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Le syndrome de Leigh version canadienne-française (LSFC) est une maladie autosomale récessive causée par une mutation du gène LRPPRC. Le rôle principal de la protéine LRPPRC est la traduction des gènes mitochondriaux qui encodent certains complexes de la chaine respiratoire. La mutation provoque une diminution de l’expression de LRPPRC, qui induit un déficit tissu spécifique du cytochrome c oxydase (COX). Principalement dans le foie et le cerveau, cette diminution provoque un retard de développement global et la survenue de crises d’acidose souvent fatales chez des enfants atteints avant l’âge de 3-4 ans. L’impact de LRPPRC sur les cellules du système immunitaire est peu étudié aujourd’hui. Cependant les infections, et donc l’activation du système immunitaire, font partie des stress induisant les crises d’acidose métabolique. Afin d’étudier la relation entre LRPPRC et les cellules immunitaires, nous avons tiré profit de sérum de patients récolté dans une étude précédente, nous permettant de quantifier la réponse au vaccin des patients LSFC. Nous avons également développé deux nouveaux modèles murins à délétion conditionnelle permettant d’étudier l’impact de l’absence de LRPPRC et de sa mutation sur la composition du système immunitaire. Lors de mes travaux de doctorat, j’ai montré que certains patients atteints du LSFC ne répondaient pas au vaccin contre la rougeole, la rubéole et les oreillons, semblant indiquer une atteinte de la réponse humorale. Lors de la caractérisation des modèles murins développés au laboratoire, j’ai mis en évidence une forte altération du développement des lymphocytes B, dû, entre autres à un défaut de prolifération. La mise en place et la validation des modèles murins permettant d’étudier la mutation de LRPPRC dans tous les organes des souris est une avancée majeure pour la recherche sur le LSFC. L’étude de la réponse immunitaire dans ces modèles permettra de mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans le déclenchement des crises d’acidose métabolique afin de pouvoir envisager des pistes de traitements préventifs. / The French-Canadian version of Leigh syndrome (LSFC) is an autosomal recessive disease caused by a mutation in the LRPPRC gene. The main role of the LRPPRC protein is the translation of mitochondrial genes that encode certain complexes of the respiratory chain. The mutation results in a decrease in LRPPRC expression, which induces a tissue-specific deficiency of cytochrome c oxidase (COX). Mainly in the liver and brain, this decrease causes an overall developmental delay and the onset of often fatal acidotic crises in affected children before the age of 3-4 years. The impact of LRPPRC on immune system cells is poorly studied. However, infections, and therefore activation of the immune system, are among the stresses inducing metabolic acidotic crises. In order to study the relationship between LRPPRC and immune cells, we took advantage of serum from patients collected in a previous study, allowing us to quantify the vaccine response of LSFC patients. We have also developed two new conditional knockout mouse models to study the impact of the absence of LRPPRC and its mutation on the composition of the immune system. During my doctoral work, I showed that some LSFC patients did not respond to the measles, mumps and rubella vaccine, suggesting an impairment of the humoral response. During the characterization of the mouse models developed in the laboratory, I highlighted a strong alteration in the development of B lymphocytes, due, among other things, to a proliferation defect. The establishment and validation of mouse models to study the role of the LRPPRC mutation in all organs of mice is a major advance for LSFC research. The study of the immune response in these models will help to better understand the role of the immune system in triggering metabolic acidotic crises in order to consider preventive treatment options.

Le syndrome de Leigh, type canadien français (LSFC) est une maladie infantile orpheline causée par une mutation du gène lrpprc. Elle se caractérise par une déficience tissu spécifique de cytochrome c oxydase (COX), une dysfonction mitochondriale et la survenue de crises d’acidose lactique fatales dans plus de 80% de cas. Selon les familles des patients, ces crises apparaissent lors d’une demande excessive d’énergie. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents à l’apparition des crises et notamment la physiopathologie du LSFC demeurent inconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme énergétique chez les patients LSFC, nous avons examiné la régulation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme clé de l'homéostasie énergétique, de même que certaines de ses voies cibles (SIRT1/PGC1α et Akt/mTOR) dans les fibroblastes de patients LSFC et de témoins en conditions basales et conditions de stress. En conditions basales, l’activité de l’AMPK était similaire dans les cellules LSFC et les témoins. Par contre, les cellules LSFC montraient une surexpression significative des voies Akt/mTOR et SIRT1/PGC1α comparativement aux cellules témoins. Nous avons aussi examiné ces voies de signalisation suite à une incubation de 4h avec 10 mM de lactate et 1 mM de palmitate (LP), nous permettant de mimer les conditions de « crise ». Nos résultats ont démontré que le LP augmentait les niveaux de phosphorylation de l’AMPK de 90% (p<0,01) dans les cellules témoins mais pas dans les cellules LSFC. Pourtant, l’AMPK est activée dans les cellules LSFC en réponse à une hypoxie chimique induite par le 2,4 dinitrophénol. Dans les cellules témoins, le LP augmentait aussi les niveaux d’expression de SIRT1 (57%, p<0,05), de LRPPRC (23%, p=0,045) et de COXIV (19%, p<0,05). Un prétraitement de 48h au ZMP, un activateur pharmacologique de l’AMPK, a eu un effet additif avec le LP et des augmentations de SIRT1 phosphorylée (120%, p<0,05), de SIRT1 total (75%, p<0,01), de LRPPRC (63%, p<0,001) et de COXIV (38%, p<0,001) ont été observées. Tous ces effets étaient aussi abolis dans les cellules LSFC. En conclusion, nos résultats ont démontré des altérations importantes de la régulation du métabolisme énergétique dans les fibroblastes de patients LSFC. / Leigh syndrome French Canadian type (LSFC) is an orphan infantile disease caused by mutations in the LRPPRC gene. It is characterized by a tissue-specific cytochrome c oxidase deficiency (COX), mitochondrial dysfunction and fatal lactic acidosis crises which occur in more than 80% of cases. According to parents, these crises occur during stressful situations. The pathophysiology underlying this disease and the factors that precipitate these crises remain unknown. To better understand the regulation of energy metabolism in LSFC patients, we examined the activity of AMP activated protein kinase (AMPK), a key regulator of energy balance, and its downstream targets (SIRT1/PGC1α and Akt/mTOR) in LSFC and control fibroblasts under basal and stress conditions. Our results showed that AMPK activity was similar in LSFC and control cells under basal conditions. On the other hand, Akt/mTOR and SIRT1/PGC1α pathways were up regulated in LSFC cells compared to controls. We next examined AMPK activity in cells treated with 10 mM lactate and 1mM palmitate (LP) for 4h, thus mimicking the conditions of “crisis”. Following this treatment, AMPK phosphorylation levels increased significantly (90%, p<0.01) in control cells but not in LSFC cells. Nevertheless, AMPK seems functional in LSFC cells because the enzyme was activated in response to chemical hypoxia induced by 2,4 dinitrophenol. LP also increased the expression of SIRT1 (57%, p<0.05), LRPPRC (23%, p=0.045) and COXIV (19%, p<0.05), in controls cells. Furthermore, pretreatment with ZMP, a pharmacological activator of AMPK, had an additive effect with LP leading to a further increase in the activity of SIRT1 (120%, p<0.05), as well as the expression levels of SIRT1 (75%, p<0.01), LRPPRC (63%, p<0.001) and COXIV (38%, p<0.001). All these effects were abolished in LSFC cells and thus, our data highlight alterations in the regulation of key enzymes of energy metabolism, including the activation of AMPK, in LFSC fibroblasts.

La forme canadienne-française du syndrome de Leigh (LSFC) est une maladie métabolique associée à une déficience en cytochrome oxydase (COX) et caractérisée par des crises d’acidose lactique, menant à une mort prématurée. Les mécanismes qui sous-tendent l’induction des crises restent inconnus et il n’existe aucune thérapie efficace pour les prévenir. Cette étude vise à caractériser l'effet de facteurs métaboliques périphériques potentiellement altérés chez les patients LSFC sur la mort de lignées cellulaires issues de ces patients et de témoins puis, à identifier des agents thérapeutiques pouvant la prévenir. Nous postulons que (i) ces facteurs métaboliques induiront une mort prématurée des cellules de patients et que (ii) les interventions susceptibles de la prévenir pallieront les conséquences de la déficience en COX, soit la diminution des taux d’adénosine triphosphate (ATP) et l’augmentation du stress oxydant, du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et des lipides toxiques. Un criblage de 8 facteurs sanguins et 10 agents thérapeutiques a été réalisé. Les paramètres mesurés incluent la nécrose, l’apoptose, l’ATP et l’activité de la COX. Les fibroblastes LSFC sont plus susceptibles à la mort par nécrose (39±6%) induite par du palmitate plus lactate, un effet associé à des niveaux d’ATP diminués (53±8%). La mort cellulaire est réduite de moitié par l’ajout combiné d’agents ciblant le NADH, l’ATP et les lipides toxiques, alors que l’ajout d’antioxydants l’augmente. Ainsi, un excès de nutriments pourrait induire la mort prématurée des cellules LSFC et, pour atténuer cette mort, il serait important de combiner plusieurs interventions ciblant différents mécanismes. / Leigh syndrome French-Canadian variant (LSFC) is a metabolic disease associated with cytochrome c oxidase (COX) deficiency and characterized by episodes of lactic acidosis, referred to as “crisis”, leading to death at an early age. The mechanisms underlying a crisis and its cellular consequences remain elusive, and there is no effective therapy. The aim of this study was to characterize the effect of peripheral metabolic factors that are potentially altered in patients with LSFC on their cells death and to identify therapeutic agents able to prevent them using cell-lineage from LSFC patients and controls. The hypothesis are that (i) these metabolic factors can induce premature death in patient cells, and (ii) interventions that could rescue these cells may target potential consequences of COX deficiency, namely low adenosine triphosphate (ATP), high nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and toxic lipids, as well as oxidative stress. A screening of 8 blood factors and 10 therapeutic agents was conducted in fibroblasts. Parameter measured included cell death by necrosis and apoptosis, as well as ATP level and COX activity. LSFC fibroblasts were more susceptible to necrosis (39±6%) induced by high palmitate plus lactate and this was associated with a lower ATP (53±8%). Cell death decreased 2-fold with combined interventions, which presumably act on NADH, ATP, and the accumulation of toxic lipids, but increased with antioxidants. Collectively, our results emphasize the importance of nutrient overload as a factor eliciting premature cell death in LSFC cells and of combining interventions acting through various mechanisms for cell death rescue.

La forme canadienne-française du syndrome de Leigh (LSFC) est une maladie métabolique associée à une déficience en cytochrome oxydase (COX) et caractérisée par des crises d’acidose lactique, menant à une mort prématurée. Les mécanismes qui sous-tendent l’induction des crises restent inconnus et il n’existe aucune thérapie efficace pour les prévenir. Cette étude vise à caractériser l'effet de facteurs métaboliques périphériques potentiellement altérés chez les patients LSFC sur la mort de lignées cellulaires issues de ces patients et de témoins puis, à identifier des agents thérapeutiques pouvant la prévenir. Nous postulons que (i) ces facteurs métaboliques induiront une mort prématurée des cellules de patients et que (ii) les interventions susceptibles de la prévenir pallieront les conséquences de la déficience en COX, soit la diminution des taux d’adénosine triphosphate (ATP) et l’augmentation du stress oxydant, du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et des lipides toxiques. Un criblage de 8 facteurs sanguins et 10 agents thérapeutiques a été réalisé. Les paramètres mesurés incluent la nécrose, l’apoptose, l’ATP et l’activité de la COX. Les fibroblastes LSFC sont plus susceptibles à la mort par nécrose (39±6%) induite par du palmitate plus lactate, un effet associé à des niveaux d’ATP diminués (53±8%). La mort cellulaire est réduite de moitié par l’ajout combiné d’agents ciblant le NADH, l’ATP et les lipides toxiques, alors que l’ajout d’antioxydants l’augmente. Ainsi, un excès de nutriments pourrait induire la mort prématurée des cellules LSFC et, pour atténuer cette mort, il serait important de combiner plusieurs interventions ciblant différents mécanismes. / Leigh syndrome French-Canadian variant (LSFC) is a metabolic disease associated with cytochrome c oxidase (COX) deficiency and characterized by episodes of lactic acidosis, referred to as “crisis”, leading to death at an early age. The mechanisms underlying a crisis and its cellular consequences remain elusive, and there is no effective therapy. The aim of this study was to characterize the effect of peripheral metabolic factors that are potentially altered in patients with LSFC on their cells death and to identify therapeutic agents able to prevent them using cell-lineage from LSFC patients and controls. The hypothesis are that (i) these metabolic factors can induce premature death in patient cells, and (ii) interventions that could rescue these cells may target potential consequences of COX deficiency, namely low adenosine triphosphate (ATP), high nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and toxic lipids, as well as oxidative stress. A screening of 8 blood factors and 10 therapeutic agents was conducted in fibroblasts. Parameter measured included cell death by necrosis and apoptosis, as well as ATP level and COX activity. LSFC fibroblasts were more susceptible to necrosis (39±6%) induced by high palmitate plus lactate and this was associated with a lower ATP (53±8%). Cell death decreased 2-fold with combined interventions, which presumably act on NADH, ATP, and the accumulation of toxic lipids, but increased with antioxidants. Collectively, our results emphasize the importance of nutrient overload as a factor eliciting premature cell death in LSFC cells and of combining interventions acting through various mechanisms for cell death rescue.

L’acidose lactique du Saguenay-Lac-St-Jean, ou syndrome de Leigh de forme canadienne-française (LSFC), est une maladie mitochondriale neurodégénérative causée par des mutations du gène LRPPRC et caractérisée par des crises d’acidose menant au décès en bas âge. On ne comprend pas encore les causes exactes de ces crises, et aucun traitement n’est actuellement disponible. L’objectif de cette étude a été de comparer le profil des métabolites sanguins et urinaires chez des sujets LSFC et des témoins, avant et après un repas, par une approche métabolomique ciblée. Le projet s’inscrit dans une démarche à long terme visant l’identification de biomarqueurs prédictifs des crises, permettant d'intervenir plus rapidement afin d’éviter le décès. Les échantillons biologiques ont été prélevés chez 9 sujets atteints du LSFC et 9 témoins appariés, à jeun et 90 minutes après un repas standardisé. Les analyses incluent un bilan biochimique et hormonal, un profil des acides aminés, des acides gras, des acides organiques et des acylcarnitines. Les métabolites significativement modifiés chez les patients peuvent être classés en deux catégories : (i) le reflet d’une dysfonction mitochondriale, et plus particulièrement de l’accumulation d’équivalents réduits en amont de la chaîne respiratoire, et (ii) des indices de risque cardiométabolique, qui s’observent davantage chez les patients adultes malgré leur jeune âge. Ainsi, il serait intéressant d’inclure au traitement des stratégies visant la diminution des facteurs de risque cardiométabolique, notamment par une modification des habitudes de vie. Notre étude démontre la pertinence d’avoir recours à la métabolomique dans l’étude des désordres de la phosphorylation oxydative. / L’acidose lactique du Saguenay-Lac-St-Jean, ou syndrome de Leigh de forme canadienne-française (LSFC), est une maladie mitochondriale neurodégénérative causée par des mutations du gène LRPPRC et caractérisée par des crises d’acidose menant au décès en bas âge. On ne comprend pas encore les causes exactes de ces crises, et aucun traitement n’est actuellement disponible. L’objectif de cette étude a été de comparer le profil des métabolites sanguins et urinaires chez des sujets LSFC et des témoins, avant et après un repas, par une approche métabolomique ciblée. Le projet s’inscrit dans une démarche à long terme visant l’identification de biomarqueurs prédictifs des crises, permettant d'intervenir plus rapidement afin d’éviter le décès. Les échantillons biologiques ont été prélevés chez 9 sujets atteints du LSFC et 9 témoins appariés, à jeun et 90 minutes après un repas standardisé. Les analyses incluent un bilan biochimique et hormonal, un profil des acides aminés, des acides gras, des acides organiques et des acylcarnitines. Les métabolites significativement modifiés chez les patients peuvent être classés en deux catégories : (i) le reflet d’une dysfonction mitochondriale, et plus particulièrement de l’accumulation d’équivalents réduits en amont de la chaîne respiratoire, et (ii) des indices de risque cardiométabolique, qui s’observent davantage chez les patients adultes malgré leur jeune âge. Ainsi, il serait intéressant d’inclure au traitement des stratégies visant la diminution des facteurs de risque cardiométabolique, notamment par une modification des habitudes de vie. Notre étude démontre la pertinence d’avoir recours à la métabolomique dans l’étude des désordres de la phosphorylation oxydative.

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