Die EAE ist eine Autoimmunerkrankung im Modell der Ratte. Sie ist eine inflammatorische , hauptsächlich durch CD4+ T-Zellen vermittelte Erkrankung des ZNS. In der Arbeit wurde die Interaktion von MHC, Peptid und TCR, welche typisch für diese Erkrankung sind, näher charakterisiert. / The EAE is an autoimmun desease in the model of the rat. It is characterized by inflammation of the CNS, mediated mainly by CD4+ T-cells. This work characterizes further the relevant interaction of MHC, peptid and TCR, typical found in the EAE.

Die Stimulation von Lymphozyten durch alleinige Quervernetzung ihrer Antigenrezeptoren führt in Abhängigkeit von der Signalstärke zur Induktion von Apoptose. Dieser Prozess spielt im Rahmen der negativen Selektion von B-Zellen eine wichtige Rolle und kann am Beispiel von WEHI 231 Zellen, einer murinen Lymphomzelllinie modellhaft nachempfunden werden. Die Quervernetzung des B-Zellrezeptors (BZR) in WEHI 231 Zellen führt in Abhängigkeit von der Prozessierung der mitochondrialen Caspase 9 zu Apoptose. Dies kann durch Überexpression des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1 verhindert werden. Interessanterweise besitzt A1 im Gegensatz zu Fast allen anderen Bcl-2 Proteinen keinen C-terminalen Bereich, der das Protein in intrazelluläre Membranen wie Mitochondrien und Endoplasmatisches Retikulum verankert. Ob und gegebenenfalls welche Bedeutung das C-terminale Ende für das Protein und dessen Funktion hat wurde in dieser Arbeit untersucht. Eine C-terminale Deletionsmutante wies im Vergleich zum Wildtyp eine höhere Proteinstabilität auf. Die Fusion der letzten 35 Aminosäuren von A1 an eine enzymatisch inaktive Form von Caspase 3 führte zu einem sehr instabilen chimären Protein. Somit scheint der C-Terminus von A1 sowohl notwendig als auch hinreichend für die kurze Halbwertszeit des Proteins zu sein. Die meisten kurzlebigen Proteine werden über den proteasomalen Signalweg degradiert. Dies scheint auch für A1 zu gelten, da seine Halbwertszeit durch den Einsatz eines Proteasomeninhibitors verlängert wurde. In Koexpressionsstudien konnte zudem eine Ubiquitylierung von A1 beobachtet werden, welche bei der stabileren A1 Mutante stark reduziert war. A1 ist jedoch nicht immer instabil. In Anwesenheit des „BH3-only“ Proteins Bim, das A1 direkt binden kann, wird die Halbwertszeit von A1 enorm erhöht. Die antiapoptotische Funktion von A1 scheint sich jedoch nicht nur auf die Neutralisation durch bloße Bindung zu beschränken, da die Deletionsmutante trotz vergleichbarer Interaktion mit Bim einen sehr viel geringeren Schutz gegen Etoposid vermittelter Apoptose verlieh. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das antiapoptotische Bcl-2 Familienmitglied A1 eine sehr kurze Halbwertszeit besitzt und das der C-Terminus nicht nur die Stabilität sondern auch die antiapoptotische Schutzfunktion für das Protein vermittelt. / The strong stimulation of lymphocytes through their antigen receptors leads to the induction of apoptosis unless a costimulatory signal is provided. This process plays an important role in the negative selection of B-lymphocytes and can be mimicked in the immature murine lymphoma cell line WEHI 231. Engagement of the B-cell receptor (BCR) on WEHI 231 cells leads to apoptosis via a pathway that requires the processing of mitochondria-dependent caspase 9. This can be prevented by overexpression of the antiapoptotic Bcl-2 family member A1. In contrast to most Bcl-2 proteins, A1 does not contain a C-terminal region which recruits it to intracellular membranes of the mitochondria or endoplasmatic reticulum. The aim of this thesis was to investigate the function of the A1 C-terminus. Deleting the C-terminus increased the stability of A1 whereas fusing the last 35 amino acids of A1 onto an enzymatically-inactive caspase 3 mutant leads to a highly unstable chimeric protein. It therefore appears that the C-terminus is responsible for A1´s short half-life. Most short-lived proteins are degraded via the proteasomal pathway. It is likely A1 is also degraded via the proteasomal pathway, since its half-life was increased in the presence of a proteasomal inhibitor. Furthermore, coexpression studies showed a strong ubiquitylation of A1, which was greatly reduced in the stable truncated variant of A1. However, A1 is not always unstable. In the presence of the ”BH3-only“ protein Bim, a direct interaction partner of A1, the half-life of A1 was strongly increased. The antiapoptotic function of A1 can not just be mediated by the binding and neutralising of proapoptotic partners such as Bim because the C-terminal deletion mutant, which can also interact with Bim, fails to protect cells from etoposide-induced apoptosis. Taken together these results show that the Bcl-2 family member A1 has a very short half life and that the C-terminus is not only responsible for its rapid turnover but also for the antiapoptotic function of the protein.

Der humanpathogene Pilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) kann in immunsupprimierten Patienten zum Teil schwere invasive Infektionen auslösen. Trotz Fortschritten in den Behandlungsmöglichkeiten und der medikamentöser Prophylaxe bleibt die Sterblichkeitsrate bei invasiven Erkrankungen hoch. Aus diesem Grund ist die Entwicklung von spezifischeren Immuntherapien von Nöten. Ein Ansatz ist die genetische Modifikation von T Zellen, durch den Transfer von A. fumigatus spezifischen T Zell Rezeptoren (TCRs), für eine adoptive Therapie. Um dieses Konzept zu evaluieren wurden TCRs, die für die extrazellulären Zellwandglykonase Crf1 (Crf1/p41) spezifisch sind, auf primäre T Zellen transferiert und die Effektor-Funktion analysiert. Das Crf1/p41 Epitop induziert bei gesunden Spendern eine funktionelle TH1 Immunantwort gegen A. fumigatus und führt zur Produktion hoher Mengen von Interferon γ (IFN-γ). Für die Identifikation von A. fumigatus spezifischen TCRs wurden siebenunddreißig Crf1/p41 spezifische T Zellklone von drei HLA DRB1*04 Spendern generiert. Anschließend wurden die TCR β Ketten über die sehr variable komplementaritätsbestimmende Region 3 (CDR3) bestimmt. Es konnten zwölf unterschiedliche TCRs ermittelt werden, von denen vor allem die variablen β (Vβ) Kette 18 sehr dominant, während die Vβ Ketten 1 und 6 nur in wenigen Klonen vertreten waren. Zur weiteren Charakterisierung der Crf1/p41 spezifischen TCRs wurden die variablen α (Vα) Ketten bestimmt (Vα 3, Vα 15 und Vα 26). Somit liegt eine polyklonale T Zell Immunantwort vor. Anschließend wurden die Crf1/p41 spezifischen TCRs in den retroviralen Vektor pMP71 kloniert und auf Jurkat 76 Zellen, welche keinen endogenen TCR exprimieren, und auf primäre CD4+ T Zellen transferiert. Die Expression von Crf1/p41 spezifischen TCRs, transduziert in CD4+ T Zellen, zeigten spenderspezifische Unterschiede und die Expression war niedriger im Vergleich zu den transduzierten Jurkat 76 Zellen. Daher wurde auf Optimierungsstrategien zurückgegriffen, die für den adoptiven Transfer mit TCR-modifizierten T Zellen zur Behandlung von Krebs entwickelt wurden. Angewandt wurden die Codonoptimierung der TCR codierenden Sequenz, Murinisierung der TCR konstanter Ketten, Induktion einer weiteren Disulfidbrücke. Ebenfalls wurde das Vektorsystem optimiert. Der Optimierungsprozess der Crf1/p41 spezifischen TCR 1 führte zu einer erhöhten Oberflächenexpression des TCR sowohl in Jurkat 76 (3 bis 5fach) als auch in primären CD4+ T Zellen (2fach). In funktionellen Analysen wurde die Proliferationsfähigkeit und IFN-γ Produktion, durch die Stimulation von transduzierten CD4+ T Zellen (TCR 1 optimiert) mit Crf1/p41 beladenen dendritischen Zellen (DCs), bestätigt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Transfer von A. fumigatus spezifischen TCRs eine protektive anti-fungale Immunantwort fördern könnte. Demzufolge auch als ein geeignetes Mittel in einer potentiellen Immuntherapie gegen A. fumigatus Infektionen in immunsupprimierten Patienten, eingesetzt werden könnte. / The human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) can cause severe invasive infections in immunosuppressed patients. Despite progresses in the treatment and prophylaxis of invasive infections the mortality rate remains high. On that account the development of a more specific immune therapy seems necessary. One approach is genetic modification of T cells by transfer of A. fumigatus specific T cell receptors (TCR) for an adoptive therapy. To evaluate this concept, TCRs specific for a peptide derived from extracellular cell wall glucanase Crf1 (Crf1/p41) were transferred to primary T cells. Than their effector function was analyzed. In healthy donors the epitope Crf1/p41 induces a functional TH1 immune response towards A. fumigatus combined with a high Interferon-γ (IFN-γ) production. To identify A. fumigatus specific TCRs, thirty-seven Crf1/p41 specific T cell clones were generated from three HLA-DRB1*04 positive healthy donors. Afterwards, the TCR β chains were analyzed by sequencing the most variable complementarity determining region 3 (CDR3). Twelve different TCRs were detected whereas variable β (Vβ) 18 was very dominant, and Vβ 1 and Vβ 6 were present only in some clones. For further characterization of Crf1/p41 specific TCRs, variable α (Vα) chains were identified (Vα 3, Vα 15 and Vα 26). Thus, the T cell response is polyclonal. Subsequently Crf1/p41 specific TCRs were cloned into the retroviral vector pMP71 and transduced into Jurkat 76 cells that lack the expression of endogenous TCR, and into primary CD4+ T cells. The expression of Crf1/p41 specific TCR transduced in CD4+ T cells was donor-dependent and the expression was lower compared to transduced Jurkat 76 cells. Consequently, optimizing strategies engineered for TCR-modified adoptive T cell transfer in cancer therapy were used to induce a higher TCR expression on T cells. Those strategies include codon-optimization of the TCR coding sequence, murinization of constant chains of TCR, induction of an additional disulfide bond. Additionally the vector system was optimized. The optimization process of Crf1/p41 TCR 1 led to a higher surface expression in Jurkat 76 (3-5x) and primary CD4+ T cells (2x). Functional analyses revealed proliferation and IFN-γ production after the stimulation of transduced CD4+ T cells (TCR 1 optimiert) with Crf1/p41 pulsed mature dendritic cells (mDC). These data suggest that the transfer of A. fumigatus specific TCRs might foster protective anti-fungal immune responses. Therefore this might be a suitable tool for immunotherapeutic use against A. fumigatus infections in immunosuppressed patients.

Würzburg, University, Diss., 2007.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Einleitung: Eine nicht adäquate Funktion des Immunsystems ist ein großes klinisches Problem, welches Chemotherapien durch schwere bakterielle oder mykotische Infektionen komplikationsreich macht. Während einer Immunantwort spielen Zytokine, die von T-Zellen produziert werden, eine wichtige Rolle für die Effektivität der Antwort. Um zu verstehen, welche Veränderungen während der Therapie im Immunsystem auftreten, untersuchten wir die Subpopulationen und Funktionen (Zytokine , Immunglobuline) der Lymphozyten. Patienten: 23 Kinder (medianes Alter 5y; 2m-14y; 15 weiblich, 8 männlich) mit B-ALL behandelt nach dem ALL-BFM 2000-Protokoll. Blutproben wurden gesammelt bei Diagnosestellung und an den Tagen 8, 15, 33, 64 sowie vor Protokoll M, vor Protokoll 2 und während der Erhaltungstherapie. Methoden: Wir analysierten die Lymphozyten-Subpopulation mittels Durchflußzytometrie. Die Bestimmung intrazelluläre Zytokine (IFN&#947;, IL2, TNF&#945;, IL4, IL5, and IL10) erfolgte durch FACS-Analysen nach in vitro Stimulation mit PMA, Ionomycin und Brefeldin für 24h. Zusätzlich untersuchten wir verschiedene Zytokine im unstimulierten Serum mittels ELISA und studierten TRECs und Spectratypes sowie die Immunglobulinlevels. Ergebnisse: Die B-Zellen verringerten sich schnell von einem Medianen Wert von 301+120/mm³ vor Chemotherapie auf 85+138/mm³ am Tag 33 und stiegen nicht mehr bis zum Ende der Therapie an. Die T-Zellzahl fiel zu Beginn der Therapie ab, allerdings konnten wir partielle Erholungen, die proportional zur Therapieintensität waren detektieren. Zudem fiel eine Verschiebung zugunsten der CD8+-Zellen auf. NK-Zellen zeigten keine signifikanten Veränderungen. Bei den von CD3+ -Zellen produzierten Zytokinen fiel eine Expressionssteigerung von IFN&#947; auf. Wir konnten eine Korrelation zwischen &#947;&#948;-TCR und IFN&#947; -Produktion(FACS) sowie IFN&#947; -Werte(ELISA) und hohe Anzahl von Gedächtniszellen finden. Außerdem korrelieren CD45RA+Zellen mit CD4IL2+Zellen. TGF&#946; im unstimulierten Sera korrelierte signifikant (p<0,01) mit CD19+Zellen. TGF&#946; wurde auch von Blasten exprimiert. Wir stellten Unterschiede im Zytokinprofil zwischen dem mit Dexamethason bzw Prednison behandelten Patienten fest; insbesondere die IFN&#947;-Sekretion war sehr viel größer unter Prednisonbehandlung (p<0,01). TREC-Werte waren höher unter Dexamethason, aber das mag mit beeinflusst sein durch das Alter, da jüngere Kinder signifikant höhere TREC-Werte haben. Bei der Analyse des TZR-Repertoire zeigte sich eine höhere Komplexität im Prednisonzweig. Wir konnten V&#946;-Genfamilien mit höherer Komplexität (BV22, BV23) und mit niedrigerer Komplexität (BV13b, BV6a) detektieren. Die Komplexität des TZR korrelierte positiv mit der Anzahl der naiven T-Zellen und dem Alter(p<0,01). Bis d15 nahm die Komplexität des Repertoires ab und erholte sich langsam im Therapieverlauf. Zusammenfassung: Wir detektierten eine Verschiebung zu Gunsten der TH1-Zytokine. B-Zellen wurden durch die Therapie ausgelöscht. Dieses Ergebnis mag eine klinische Relevanz haben in der prophylaktischen Gabe von Immunglobulinen, um schwere Infektionen durch das Fehlen der B-Zellen zu vermeiden. / Multidrug chemotherapy is a highly effective treatment for paediatric acute lymphoblastic leukaemia (ALL), but at the same time compromises immunity of patients. Immune function in a homogenous cohort of 23 children with standard- and intermediate-risk ALL was analysed by immunophenotyping, intracellular cytokine staining, assessment of serum cytokine concentrations, T-cell receptor (TCR) repertoire diversity and thymic function. B-cells were most severely affected by chemotherapy, rapidly declined under induction and did not recover until the cessation of maintenance therapy. This recovery was paralleled by a relative increase in naive IgM(+)IgD(+)CD27(-) B-cells, indicating de novo B-cell generation as the major pathway for B-cell reconstitution. T- and Natural Killer-cells were less severely affected. Although numerically diminished by chemotherapy, they had partially recovered at the end of induction. Interestingly, CD4:CD8 ratio, distribution of naive versus memory T-cells, cytokine production, TCR-repertoire complexity and thymic function were all only marginally affected by chemotherapy. Patients receiving dexamethasone had significantly less IFNgamma(+) T-cells than those receiving prednisone. Our data show that during chemotherapy in standard- and intermediate-risk paediatric ALL patients the T-cell system remains relatively well preserved. Future studies will show if this effect can be exploited for inclusion of immunotherapy in standard ALL treatment protocols.

Es ist schon lange bekannt, dass das Immunsystem eine wichtige Rolle in der Immunabwehr von malignen Tumoren spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Verhalten der unten genannten Zellen, Rezeptoren und löslichem Protein MICA im peripheren Blut von Patienten mit soliden und hämatologischen Tumorerkrankungen sowie einer Kontrollgruppe mittels Durchflußzytometrie und ELISA-Verfahren untersucht. NK-Zellen ( u.a. CD 56+CD16-NK-Zellen, CD 56-CD16+ Nk-Zellen, CD56+CD16+NK-Zellen), NKT-Zellen und verschiedene T-Lymphozyten ( u.a. αβ-Lymphozyten, δγ-Lymphozyten, Vγ9Vδ1-Lymphozyetn, Vγ9Vδ2-Lymphozyten) sind auf direkten oder indirekten Weg über aktivierende Rezeptoren ( u.a. NKG2D, NKp44, NKp46, NKp33), inhibierende Rezeptoren ( u.a. p 58.1, p58.2, p70, NKG2A) und Chemokinrezeptoren ( u.a. CXCR1) an der Lyse / Apoptose von Tumorzellen über HLA-abhängige (MICA) und HLA-unabhängig Moleküle beteiligt. Es ließ sich zeigen, dass MICA genauso im Serum von hämatologischen Patienten wie auch bei soliden Tumorerkrankungen vorkommt, wobei vor allem Patienten mit fortgeschrittenen Stadien und Metastasierung hohe Werte aufwiesen. Es wurde eine Verminderung der Gesamtzahl an Lymphozyten und αβ-T-Lymphozyten bei hämatologischen und bei soliden Tumoren im peripheren Blut festgestellt. Weiterhin zeigte sich, wie bereits in der Literatur berichtet, bei hämatologischen Neoplasien ein signifikant erhöhter Wert an NK-Zellen und CD56-16+NK-Zellen sowie eine verminderte Expression von NKG2D auf NK-Zellen, auf αβ-T-Lymphozyten und auf γδ-T-Lymphozyten. Es ließ sich auch eine verminderte Expression von p58.1 und NKG2A auf γδ-Lymphozyten im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe nachweisen. Ein signifikanter Unterschied im Vergleich zu soliden Tumoren fand sich nicht, bis auf den oben genannten Lymphozytenanteil. Der Nachweis, dass erhöhte lösliche Serum MICA-Werte die Parameter wie KIRs und KARs sowie Chemokinrezetoren oder die Apopotose der Immunzellen bei hämatologischen oder bei soliden Tumorerkrankungen beeinflusst, konnte in dieser Arbeit nicht geführt werden. Die vorliegende Arbeit trägt dazu bei, die Immunabwehr gegenüber soliden und hämatologischen Tumorerkrankungen besser zu verstehen. / Natural killer cells (NK), NKT cells, αβ-T cells and δγ-T cells play an important role in tumor defence. These cells eliminate tumor cells through killer inhibitory receptors (KIR) and stimulatory killer activating receptors (KAR), which can lyse target cells by binding to the major histocompatibility complex class I-related chain A (MICA) protein. The aim of this study is to analyze the reduction of these immune cells, the association between the levels of soluble MICA with KIR- and KAR-expressing on αβ cells, γδ cells and NK cells and their interaction with chemokine receptor CXCR1in the peripheral blood of patients with haematological and epithelial malignancies. ELISA and flow cytometric analysis were used in comparison to controls. Reduced numbers of αβ-T- cells and the presence of soluble MICA could be demonstrated in the serum of patients with both haematological and epithelial malignancies. Higher levels of soluble MICA were associated with advanced stages of disease and metastasation. Patient samples showed also lower numbers of NK cells and CD56-16+NK cells as well as a reduced expression of NKG2D on NK, αβ and γδ T cells. Confirming existing evidence, there was also a reduced expression of p58.1 and NKG2A on γδ cells in comparison to controls. No significant differences between solid and haematological malignancies were found, except for this type of lymphocytes. The study did not provide evidence that increased levels of soluble MICA influence KIRs and KARs, the chemokine receptors or the apoptosis of immune cells.

Stimulatory or superagonistic (SA) CD28-specific monoclonal antibodies (mAbs) are potent polyclonal activators of regulatory T cells and have proven highly effective as treatment in a wide range of rodent models for autoimmune and inflammatory diseases. In these models, a preferential activation of regulatory T cells was observed by in vivo administration of CD28SA. In stark contrast, human volunteers receiving TGN1412, a humanized CD28-specific mAb, experienced a life-threatening cytokine release syndrome during the first-in-man trial. Preclinical tests employing human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) failed to announce the rapid cytokine release measured in the human volunteers in response to TGN1412. The aim of this thesis project was to find an explanation of why standard PBMC assays failed to predict the unexpected TGN1412-induced "cytokine storm" observed in human volunteers. CD28 superagonists can activate T cells without T cell receptor (TCR) ligation. They do depend, however, on “tonic” TCR signals received by MHC scanning, signals that they amplify. PBMC do not receive these signals in the circulation. Short-term in vitro preculture of human PBMC at a high cell density (HDC) resulted in massive cytokine release during subsequent TGN1412 stimulation. Restoration of reactivity was cell-contact dependent, associated with TCR polarization and tyrosine-phosphorylation, and blocked by HLA-specific mAb. In HDC, both CD4 T cells and monocytes functionally mature in a mutually dependent fashion. However, only CD4 memory T-cells proliferate upon TGN1412 stimulation, and were identified as the main source of pro-inflammatory cytokines. Importantly, responses to other T-cell activating agents were also enhanced if PBMC were first allowed to interact under tissue-like conditions. A new in vitro protocol is provided that returns circulating T-cells to a tissue-like status where they respond to TGN1412 stimulation, and it might represent a more reliable preclinical in vitro test for both activating and inhibitory immunomodulatory drugs. Finally, the surprising observation was made that the IgG1 “sibling” of TGN1412, which is of the poorly Fc receptor-binding IgG4 isotype, has a much lower stimulatory activity. We could exclude steric hindrance as an explanation and provide evidence for removal of TGN1112 from the T-cell surface by trans-endocytosis. / Stimulatorische oder superagonistische (SA) CD28-spezifische monoklonale Antikörper (mAbs) (CD28SA) haben sich in diversen Nagetiermodellen für Autoimmunerkrankungen sowie für inflammatorische Erkrankungen als effektive Behandlungsmöglichkeit erwiesen. In diesen Modellen konnte nachgewiesen werden, dass CD28SA-Injektionen zu einer verstärkten Aktivierung regulatorischer T-Zellen in führen. Entgegen diesen Beobachtungen im Tiermodell reagierten die Teilnehmer einer ersten klinischen Studie auf die Administration des humanisierten CD28SA TGN1412 mit einer akut lebensbedrohlichen systemischen Zytokinausschüttung. Vorklinische Studien an humanen mononukleären Zellen des Blutes (PBMC) hatten keinen Hinweis auf eine mögliche plötzliche Zytokinausschüttungen als Reaktion auf TGN1412 gegeben. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht eine Erklärung zu finden, warum PBMC-basierte Tests, wie sie vorklinischen Studien als Standard eingesetzt werden, nicht auf den unerwarteten TGN1412-induzierten „Zytokinsturm“ der Probanden hinwiesen. CD28SA aktivieren T-Zellen ohne Ligation des T-Zell Rezeptors (TCR). Jedoch werden zur CD28SA-abhängigen Aktivierung von T-Zellen „tonische“ TCR Signale benötigt, die durch MHC Scanning der T-Zellen an der Oberfläche anderer Zellen erzeugt werden. PBMC, welche sich in der Zirkulation befinden, erhalten diese „tonischen“ TCR Signale nicht. Kurzzeitige Vorkultur humaner PBMC bei hoher Zelldichte (high-density culture, HDC) führte zu einer starken Zytokinantwort bei nachfolgender TGN1412 Stimulation. Diese wiedererlangte Reaktivität gegenüber TGN1412 ging mit Tyrosin-Phospholrylierung sowie der Polarisierung von TCR Molekülen einher, war abhängig von Zellkontakten und konnte durch HLA-spezifische mAbs geblockt werden. Während der HDC durchlaufen sowohl CD4 T-Gedächtniszellen, als auch Monozyten eine voneinander abhängige funktionelle Reifung. TGN1412-induzierte Zellproliferation beschränkt sich jedoch auf CD4 T-Gedächtniszellen, die auch die Hauptquelle der proinflammatorische Zytokine sind. Antworten auf weitere T-Zell aktivierende Agenzien waren ebenfalls erhöht, wenn PBMC zunächst auf gewebeartige Bedingungen zurückgesetzt wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt damit ein neuartiges in vitro Protokoll für humane PBMC, welches T-Zellen der Zirkulation in einen gewebeartigen funktionellen Status versetzt, in welchem sie auf TGN1412 antworten. Dieses Protokoll könnte auch einen verlässlicheren vorklinischen in vitro Test sowohl für aktivierende als auch für inhibierende immunmodulatorische Medikamente darstellen. Im letzten Teil der Arbeit wird die erstaunliche Beobachtung vorgestellt, dass TGN1112, ein IgG1 Antikörper mit gleicher Spezifität wie der IgG4 Antikörper Antikörper TGN1412, trotz seiner höheren Affinität für Fc-Rezeptoren eine viel geringere stimulatorische Aktivität zeigt. Sterische Hinderung konnte als eine mögliche Erklärung ausgeschlossen werden. Vielmehr scheint das Entfernen von TGN1112/CD28 Komplexen von der T-Zelloberfläche durch Trans-Endozytose eine mögliche Erklärung für die geringere Aktivität zu sein.

Typ 1 NKT Zellen oder iNKT Zellen (invariante Natürliche Killer T Zellen) stellen eine Subpopulation der abT Zellen dar, die sich durch mehrere charakteristische Eigenschaften aus- zeichnet. Ihr Hauptmerkmal ist die Expression eines semi-invarianten T Zellrezeptors (TCR), der die Bindung von CD1d:Glycolipid Komplexen ermöglicht, wohingegen ‚klassische‘ T Zellen an Komplexe aus MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Molekülen und Peptiden binden. Die während der Reifung im Thymus durch Transkriptionsfaktoren festgelegte Voraktivierung der iNKT Zellen ermöglicht das unmittelbare Freisetzen von Cytokinen bei Antigenkontakt, wodurch iNKT Zellen die adaptive Immunantwort stark beeinflussen können: Sie tragen sowohl zur Regulation von Autoimmunerkrankungen als auch der Bekämpfung von Krebs und Infektionen bei. Der iNKT TCR setzt sich aus einer invarianten a-Kette (AV14/AJ18 in der Maus bzw. AV24/AJ18 im Menschen) und einer charakteristischen Auswahl an b-Ketten (vorwiegend BV8S2, BV7 und BV2 in der Maus und BV11 im Menschen) zusammen. Das Cerebrosid a-Galactosylceramid (aGC, KRN7000) stellt eines der potentesten Antigene für iNKT Zellen dar. Die Präsentation dieser Antigenklasse erfolgt durch CD1d Moleküle, die, abgesehen von tiefen hydrophoben Bindungstaschen, strukturell MHC I Molekülen ähneln, jedoch nicht polymorph sind und außerhalb des MHC Locus codiert sind. Die, zwischen Maus und Mensch hochkon- servierte, Interaktion von iNKT TCR und CD1d:aGC Komplex zeichnet sich bei potenten Antigenen durch die eingeschränkte Nutzung der Antigenspezifität bestimmenden Regionen aus: CDR1a, CDR3a und CDR2b. Die den CDR3b definierende V-D-J Umlagerung der b-Kette stellt im iNKT TCR den Bereich der höchsten Variabilität dar, beeinflusst jedoch nur die Bindung schwächerer Antigene. Natürlich auftretende Variabilität innerhalb der a-Kette kann durch Abweichungen von der kanonischen V-J Umlagerung am Beginn des CDR3a entstehen und beeinflusst ebenfalls die Bindung des iNKT TCR. Die iNKT Zellpopulation in F344 Ratten ähnelt in Frequenz und Korezepotorexpression derjenigen des Menschen. Ratten besitzen ein CD1D Gen, welches hoch homolog zu denen der Maus ist und zwei dem BV8S2 Gensegment der Maus homologe BV Segmente (BV8S2 und BV8S4), die in F344 Ratten beide funktionell sind. Eine Besonderheit der Ratte ist jedoch das Auftreten einer AV14 Multigenfamilie von bis zu zehn Gensegmenten. Diese unterscheiden sich neben dem HV4 vor allem in ihren CDR2 Sequenzen und werden anhand dieser Unterschiede in zwei Gruppen (Typ 1 und 2) eingeteilt. Zusätzlich wurde in der iNKT Zellpopulation eine hohe Frequenz an natürlich auftretenden A93G Substitutionen in der TCR↵ Kette beschrieben und es wurde gezeigt, dass, im Gegensatz zur Kreuzreaktivität zwischen iNKT TCR und CD1d von Maus und Mensch, iNKT Zellen der Ratte nicht an Maus CD1d binden. Die Besonderheiten des Ratten iNKT TCR und deren Auswirkungen auf die TCR Expression und Ligandenbindung der Ratten iNKT Zellpopulation wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht. Durch in dieser Arbeit durchgeführte in vitro Mutagenesestudien konnten Position 68 in der vierten Hypervariablen Schleife (HV4↵) und Position 93 zu Be- ginn des CDR3↵ als entscheidende Modulatoren der CD1d Bindung im iNKT TCR von Ratte und Maus identifiziert werden, wobei auch speziesspezifische Unterschiede aufgedeckt werden konnten. Die Spezieskreuzreaktivität des Ratten iNKT TCR selbst hing stark von einer A93G Substitution im TCRa ab. Bei Untersuchungen der b-Kette zeigte sich, dass sowohl BV Segmente als auch CDR3b Region die Ligandenbindung in differenziellem Zusammenspiel beeinflussen, was bei Paarung mit unterschiedlichen AV14 Segmenten verschieden ausgeprägt sein konnte. Weiterhin wurden humane CD1d Dimere generiert und zum ersten Mal die Bindung von Ratten CD1d an humane iNKT TCR gezeigt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit das TCR Repertoire von iNKT Zellen der F344 Ratte und deren CD1d Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurde die bereits etablierte Methode der in vitro Expansion von iNKT Zellen aus der Rattenmilz weiterentwickelt, was die Langzeitkultur und -expansion der sortierten iNKT Zellpopulation ermöglichte. Bei Untersuchung der TCR Expression konnte gezeigt werden, dass die Auswahl der im Ratten iNKT TCR genutzten BV Gensegmente ähnlich limitiert ist wie in der Maus. Neben der dominanten Nutzung der BV8S4 und BV8S2 Gensegmente wurden hauptsächlich BV8S1, BV14 und BV7 gefunden. Bei Untersuchungen der CD1d Dimerbindung der iNKT Zellpopulation konnte der Einfluss der na- türlich auftretenden A93G Substitution in der iNKT TCRa Kette bestätigt werden. Außerdem zeigte sich hier ebenfalls der Einfluss des BV Gensegments auf die Ligandenbindung, wobei BV8S4 negative Zellen im Vergleich zu BV8S4 positiven Zellen eine stärkere Ratten CD1d Dimerbindung zeigten. / Type 1 NKT cells, also called iNKT cells (invariant Natural Killer T cells), are a subpopulation of abT cells with characteristic features. Their hallmark is the expression of a semi-invariant T cell receptor (TCR) which binds CD1d:glycolipid complexes. This is in contrast to ‚conventional‘ T cells which bind complexes of MHC (major histocompatibility complex) molecules and peptides. iNKT cells show a transcription factor dependend, preactivated phenotype which is obtained during their development in the thymus. This allows for immediate cytokine release after antigen encounter and enables iNKT cells to strongly influence the adaptive immune re- sponse: They are not only able to help regulating autoimmune diseases, but also contribute to the clearance of cancer and infections. The iNKT TCR is composed of an invariant a-chain (AV14/AJ18 in mice, AV24/AJ18 in humans) and a limited number of � chains (mostly BV8S2, BV7 and BV2 in mice and BV11 in humans). a-galactosyceramide (aGC, KRN7000), a cerebroside, is one of the most potent iNKT cell antigens known so far. iNKT cell antigens are presented by CD1d, a non polymorphic molecule which is encoded outside the MHC locus. CD1d molecules resemble MHC I structurally but possess deep hydrophobic pockets as antigen binding grooves. The iNKT TCR interaction with CD1d:aGC complexes is highly conserved between mice and humans. Its binding mode is characteristic for the restricted CDR (complementarity determining region) usage and relies mostly on CDR1a, CDR3a and CDR2b. The only highly variable region within the iNKT TCR, the CDR3b defining diverse V-D-J rearrangement of the TCRb chain, has been shown to only influence binding to less potent antigens. Natural variability within the TCRa chain is usually only possible due to non canonical AV14/AJ18 rearrangements at the beginning of CDR3a and has been shown to indirectly influence ligand binding. The iNKT cells in F344 rats resemble human iNKT cells in terms of frequency and coreceptor expression profile. Rats have one CD1D gene, highly homologous to those found in mice, and two BV8S2 homologs (BV8S2 and BV8S4 ), which are both functional in F344 rats. Peculiar for the rat is the presence of an AV14 gene family with up to ten members, which have been grouped by their CDR2↵ sequences into Type 1 and 2, and a high frequency of A93G substitutions within the iNKT TCRa chains. Additionally, in contrast to the species cross-reactive interaction of iNKT TCR and CD1d from mice and humans, a lack of mouse CD1d binding by the rat iNKT TCR has been demonstrated. Those characteristic features of the rat iNKT TCR and its influence on TCR expression and ligand binding of rat iNKT cells were investigated in this study. Due to in vitro mutagenesis studies conducted in this thesis, position 68 within the fourth hypervariable loop of the TCRa chain (HV4a) as well as position 93 at the start of CDR3a could be identified as strong modulators of CD1d binding within the iNKT TCR of rat and mouse with specific features for both species. Furthermore, species cross-reactivity of rat iNKT TCR was found to be strongly enhanced due to the naturally occuring A93G substitution within the rat TCRa chain. The analysis of the rat iNKT TCRb chain showed that BV segments as well as the highly diverse CDR3b region influence CD1d binding in a complex interplay, which also differs depending on the paired a-chain. Furthermore, human CD1d dimers were generated and for the first time binding of rat CD1d to human iNKT TCRs could be shown. Additionally, the TCR repertoire of F344 rat iNKT cells and its ligand binding has been characterized in this study. For this purpose, the already established in vitro expansion of rat iNKT cell from splenocytes was further developed, allowing long term culture and expansion of purified iNKT cell populations. Analysis of the TCR expression did reveal a restricted BV segment usage, similar to mouse iNKT cells. Besides the predominant usage of BV8S2 and BV8S4 gene sements, mainly BV8S1 BV14 and BV7 were found. CD1d dimer binding studies confirmed the influence of the A93G substitution on ligand binding properties of the rat iNKT cell population and the influence of different BV segments on CD1d binding could also be seen by comparison of BV8S4 positive and negative iNKT cell subpopulations, where BV8S4 usage led to a lower rat CD1d binding profile.

Nach Ischämie und Reperfusion des Pankreas kommt es zu einer Mikrozirkulationsstörung sowie zu einer T-Zell-induzierten subakuten entzündlichen Reaktion mit daraus resultierender Zellzerstörung. Ziel dieser tierexperimentellen Arbeit war es, sowohl den Einfluss des S1PStrukturanalogons FTY720 auf zirkulierende T-Lymphozyten und deren Endothel- Interaktion in den postkapillären Venolen des Pankreas zu beobachten sowie die Mikrozirkulation und damit das Ausmaß des Ischämie-Reperfusionsschadens nach einer 60-minütigen Pankreasischämie durch die Gabe von FTY720 zu beurteilen. Hierfür erfolgte eine reversible Okklusion der zuführenden Gefäße des Pankreas an Ratten (48 Wistar-Ratten, 300 - 350 g KG) für 60 Minuten zur Induktion einer normothermen Pankreasischämie. Untersucht wurden folgende Gruppen: I Scheinoperation ohne Therapie, II Scheinoperation und Therapie, III Ischämie ohne Therapie, IV Ischämie und Therapie mit dem Sphingosin-1-Phosphat Strukturanalogon FTY720 (1 mg/kg KG i.v., Substitution 10 Minuten vor Reperfusionsbeginn). Mit Hilfe der invivo-Fluoreszenzmikroskopie wurden die Parameter der Mikrozirkulation (Zellzahl, Flussgeschwindigkeit, Kapillardurchmesser, Funktionelle Kapillardichte, T-Lymphozyten-Endothel-Interaktion und Leukozyten-Endothel- Interaktion) 10 Minuten nach Substitution der markierten CD4+-T-Lymphozyten beurteilt. Des Weiteren wurde der Blutparameter Lipase bestimmt. Die Studie erbrachte folgende Ergebnisse: 1. Die intravenöse Therapie mit FTY720 als Sphingosin 1-Phosphat-Rezeptor- Agonist 15 Minuten vor Reperfusion führte zu einer partiellen Verbesserung der Mikrozirkulation des Pankreas mit signifikant erhöhten Kapillardurchmesser und Funktioneller Kapillardichte. 2. Es zeichneten sich bei allen weiteren Parametern nur Tendenzen einer Verbesserung unter Substitution von FTY720 ab (Flussgeschwindigkeit, Lipase). 3. Eine Aussage zur T-Lymphozyten-Endothel-Interaktion konnte aufgrund der geringen Anzahl von „rollern“ und „stickern“ nicht gemacht werden. 4. Eine quantitative Auswertung der zirkulierenden Leukozyten war nicht möglich. Das vorliegende Bildmaterial war jedoch in allen Gruppen identisch, sodass hier kein Effekt von FTY720 auf zirkulierende Leukozyten nachweisbar war. 5. Zu einer signifikanten Zunahme der T-Lymphozyten-Zahl kam es in der Gruppe IV (Ischämie und Therapie mit FTY720). Die Ergebnisse dieser tierexperimentellen Untersuchung zeigen, dass die intraoperative Gabe des Immunmodulators FTY720 nur partiell eine Verbesserung der Mirkozirkulation und daraus resultierend eine Verminderung des Ischämie-Reperfusionsschadens bewirkt. Nach den Ergebnissen dieser Studie und dem aktuellen Stand der Literatur wäre somit für ein optimales Wirkmaximum die präoperative Gabe von FTY720 erforderlich. Die Studie zeigt ebenfalls, dass die Substitution der markierten CD4+-T-Lymphozyten zu einem früheren Zeitpunkt erfolgen muss, um eine Wirkung des FTY720 auf diese T-Zellen nachweisen zu können.