Das Ceramid Transfer Protein (CERT) ist einer der geschwindigkeitsbestimmenden Proteine in der de novo Biosynthese von Sphingomyelin. Es ist verantwortlich für den nicht-vesikulären Transfer von Ceramid vom Endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat. Die Inhibition von CERT wird als potenzielle Behandlung für Krankheiten wie Infektionen, Krebs oder Gain-of-Function-Mutationen des CERT Gens diskutiert. Kürzlich, wurde Lomitapide als potenter Inhibitor des CERT-vermittelten intermembran-Transfers identifiziert. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Synthese von Lomitapide Derivaten mit verbesserter Wirksamkeit und Selektivität präsentiert. Die synthetisierten Analoga wurden in vitro mithilfe eines liposomalen Transferassays auf ihre Inhibition der CERT-Transferaktivität getestet. Zusätzlich konnte durch die Messung des Ceramid-Sphingomyelin-Verhältnisses nach Inhibitor Behandlung die Aktivität in cellulo bestätigt werden. Die Selektivität gegenüber dem Mikrosomalen Triglycerid Transfer Protein (MTP) wurde durch Messung der MTP-vermittelten Sekretion von apoB ermittelt. Unter den synthetisierten Analoga zeigten einige verbesserte CERT-Transfer Inhibition und niedrigere Inhibition der apoB Sekretion, sogar bei fünffacher Konzentration verglichen mit Lomitapide. Obwohl die Bewertung der biologischen Aktivität noch im Gange ist, wurde eine vorläufige Struktur-Aktivitäts-Beziehung etabliert. Es wurden strukturelle Bestandteile identifiziert, die wichtig für die CERT-Inhibition sind und andere welche variabel sind, um die Wirksamkeit und Selektivität in Zukunft noch weiter zu steigern. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Synthese von Lomitapide-basierten proteolysis targeting chimeras (PROTACs) für CERT. PROTACs haben sich im letzten Jahrzehnt zu einem vielversprechenden therapeutischen Ansatz entwickelt und mehrere potenzielle Wirkstoffe hervorgebracht. PROTACs sind heterobifunktionale Moleküle, die sich den zellulären Weg der Proteinzersetzung zunutze machen, indem sie das gewünschte Protein zur Zersetzung markieren. Es wurde eine erste Serie von CERT PROTACs mit vielversprechender Abbauwirkung synthetisiert, welche eine bevorzugte Zersetzung von CERT aber nicht CERTL andeuten. CERTL ist eine längere Spleiß-Variante, welche vornehmlich im Herz, Gehirn und den Skelettmuskeln exprimiert wird. Eine zweite Serie von PROTACs mit variierter Linker Kettenlänge wurde synthetisiert. Untersuchung des Einflusses auf die apoB Sekretion aus HepG2 Zellen zeigte sogar bei 50-facher Konzentration einen niedrigeren Einfluss auf diese als Lomitapide. / The ceramide transfer protein (CERT) is one of the rate-limiting proteins in the de novo biosynthesis of sphingomyelin, facilitating the non-vesicular transfer of ceramide from the Endoplasmic Reticulum to the Golgi-apparatus. Inhibition of CERT has been proposed as a potential treatment for pathogenesis like infectious diseases, cancer, or disease-causing gain-of-function mutations within the CERT gene. Recently Lomitapide has been identified as a potent inhibitor of CERT-mediated intermembrane transfer. In the first part of this thesis, the synthesis of Lomitapide derivatives with improved potency and selectivity is presented. The synthesized analogs were tested in vitro for their inhibition of CERT-transfer using a liposomal transfer assay. Additionally, the activity could be confirmed in cellulo by monitoring the ceramide-sphingomyelin-ratio after inhibitor treatment. Selectivity against the microsomal triglyceride transfer protein (MTP) has been determined by monitoring the MTP-mediated cellular secretion of apoB. Among the synthesized analogs, several showed improved CERT-transfer inhibition and lower inhibition of apoB secretion even at five-fold higher concentrations compared to Lomitapide. Although the biological evaluation is still underway, a preliminary structure-activity-relationship has been established and identified structural motifs important for CERT inhibition and modifiable moieties to increase potency and selectivity even further in the future. The second part of the thesis describes the synthesis of Lomitapide-based proteolysis targeting chimeras (PROTACs) for CERT. PROTACs have evolved in the last decade as a promising therapeutic technique and resulted in the development of several drugs which are currently in clinical trials. PROTACs are heterobifunctional small molecules that mediate the degradation of the target protein by hijacking the cellular proteasomal pathway. A first series of synthesized CERT PROTACs showed promising preliminary results for CERT degrader activity and indicated a preferred degradation of CERT over CERTL, a longer splicing variant expressed in the heart, brain, and skeletal muscles. Motivated by this a second generation of PROTACs with varying linker chain lengths was synthesized. Investigation of their inhibition of apoB secretion from HepG2 cells revealed lower activity on secretion than Lomitapide even at 50-fold concentrations for a set of CERT PROTACs.

Endozytose erfordert hohe Membrankrümmung und führt zu Flächenänderungen der Membranhälften. Dies kann durch eine Oberflächendifferenz zwischen den Schichten initiiert werden, die durch geänderte Lipidzusammensetzungen hervorgerufen werden kann. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass Lipid-Transporter zu Beginn der Endozytose für veränderte Flächenverhältnisse verantwortlich sind. Um den Einfluss veränderter Flächen auf Endozytose zu untersuchen, wurden die Oberflächenverhältnisse der Membran durch Zugabe von Phospholipiden verändert und anschließend Endozytose gemessen. Abhängig von der Sorte wurden die Lipide nur in die äußere Schicht eingebaut oder auch auf die innere Seite transportiert, wodurch die entsprechende Seite vergrößert wurde. Die Zugabe verschiedener Aminophospholipide, die auf die innere Membranseite transportiert werden, führte zu gesteigerter „bulk flow“ Endocytose in K562-Zellen. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Clathrin-vermittelte Endozytose von Hep2-Zellen ebenfalls stimuliert wurde. Umgekehrt hatte die Zugabe von Lipiden, die auf der äußeren Hälfte bleiben, reduzierte „bulk flow“- oder Clathrin-vermittelte Endozytose in verschiedenen Zelllinien zur Folge. Bemerkenswert ist, dass auch Clathrin-vermittelte Endozytose durch die Lipidzugabe beeinflusst wurde, obwohl gerade in diesem Weg viele Proteine involviert sind, die Krümmung induzieren können. Dies passt zu einem neuen Modell wie Lipidtransporter in Endozytose involviert sind. Durch den Transport von Lipiden und die zusätzliche Interaktion mit Endozytoseproteinen, könnten diese Transporter zwei Mechanismen zur Erzeugung von Krümmung miteinander verbinden: Membrankrümmung induziert durch eine Flächenasymmetrie zwischen den Membranhälften und durch Wechselwirkung mit Proteinen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die für Endozytose notwendige Krümmung durch die durch Lipidtransport induzierte Flächenasymmetrie der Membranschichten unterstützt wird. / Endocytic engulfment requires high local membrane curvature and causes significant area changes of the membrane leaflets. This can be initiated by differences between the surface areas of the two monolayers related to leaflet specific modulation of lipid composition. Thus, it was proposed that lipid translocators, pumping phospholipids from the outer to the inner leaflet, account for monolayer area asymmetry as an early step in endocytosis. To elucidate the influence of this asymmetry on endocytosis, surface area relation was altered by adding exogenous phospholipids to living cells and changes in endocytic activity were quantified. Depending on the lipid species, exogenous lipids were only incorporated into the outer layer or subsequently translocated across the plasma membrane thereby increasing either the outer or inner surface area. Addition of different analogues of aminophospholipids, which are translocated to the inner leaflet, led to an enhancement of bulk flow endocytosis in K562 cells. Moreover, our data indicate that clathrin-mediated endocytosis of Hep2 cells was stimulated as well. Inversely, addition of phospholipids, which remain on the outer layer, reduced bulk flow or clathrin-mediated endocytosis in various cell lines. Notably, also clathrin-mediated endocytosis was influenced by the addition of lipids, although many proteins noted for their ability to induce membrane curvature are known to be implicated in this pathway. This corroborates a recent model how aminophospholipid translocases are implicated in endocytosis. Upon translocating lipids and additionally interacting with endocytic accessory proteins, lipid translocators could integrate two processes to generate curvature: membrane bending based on monolayer area asymmetry and protein-related mechanisms. Collectively, findings in the present study suggest that curvature generation in endocytosis is supported by the induction of monolayer area asymmetry mediated by the translocation of lipids.

Les ATPases-P4 sont des transporteurs membranaires couplant l'hydrolyse de l'ATP au transport de lipides dans les membranes cellulaires eucaryotes. Avec leurs partenaires, les protéines CDC50, les ATPases-P4 transportent les phospholipides, en particulier la phosphatidylsérine (PS) et la phosphatidyléthanolamine (PE), du feuillet exoplasmique au feuillet cytosolique des membranes, assurant ainsi le maintien de l'asymétrie membranaire.Drs2p est l'une des cinq ATPases-P4 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle est localisée dans les membranes du trans-Golgi (TGN), et elle a comme partenaire la protéine Cdc50p, qui est nécessaire à l'adressage correct et probablement au transport catalysé par Drs2p. Drs2p est principalement responsable du transport de la phosphatidylsérine (PS) dans les membranes du TGN et son activité est essentielle pour le maintien de la PS dans le feuillet cytosolique de ces membranes. En raison du rôle crucial de la PS dans de nombreuses voies de signalisation, aussi bien à l’extérieur (au cours de l’apoptose par exemple) qu’à l’intérieur de la cellule (par le recrutement de protéines impliquées dans des processus cellulaires essentiels), il est important de comprendre le mécanisme par lequel l’asymétrie de la PS est établie.Afin de progresser dans la compréhension du mécanisme moléculaire du transport de lipides, nous avons mis au point une procédure qui nous a permis de co-exprimer Drs2p et Cdc50p dans Saccharomyces cerevisiae. La purification de Drs2p par chromatographie d'affinité sur résine streptavidine a permis d'obtenir une fraction purifiée contenant très majoritairement Drs2p et Cdc50p, à raison de 1-2 mg/L de culture. Les deux protéines sont sous forme de complexe avec une stœchiométrie d'association de 1:1. Le complexe purifié est fonctionnel, et présente une activité d’hydrolyse de l’ATP stimulée par son substrat, la PS. Cette stimulation n’est cependant possible qu’en présence de PI4P, un phosphoinositide impliqué dans la régulation du trafic membranaire.De par leur rôle crucial dans le maintien de l'asymétrie membranaire, les ATPases-P4 ne peuvent qu'être régulées. Comme de nombreuses ATPases de type P sont soumises à une auto-régulation de leur activité, nous avons examiné la possibilité d’une telle auto-régulation dans le cas des ATPases P4. Pour ce faire, une approche par mutagenèse dirigée et protéolyse ménagée associée à l’identification par spectrométrie de masse des peptides ont été effectuées. La protéolyse ménagée du complexe purifié Drs2p/Cdc50p montre une activité ATPasique dépendante au PI4P de 30-50 fois plus importante. La protéolyse par la thrombine engendre un Drs2p dépourvu d'une partie N-terminale (R104) et d'une partie C-terminale (R1290) qui reste toujours associé à Cdc50p. Ce résultat montre qu'une coupure appropriée au niveau des extrémités terminales de Drs2p peut augmenter de façon significative, en présence du PI4P, l'activité ATPasique du complexe, nous amenant ainsi à identifier un rôle auto-inhibiteur des extrémités N- et/ou C-terminales de Drs2p.Ce travail ouvre des perspectives quant à la caractérisation structurale et fonctionnelle du mécanisme de transport de lipides par le complexe. Par ailleurs, il laisse entrevoir la possibilité d’étudier les bases moléculaires des pathologies associées aux mutations de certaines ATPases P4 humaines. / Maintenance of phospholipid asymmetry in eukaryotic cell membranes is essential for cellular integrity and function. P4-ATPases, from the P-type ATPases family, are energy-dependent transporters, together with their CDC50 accessory subunits couple ATP hydrolysis to lipid transport from the exoplasmic to cytoplasmic leaflet to maintain membrane asymmetry.Drs2p is one of these P4-ATPases in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Drs2p is localised in trans-Golgi (TGN) membranes in association with its binding partner Cdc50p, which contributes to the correct addressing of Drs2p and probably in the catalyzed transport by Drs2p. Drs2p transport principally phosphatidylserine (PS) in TGN membranes. The PS is important for a several signalling pathways, for example, in apoptosis and recruitment of the proteins implied in various essential cellular process, so, it's very important to understand the mechanism that establishes this asymmetry.To gain in comprehension of molecular mechanism of lipid transport, robust protocols for expression and purification are required. In this work, we present a procedure for high-yield co-expression of Drs2p and Cdc50p. The purification of Drs2p and Cdc50p is achieved in a single step by affinity chromatography on streptavidin beads, yielding, 1-2 mg purified Drs2p/Cdc50p per liter of culture. This procedure allows purification of the complex Drs2p/Cdc50p with stoichiometry to 1:1. Our complex is functional, overal ATP hydrolysis by the complex is dependent of PS, favourite substrate of Drs2p. This hydrolyze is critically dependent on the presence of PI4P, a phosphoinositide involved in regulation of membrane trafficking.Like many P-type ATPases auto-regulate their activity, we examined the possibility that P4-ATPases are auto-regulated. In this work, we use directed mutagenesis and limited proteolysis associated with mass spectrometry for identify peptides. We show that limited proteolysis of a purified complex Drs2p/Cdc50p resulted in up to a 30-50 fold increase of it ATPase activity, which however remained dependent on PI4P. Using thrombin as the protease, Cdc50p remained intact and in complex with Drs2p, which was cleaved at two positions, namely after R104 and after R1290. Our results therefore reveal that trimming off appropriate regions of the terminal extensions of Drs2p can increase its ATPase activity in the presence of PI4P by an enormous factor, thereby identifying a role of N and/or C-terminal extensions in auto-inhibition of Drs2p.Our results open perspectives on the structural and the functional characterization of the lipid transport mechanism by the complex Drs2p/Cdc50p. Furthermore, our procedures open up the possibility of studying the molecular bases of the pathologies associated with the mutations of human P4-ATPases.