, the compounds that most accumulate in DXB, reaching plasma concentrations of 5 mM, impaired the mitochondrial homeostasis in brain of rats. In the case of the present data be extrapolated to human conditions, it may be presumed that the mitochondrial dysfunction might be involved in the brain damage observed in MSUD patients.

A disfunção neurológica é um sintoma comum em pacientes com Doença do Xarope do Bordo. Entretanto, os mecanismos que levam à neuropatologia dessa doença são pouco conhecidos. Neste trabalho, nós investigamos os efeitos do ácido α-cetoisocapróico (CIC) na incorporação in vitro de proteínas do tipo filamento intermediário de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de tecido de ratos de 09, 12, 15, 17, 21 e 60 dias foram incubadas com 32P-ortofosfato na presença ou na ausência de CIC. A fração citoesquelética foi isolada e a radioatividade incorporada nas proteínas de filamento intermediário foi medida. Nós observamos que o CIC diminui a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas até 12 dias, entretanto, a fosforilação aumentou nas fatias de tecido de ratos de 17, 21 e 60 dias e nenhuma alteração ocorreu nas fatias cerebrais dos animais de 15 dias. Nós também testamos a influência do sistema glutamatérgico na incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas, incubando fatias de córtex cerebral na presença de glutamato, agonistas e antagonistas glutamatérgicos. O glutamato apresentou um efeito similar ao observado para o CIC na fosforilação das proteínas de filamento intermediário durante o desenvolvimento, mas não afetou a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas nos ratos de 60 dias, sugerindo que nos animais adultos o CIC aumenta a incorporação in vitro nas proteínas estudadas por outros mecanismos. Além disso, nós observamos que os agonistas glutamatérgicos ionotrópicos NMDA, AMPA e cainato mimetizam o efeito inibitório do CIC, enquanto os agonistas metabotrópicos 1S, 3R ACPD e L-AP4 não induziram alterações na incorporação in vitro de 32P nas proteínas de filamento intermediário estudadas nos animais de 09 dias. Nos ratos de 21 dias, somente os agonistas ionotrópicos NMDA e AMPA mimetizaram o efeito estimulatório do CIC. Também observamos que quando fatias de córtex cerebral de ratos de 09 e 21 dias foram incubadas com 1mM CIC seguidas de incubação com o DL-AP5, um antagonista específico para receptores NMDA, ou com CNQX, antagonista de receptores ionotrópicos AMPA e cainato, o efeito inibitório ou estimulatório do ácido na fosforilação in vitro de ratos de 09 e 21 dias foi revertido. Estes resultados demonstram que o CIC, nas mesmas concentrações encontradas no sangue de crianças afetadas por DXB, altera o sistema de fosforilação associado com as proteínas do citoesqueleto, via sistema glutamatérgico, de maneira regulada pelo desenvolvimento. Portanto, é provável que a alteração de fosforilação das proteínas de citoesqueleto cerebral seja importante para o entendimento da patofisiologia da disfunção neuronal e das alterações estruturais observadas do SNC dos pacientes com DXB.

A disfunção neurológica é um sintoma comum em pacientes com Doença do Xarope do Bordo. Entretanto, os mecanismos que levam à neuropatologia dessa doença são pouco conhecidos. Neste trabalho, nós investigamos os efeitos do ácido α-cetoisocapróico (CIC) na incorporação in vitro de proteínas do tipo filamento intermediário de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de tecido de ratos de 09, 12, 15, 17, 21 e 60 dias foram incubadas com 32P-ortofosfato na presença ou na ausência de CIC. A fração citoesquelética foi isolada e a radioatividade incorporada nas proteínas de filamento intermediário foi medida. Nós observamos que o CIC diminui a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas até 12 dias, entretanto, a fosforilação aumentou nas fatias de tecido de ratos de 17, 21 e 60 dias e nenhuma alteração ocorreu nas fatias cerebrais dos animais de 15 dias. Nós também testamos a influência do sistema glutamatérgico na incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas, incubando fatias de córtex cerebral na presença de glutamato, agonistas e antagonistas glutamatérgicos. O glutamato apresentou um efeito similar ao observado para o CIC na fosforilação das proteínas de filamento intermediário durante o desenvolvimento, mas não afetou a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas nos ratos de 60 dias, sugerindo que nos animais adultos o CIC aumenta a incorporação in vitro nas proteínas estudadas por outros mecanismos. Além disso, nós observamos que os agonistas glutamatérgicos ionotrópicos NMDA, AMPA e cainato mimetizam o efeito inibitório do CIC, enquanto os agonistas metabotrópicos 1S, 3R ACPD e L-AP4 não induziram alterações na incorporação in vitro de 32P nas proteínas de filamento intermediário estudadas nos animais de 09 dias. Nos ratos de 21 dias, somente os agonistas ionotrópicos NMDA e AMPA mimetizaram o efeito estimulatório do CIC. Também observamos que quando fatias de córtex cerebral de ratos de 09 e 21 dias foram incubadas com 1mM CIC seguidas de incubação com o DL-AP5, um antagonista específico para receptores NMDA, ou com CNQX, antagonista de receptores ionotrópicos AMPA e cainato, o efeito inibitório ou estimulatório do ácido na fosforilação in vitro de ratos de 09 e 21 dias foi revertido. Estes resultados demonstram que o CIC, nas mesmas concentrações encontradas no sangue de crianças afetadas por DXB, altera o sistema de fosforilação associado com as proteínas do citoesqueleto, via sistema glutamatérgico, de maneira regulada pelo desenvolvimento. Portanto, é provável que a alteração de fosforilação das proteínas de citoesqueleto cerebral seja importante para o entendimento da patofisiologia da disfunção neuronal e das alterações estruturais observadas do SNC dos pacientes com DXB.