The French-Canadian variant of Leigh syndrome (LSFC) is a distinct and particularly severe presentation of Leigh syndrome characterized by the onset of unpredictable acidotic crises leading to death of 80% of them before the age of five. This autosomal recessive disorder is caused by mutations in LRPPRC, encoding an mRNA binding protein of the same name with a high affinity for mitochondrial transcripts. As a result of the mutations, levels of LRPPRC are decreased in all tissues and cause a severe deficiency of complex IV of the respiratory chain, with a deeper involvement of brain and liver. To gain better knowledge on the pathophysiology of this disease, and of the impact of the OXPHOS defect on the liver, our research consortium developed a mouse model of the disease harboring a liver specific inactivation of Lrpprc (H-Lrpprc). The goal of this thesis is to investigate the in vivo consequences of hepatic Lrpprc inactivation and to test potential therapy for mitochondrial diseases. The characterization of this model and the analysis of the mitochondrial phenotype are presented in Chapter 2 (Cuillerier et al, Human Molecular Genetics, 2017). Despite this severe phenotype, H-Lrpprc mice show no signs of overt liver failure and maintain energy levels, suggesting mechanisms are in place to sustain residual complex IV function. The underlying compensatory mechanisms granting these mice a remarkable resilience were explored and are presented in Chapter 4 (Cuillerier et al, Communications Biology, 2021). Along this project, we developed a protocol, and the optimized conditions of this method are described in Chapter 3 (Cuillerier and Burelle, JoVE, 2019). Although great progress has been made, there are currently no effective or curative treatments for LSFC and mitochondrial diseases. Recently, extensive pre-clinical and clinical studies supported the emergence and safety of mesenchymal stem cells therapy in the treatment of various diseases. Following transplantation, MSCs promote repair through various mechanisms including secretion of cytokines/exosomes, and transfer of mitochondria directly to target cells with impaired mitochondria offering a possibility to replace mutant dysfunctional organelles, which is relevant in the context of genetic mitochondrial diseases. Based on this, the objective of the last chapter of this thesis is to test the therapeutic potential of MSCs for genetic mitochondrial disorders using MSC-based approaches and LSFC as a disease model. Unfortunately, we encountered several obstacles along the way, including the departure of our main collaborator and stem cell expert, and delays in experimental procedures due to the COVID-19 pandemic. Consequently, this study was not completed at the moment of submission of this thesis, and is therefore presented as a pilot study in the form of a manuscript in Chapter 5. Overall, these projects unveiled alterations of mitochondrial functions that go beyond OXPHOS, a complex network of compensatory mechanisms in place to palliate these defects, and finally, encouraging preliminary results suggest MSC therapy could be beneficial for the treatment of mitochondrial diseases.

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Le syndrome de Leigh version canadienne-française (LSFC) est une maladie autosomale récessive causée par une mutation du gène LRPPRC. Le rôle principal de la protéine LRPPRC est la traduction des gènes mitochondriaux qui encodent certains complexes de la chaine respiratoire. La mutation provoque une diminution de l’expression de LRPPRC, qui induit un déficit tissu spécifique du cytochrome c oxydase (COX). Principalement dans le foie et le cerveau, cette diminution provoque un retard de développement global et la survenue de crises d’acidose souvent fatales chez des enfants atteints avant l’âge de 3-4 ans. L’impact de LRPPRC sur les cellules du système immunitaire est peu étudié aujourd’hui. Cependant les infections, et donc l’activation du système immunitaire, font partie des stress induisant les crises d’acidose métabolique. Afin d’étudier la relation entre LRPPRC et les cellules immunitaires, nous avons tiré profit de sérum de patients récolté dans une étude précédente, nous permettant de quantifier la réponse au vaccin des patients LSFC. Nous avons également développé deux nouveaux modèles murins à délétion conditionnelle permettant d’étudier l’impact de l’absence de LRPPRC et de sa mutation sur la composition du système immunitaire. Lors de mes travaux de doctorat, j’ai montré que certains patients atteints du LSFC ne répondaient pas au vaccin contre la rougeole, la rubéole et les oreillons, semblant indiquer une atteinte de la réponse humorale. Lors de la caractérisation des modèles murins développés au laboratoire, j’ai mis en évidence une forte altération du développement des lymphocytes B, dû, entre autres à un défaut de prolifération. La mise en place et la validation des modèles murins permettant d’étudier la mutation de LRPPRC dans tous les organes des souris est une avancée majeure pour la recherche sur le LSFC. L’étude de la réponse immunitaire dans ces modèles permettra de mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans le déclenchement des crises d’acidose métabolique afin de pouvoir envisager des pistes de traitements préventifs. / The French-Canadian version of Leigh syndrome (LSFC) is an autosomal recessive disease caused by a mutation in the LRPPRC gene. The main role of the LRPPRC protein is the translation of mitochondrial genes that encode certain complexes of the respiratory chain. The mutation results in a decrease in LRPPRC expression, which induces a tissue-specific deficiency of cytochrome c oxidase (COX). Mainly in the liver and brain, this decrease causes an overall developmental delay and the onset of often fatal acidotic crises in affected children before the age of 3-4 years. The impact of LRPPRC on immune system cells is poorly studied. However, infections, and therefore activation of the immune system, are among the stresses inducing metabolic acidotic crises. In order to study the relationship between LRPPRC and immune cells, we took advantage of serum from patients collected in a previous study, allowing us to quantify the vaccine response of LSFC patients. We have also developed two new conditional knockout mouse models to study the impact of the absence of LRPPRC and its mutation on the composition of the immune system. During my doctoral work, I showed that some LSFC patients did not respond to the measles, mumps and rubella vaccine, suggesting an impairment of the humoral response. During the characterization of the mouse models developed in the laboratory, I highlighted a strong alteration in the development of B lymphocytes, due, among other things, to a proliferation defect. The establishment and validation of mouse models to study the role of the LRPPRC mutation in all organs of mice is a major advance for LSFC research. The study of the immune response in these models will help to better understand the role of the immune system in triggering metabolic acidotic crises in order to consider preventive treatment options.

Le syndrome de Leigh, type canadien français (LSFC) est une maladie infantile orpheline causée par une mutation du gène lrpprc. Elle se caractérise par une déficience tissu spécifique de cytochrome c oxydase (COX), une dysfonction mitochondriale et la survenue de crises d’acidose lactique fatales dans plus de 80% de cas. Selon les familles des patients, ces crises apparaissent lors d’une demande excessive d’énergie. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents à l’apparition des crises et notamment la physiopathologie du LSFC demeurent inconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme énergétique chez les patients LSFC, nous avons examiné la régulation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme clé de l'homéostasie énergétique, de même que certaines de ses voies cibles (SIRT1/PGC1α et Akt/mTOR) dans les fibroblastes de patients LSFC et de témoins en conditions basales et conditions de stress. En conditions basales, l’activité de l’AMPK était similaire dans les cellules LSFC et les témoins. Par contre, les cellules LSFC montraient une surexpression significative des voies Akt/mTOR et SIRT1/PGC1α comparativement aux cellules témoins. Nous avons aussi examiné ces voies de signalisation suite à une incubation de 4h avec 10 mM de lactate et 1 mM de palmitate (LP), nous permettant de mimer les conditions de « crise ». Nos résultats ont démontré que le LP augmentait les niveaux de phosphorylation de l’AMPK de 90% (p<0,01) dans les cellules témoins mais pas dans les cellules LSFC. Pourtant, l’AMPK est activée dans les cellules LSFC en réponse à une hypoxie chimique induite par le 2,4 dinitrophénol. Dans les cellules témoins, le LP augmentait aussi les niveaux d’expression de SIRT1 (57%, p<0,05), de LRPPRC (23%, p=0,045) et de COXIV (19%, p<0,05). Un prétraitement de 48h au ZMP, un activateur pharmacologique de l’AMPK, a eu un effet additif avec le LP et des augmentations de SIRT1 phosphorylée (120%, p<0,05), de SIRT1 total (75%, p<0,01), de LRPPRC (63%, p<0,001) et de COXIV (38%, p<0,001) ont été observées. Tous ces effets étaient aussi abolis dans les cellules LSFC. En conclusion, nos résultats ont démontré des altérations importantes de la régulation du métabolisme énergétique dans les fibroblastes de patients LSFC. / Leigh syndrome French Canadian type (LSFC) is an orphan infantile disease caused by mutations in the LRPPRC gene. It is characterized by a tissue-specific cytochrome c oxidase deficiency (COX), mitochondrial dysfunction and fatal lactic acidosis crises which occur in more than 80% of cases. According to parents, these crises occur during stressful situations. The pathophysiology underlying this disease and the factors that precipitate these crises remain unknown. To better understand the regulation of energy metabolism in LSFC patients, we examined the activity of AMP activated protein kinase (AMPK), a key regulator of energy balance, and its downstream targets (SIRT1/PGC1α and Akt/mTOR) in LSFC and control fibroblasts under basal and stress conditions. Our results showed that AMPK activity was similar in LSFC and control cells under basal conditions. On the other hand, Akt/mTOR and SIRT1/PGC1α pathways were up regulated in LSFC cells compared to controls. We next examined AMPK activity in cells treated with 10 mM lactate and 1mM palmitate (LP) for 4h, thus mimicking the conditions of “crisis”. Following this treatment, AMPK phosphorylation levels increased significantly (90%, p<0.01) in control cells but not in LSFC cells. Nevertheless, AMPK seems functional in LSFC cells because the enzyme was activated in response to chemical hypoxia induced by 2,4 dinitrophenol. LP also increased the expression of SIRT1 (57%, p<0.05), LRPPRC (23%, p=0.045) and COXIV (19%, p<0.05), in controls cells. Furthermore, pretreatment with ZMP, a pharmacological activator of AMPK, had an additive effect with LP leading to a further increase in the activity of SIRT1 (120%, p<0.05), as well as the expression levels of SIRT1 (75%, p<0.01), LRPPRC (63%, p<0.001) and COXIV (38%, p<0.001). All these effects were abolished in LSFC cells and thus, our data highlight alterations in the regulation of key enzymes of energy metabolism, including the activation of AMPK, in LFSC fibroblasts.

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L’acidose lactique du Saguenay-Lac-St-Jean, ou syndrome de Leigh de forme canadienne-française (LSFC), est une maladie mitochondriale neurodégénérative causée par des mutations du gène LRPPRC et caractérisée par des crises d’acidose menant au décès en bas âge. On ne comprend pas encore les causes exactes de ces crises, et aucun traitement n’est actuellement disponible. L’objectif de cette étude a été de comparer le profil des métabolites sanguins et urinaires chez des sujets LSFC et des témoins, avant et après un repas, par une approche métabolomique ciblée. Le projet s’inscrit dans une démarche à long terme visant l’identification de biomarqueurs prédictifs des crises, permettant d'intervenir plus rapidement afin d’éviter le décès. Les échantillons biologiques ont été prélevés chez 9 sujets atteints du LSFC et 9 témoins appariés, à jeun et 90 minutes après un repas standardisé. Les analyses incluent un bilan biochimique et hormonal, un profil des acides aminés, des acides gras, des acides organiques et des acylcarnitines. Les métabolites significativement modifiés chez les patients peuvent être classés en deux catégories : (i) le reflet d’une dysfonction mitochondriale, et plus particulièrement de l’accumulation d’équivalents réduits en amont de la chaîne respiratoire, et (ii) des indices de risque cardiométabolique, qui s’observent davantage chez les patients adultes malgré leur jeune âge. Ainsi, il serait intéressant d’inclure au traitement des stratégies visant la diminution des facteurs de risque cardiométabolique, notamment par une modification des habitudes de vie. Notre étude démontre la pertinence d’avoir recours à la métabolomique dans l’étude des désordres de la phosphorylation oxydative. / L’acidose lactique du Saguenay-Lac-St-Jean, ou syndrome de Leigh de forme canadienne-française (LSFC), est une maladie mitochondriale neurodégénérative causée par des mutations du gène LRPPRC et caractérisée par des crises d’acidose menant au décès en bas âge. On ne comprend pas encore les causes exactes de ces crises, et aucun traitement n’est actuellement disponible. L’objectif de cette étude a été de comparer le profil des métabolites sanguins et urinaires chez des sujets LSFC et des témoins, avant et après un repas, par une approche métabolomique ciblée. Le projet s’inscrit dans une démarche à long terme visant l’identification de biomarqueurs prédictifs des crises, permettant d'intervenir plus rapidement afin d’éviter le décès. Les échantillons biologiques ont été prélevés chez 9 sujets atteints du LSFC et 9 témoins appariés, à jeun et 90 minutes après un repas standardisé. Les analyses incluent un bilan biochimique et hormonal, un profil des acides aminés, des acides gras, des acides organiques et des acylcarnitines. Les métabolites significativement modifiés chez les patients peuvent être classés en deux catégories : (i) le reflet d’une dysfonction mitochondriale, et plus particulièrement de l’accumulation d’équivalents réduits en amont de la chaîne respiratoire, et (ii) des indices de risque cardiométabolique, qui s’observent davantage chez les patients adultes malgré leur jeune âge. Ainsi, il serait intéressant d’inclure au traitement des stratégies visant la diminution des facteurs de risque cardiométabolique, notamment par une modification des habitudes de vie. Notre étude démontre la pertinence d’avoir recours à la métabolomique dans l’étude des désordres de la phosphorylation oxydative.

Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Durchführung eines quantitativen Ansatzes zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) mit einem Schwerpunkt für Proteine, die in vier häufigen neurodegenerativen Krankheiten eine Rolle spielen: die Alzheimer-, Parkinson- und Huntington-Krankheit, sowie die spinozerebelläre Ataxie Typ 1 (SCA1). Die Interaktionsstudie kombiniert die stabile Isotopen-Markierung von Aminosäuren in der Zellkultur mit der Affinitätsaufreinigung von Proteinen und hochauflösender Massenspektrometrie. Dieser Ansatz zielt darauf ab, systematisch die Interaktionspartner von gesunden und krankheitsassoziierten Proteinvarianten zu identifizieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus wurde das quantitative Interaktionsverfahren genutzt, um zu prüfen ob PPI durch krankheitsassoziierte Mutationen beeinträchtigt werden. Neben der Validierung möglicher Nebeneffekte, sowie dem Vergleich mit Informationen über PPI aus der Literatur, wurde ein Teil der identifizierten Interaktoren durch zusätzliche Koimmunopräzipitations-Experimente in zwei verschiedenen Zelllinien bestätigt. Mit Hilfe von Drosophila SCA1-Krankheitsmodellen und in Kombination mit RNAi-basierter Stummschaltung identifizierter Interaktoren wurde festgestellt, dass ein großer Teil der Kandidaten Neurodegeneration in vivo beeinflusst. Zusätzlich wurden die Alzheimer-spezifischen PPI-Daten auf genomweite Assoziationsstudien übertragen. Bemerkenswerterweise waren Polymorphismen in einzelnen Nukleotiden in den Genen zugehöriger Interaktoren wahrscheinlicher mit solchen Genen assoziiert, die eine Prädisposition für die Alzheimer-Krankheit haben, als mit zufällig ausgewählten Genen. Schlussendlich konnten Folgeexperimente für zwei ausgewählte Interaktionspartner den Nachweis für eine bislang unbekannte Rolle der N-Glykosylierung und einen neuen Zusammenhang zwischen dem RNA-bindenden Protein LRPPRC und mitochondrialer Dysfunktion in der Alzheimer-Krankheit vorlegen. / The first part of the present thesis describes the establishment of a quantitative protein-protein interaction (PPI) screen with a focus on proteins involved in four common neurodegenerative diseases (NDDs): Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Huntington’s disease (HD) and spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1). The interaction screen combines stable-isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) with protein affinity purification and high-resolution mass spectrometry. This approach aims to systematically identify and quantify interaction partners of normal and known disease-associated variants of proteins involved in NDDs. Moreover, the quantitative interaction screen was employed to study how PPIs are affected by disease-associated mutations. Along with validation of possible off-target effects and comparison of the data with literature-reported PPIs, a subset of identified interactors was validated by additional co-immunoprecipitation experiments in two different cell lines. Utilizing Drosophila models for SCA1 in combination with RNAi-mediated silencing of identified interactors, a large fraction of candidates was observed to also affect neurodegeneration in vivo. In addition, AD-specific PPI data was mapped to patient cohort data obtained from genome-wide associations studies. Notably, single-nucleotide polymorphisms in the genes of interactors of the disease-associated protein variants were more likely associated with susceptibility to AD than randomly selected genes. Finally, functional follow-ups for two selected interaction partners provided evidence for a yet unreported role of N-linked glycosylation in AD, and a novel link to mitochondrial dysfunction in AD by means of the RNA-binding protein LRPPRC.