INTRODUÇÃO: O receptor tipo Toll 4 (TLR4) pertencente a uma família de receptores do sistema imune inato, reconhece o padrão molecular de lipopolissacarídeos (LPS), expressos por bactérias Gram negativas. Sua cascata de sinalização, nas células apresentadoras de antígeno, ocorre por duas vias principais: MyD88-dependente, que resulta na ativação de NF-B e na expressão de genes de resposta inflamatória e MyD88-independente, responsável pela ativação dos fatores IRF3 e IRF7, culminando na síntese de interferons e , envolvidos na resposta anti-viral e anti-bacteriana. Células não-imunes, de diversos tecidos, também expressam TLR4, incluindo células pancreáticas murinas e humanas. Devido ao seu papel nos processos inflamatórios, os TLR estão implicados em doenças crônicas como obesidade e diabetes. Estudo anterior do grupo identificou TLR4 como uma molécula que ativa sinais inflamatórios e provoca alterações na homeostase das células . Neste trabalho, investigamos qual via é ativada por LPS e quais os efeitos da expressão do TLR4 na viabilidade celular e na produção de insulina em células murinas. MÉTODOS: Células MIN6 (linhagem celular de insulinoma de camundongo) foram cultivadas em condições de hipo (2,8mM glicose), normo (5,6mM glicose) e hiperglicemia (11,2mM glicose), por 4 dias. Após esse período, foi adicionado LPS (50 ng/mL) por 48h e foram feitas análises por PCR em tempo real, Western Blot, ELISA e citometria de fluxo. RESULTADOS: Os resultados confirmam o aumento de TLR4 em células em condições de hiperglicemia e a via de sinalização ativada por LPS é a via MyD88-dependente, envolvida na produção de citocinas pró-inflamatórias. A via de indução de intérferons tipo 1 está ausente nestas células. Além disso, TLR4 ativado por LPS aumentou secreção de insulina em resposta a glicose, mas não induziu a morte celular. CONCLUSÃO: A expressão de TLR4 em células pancreáticas murinas é induzida em resposta ao aumento da glicemia, constituindo um novo elo entre a agressão à célula causada por altos níveis de glicose e a alteração da função celular induzida por LPS / INTRODUCTION: Toll-like receptor 4 (TLR4) belongs to a family of innate immunity receptors and recognizes the molecular pattern present in lipopolysaccharides (LPS), typical of Gram-negative bacteria. There are two TLR4 signaling pathways, typically in antigen-presenting cells: one is MyD88-dependent, activating NF-kB transcription factor and triggering inflammatory cytokine production and the other is MyD88-independent, leading to activation of IRF3 and IRF-7 and production of interferons e , involved in antiviral and antibacterial immune responses. Non-immune cells in several tissues also express TLR4, including human and murine pancreatic cells. Due to their role in inflammatory processes, TLRs have been implicated in chronic diseases like obesity and diabetes. Our previous study identified TLR4 as a molecule which activates inflammatory signals and induces changes in cell homeostasis. In this study, we investigated which of the TLR4 pathways is activated by LPS and the effects of glucose levels on cell viability and insulin production in a mouse insulinoma cell line. METHODS: MIN6 cells were maintained in low (2,8mM), normal (5,6mM) and high (11,2mM) glucose levels for 4 days, and then incubated with LPS (50 ng/mL) for 48 hours. Analyses were done by real-time PCR, Western Blot, ELISA and flow cytometry. RESULTS: Analysis confirmed increase in TLR4 gene expression in hyperglycemic conditions and showed that the signaling pathway activated by LPS is MyD88-dependent. The interferon induction pathway is absent in these cells. Furthermore, upon activation by LPS, TLR4 impacts on insulin secretion in response to glucose, but without triggering cell death. CONCLUSION: We conclude that TLR4 expression in mouse pancreatic cells is induced in response to increased glucose levels, constituting a new link in the chain of events leading to cell stress caused by high glucose levels with concomitant changes in cell function induced by LPS

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-26T13:39:38Z No. of bitstreams: 1 aydramendesalmeidabianchi.pdf: 1447064 bytes, checksum: 5e432ac627c643fd1832440690fe8539 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-03-03T14:05:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 aydramendesalmeidabianchi.pdf: 1447064 bytes, checksum: 5e432ac627c643fd1832440690fe8539 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-03T14:05:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aydramendesalmeidabianchi.pdf: 1447064 bytes, checksum: 5e432ac627c643fd1832440690fe8539 (MD5) Previous issue date: 2015-03-09 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Introdução: A posição prona tem sido estudada como estratégia ventilatória em pacientes com síndrome do desconforto respiratório agudo. Seus benefícios, inclusive com redução da mortalidade, estão bem estabelecidos nas formas graves da síndrome, mas não em formas mais leves. Objetivo: Investigar o efeito da posição prona nas trocas gasosas, inflamação e histologia pulmonar, em modelo experimental de lesão pulmonar aguda leve em ratos. Métodos: A lesão pulmonar aguda foi induzida em ratos Wistar, machos, adultos, através da injeção de lipopolissacarídeo da Escherichia coli (5 mg/Kg). Após 24 h, os animais com PaO2/FIO2 entre 200 e 300 mmHg foram anestesiados e randomizados dentro de 2 grupos de acordo com a sua posição durante a ventilação (prona [n=6] e supina [n=6]). Ambos os grupos foram comparados com um grupo controle [n=5] que recebeu solução salina a 0,9% intraperitoneal e foi ventilado em posição supina. Todos os grupos foram ventilados por 1 h em modo ventilatório volumecontrolado, com volume corrente de 6 ml/Kg, frequência respiratória de 80 irpm, pressão positiva ao final da expiração de 5 cmH2O e uma fração inspirada de oxigênio de 1. Resultados: O escore de lesão pulmonar foi significativamente maior no grupo LPS-supino, em comparação com os grupos LPS-prono e controle (0,32 ± 0,03; 0,17 ± 0,03 e 0,13 ± 0,04, respectivamente) (p < 0,001), devido a uma maior infiltração de neutrófilos no espaço intersticial e maior presença de debris proteicos na luz alveolar. Esta maior lesão pulmonar no grupo LPS-supino foi observada tanto nas regiões pulmonares dependentes da gravidade (dorsal no grupo supino e ventral no grupo prono – 0,34 ± 0,05 e 0,22 ± 0,04, respectivamente) (p < 0,05), quanto nas não dependentes (ventral no grupo supino e dorsal no grupo prono – 0,29 ± 0,04 e 0,13 ± 0,04, respectivamente) (p < 0,05). O contagem de neutrófilos no LBA foi maior no grupo LPS-supino, comparado com os grupos LPS prono e controle. Não houve diferenças significativas na relação peso úmido/peso seco e nas trocas gasosas entre os três grupos. Conclusões: Neste modelo experimental de lesão pulmonar aguda leve extrapulmonar, a ventilação em posição prona por 1 hora, quando comparada com a ventilação em posição supino, associou-se a menor lesão e inflamação pulmonar, mas sem impacto na oxigenação arterial e no edema pulmonar. / Introduction: Prone position has been studied as a ventilator strategy among patients with acute respiratory distress syndrome. The benefits of prone position ventilation, including reduction in the mortality, are well demonstrated in the severe but not in milder forms of this syndrome. We therefore investigated the effects of the prone position on arterial blood gases, lung inflammation and histology in an experimental model of mild acute lung injury in rats. Methods: Acute lung injury was induced in adult male Wistar rats by intraperitoneal Escherichia coli lipopolysaccharide injection (5 mg/kg). After 24h, the animals with PaO2/FIO2 between 200 and 300 mmHg were anesthetized and randomized into 2 groups according to their position during ventilation (prone [n=6] and supine [n=6]). Both groups were compared to a control group (n=5) that received intraperitoneal saline and was ventilated in the supine position. All of the groups were ventilated for 1h with volume-controlled ventilation mode, with tidal volume of 6 ml/kg, respiratory rate of 80 breaths/min, positive end-expiratory pressure of 5 cmH2O, and an inspired oxygen fraction of 1. Results: Significantly higher lung injury scores were observed in the LPS-supine group compared to LPS-prone and control groups (0.32 ± 0.03; 0.17 ± 0.03 and 0.13 ± 0.04, respectively) (p<0.001), mainly due to a higher neutrophil infiltration level in the interstitial space and more proteinaceous debris in the airspaces. Similar differences were observed when the gravitational dependent lung regions (dorsal in the supine group and ventral in the prone group – 0.34 ± 0.05 and 0.22 ± 0.04, respectively) (p < 0.05) and non-dependent lung regions (ventral in the supine group and dorsal in the prone group – 0.29 ± 0.04 and 0.13 ± 0.04, respectively) (p < 0.05) were analyzed separately. The BAL neutrophil content was also higher in the LPS-supine group compared to the LPSprone and control groups. There were no significant differences in the wet/dry ratio and gas exchange levels among the three groups. CONCLUSIONS: In this experimental extrapulmonary mild acute lung injury model, prone position ventilation for 1 hour, when compared with supine position ventilation, was associated with lower lung inflammation and injury, but without any impact on arterial oxygenation and lung edema.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-01-11T17:31:37Z No. of bitstreams: 1 lidiamariacarneirodafonseca.pdf: 814638 bytes, checksum: 8aa87e2816d8e7e5c474900ab0798b04 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-01-25T17:10:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lidiamariacarneirodafonseca.pdf: 814638 bytes, checksum: 8aa87e2816d8e7e5c474900ab0798b04 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T17:10:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lidiamariacarneirodafonseca.pdf: 814638 bytes, checksum: 8aa87e2816d8e7e5c474900ab0798b04 (MD5) Previous issue date: 2015-07-16 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Introdução: A forma como pulmões com enfisema respondem a uma agressão sistêmica como a sepse não é conhecida. É possível que as alterações inflamatórias e estruturais nos pulmões com enfisema alterem a resposta dos mesmos à sepse influenciando no desenvolvimento da síndrome do desconforto respiratório agudo. Objetivo: Comparar a lesão pulmonar secundária à sepse, induzida por lipopolissacarídeo (LPS) intraperitoneal, em ratos com e sem enfisema induzido pela administração intratraqueal de elastase. Métodos: Vinte e quatro ratos Wistar adultos foram randomizados para quatro grupos de seis animais: controle (C-C), enfisema (E-C), controle com sepse (C-LPS) e enfisema com sepse (E-LPS). O enfisema foi induzido pela injeção intratraqueal de elastase pancreática de porco (12 UI/ animal). Após três semanas deste procedimento, a sepse foi induzida pela injeção intraperitoneal de LPS da Escherichia coli (10 mg/Kg). Vinte e quatro horas após a indução da sepse, os animais foram submetidos à ventilação mecânica por 10 minutos para posterior coleta da gasometria arterial. A seguir, foram eutanasiados e as seguintes análises foram realizadas: lavado broncoalveolar (LBA), permeabilidade pulmonar e histologia. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão ou mediana (intervalo interquartil), quando apropriado, e comparados por ANOVA seguida do teste de Tukey, ou por Kruskal-Wallis seguido do teste de Mann-Whitney. Resultados: O escore de lesão pulmonar foi significativamente maior nos grupos C-LPS [0,62 (0,19)] e E-LPS [0,59 (0,13)] em comparação com os grupos C-C [0,11 (0,09)] e E-C [0,15 (0,05)] (p < 0,05). A contagem total de células (C-LPS=2,37 ± 0,74; E-LPS=5,37 ± 0,13; C-C=0,73 ± 0,36; E-C=3,09 ± 7,53 x 105) e de neutrófilos [C-LPS=1,39 (1,48); E-LPS=4,39 (1,95); C-C=0,07 (0,11); E-C=0,68 (0,61) x 105] no LBA foi significativamente maior nos grupos C-LPS e E-LPS comparado aos grupos C-C e E-C (p < 0,05). Animais do grupo E-LPS apresentaram maior contagem de células totais e de neutrófilos no LBA em comparação com o grupo C-LPS (p < 0,05). Na avaliação da razão albumina LBA/soro, o grupo E-LPS apresentou aumento significativo quando comparado ao C-LPS [0,069 (1,243) vs. 0,007 (0,002), respectivamente, p < 0,05]. Não foram observadas diferenças significativas nas trocas gasosas entre os grupos. Conclusões: A presença de enfisema foi acompanhada de maior inflamação pulmonar em resposta à agressão sistêmica induzida pela injeção intraperitoneal de LPS, levando a uma maior lesão da barreira alvéolo-capilar. Palavras-chave: enfisema pulmonar, sepse, lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, elastase pancreática, lipopolissacarídeos. / Introduction: The response of lungs with emphysema to a systemic insult such as sepsis is not known. Structural and inflammatory abnormalities in lungs caused by emphysema might alter their response to sepsis and thus influence the incidence and severity of acute respiratory distress syndrome. We therefore aimed to compare the severity and extension of acute lung injury in response to intraperitoneal lipopolysaccharide (LPS) injection in rats with and without emphysema induced by elastase. Methods: Twenty four adult Wistar rats were randomized into 4 groups, each of them with 6 animals: control (C-C), emphysema without sepsis (E-C), control with sepsis (C-LPS) and emphysema with sepsis (E-LPS). Emphysema was induced by intratracheal instillation of pancreatic porcine elastase (12 IU/animal). Three weeks later, sepsis was induced by intraperitoneal Escherichia coli LPS injection (10 mg/kg). Twenty four hours after sepsis induction, animals underwent mechanical ventilation for 10 minutes and then blood was sampled for gasometric analysis. Thereafter, euthanasia and the following analysis were performed: BAL, lung permeability and histology. Results were expressed as mean ± standard deviation or median (interquartile range), when appropriate, and compared using ANOVA followed by Tukey test or Kruskal-Wallis followed by Mann-Whitney test. Results: Significant increase in lung injury score was observed in the C-LPS [0.62 (0.19)] and E-LPS [0.59 (0.13)] compared to the groups C-C [0.11 (0.09)] and E-C [0.15 (0.05)] (p < 0.05). Total cell (C-LPS=2.37 ± 0.74; E-LPS=5.37 ± 0.13; C-C=0.73 ± 0.36; E-C=3.09 ± 7.53 x 105) and neutrophil counts [C-LPS=1.39 (1.48); E-LPS=4.39 (1.95); C-C=0.065 (0.11); E-C=0.68 (0.61) x 105] in the BAL were significantly higher in the groups that received LPS (p < 0.05). Significantly higher total cell and neutrophil counts in the BAL were also observed in the E-LPS group compared to C-LPS (p < 0.05). The group E-LPS showed a significant increase in the BAL/serum albumin ratio compared to C-LPS [0.069 (1.243) vs. 0.007 (0.002), respectively] (p < 0.05). There were no significant differences in the gas exchange levels among the groups. Conclusions: The presence of emphysema increases the inflammatory response in the lungs to a systemic stimulus, represented in this model by the intraperitoneal injection of LPS.