Ein zentrales Merkmal der humoralen Antwort ist die im Laufe der Zeit ansteigende Affinität der Antikörper gegenüber dem Antigen, ein Phänomen, das man generell als Affinitätsreifung bezeichnet. Die Affinitätsreifung von Antikörpern ist an die transiente Ausbildung von Keimzentren gebunden, die man nach Immunisierung mit einem T-Zell-abhängigen Antigen in sekundär lymphatischen Geweben wie der Milz beobachtet. Innerhalb der Keimzentren durchlaufen B-Zellen einen mikro-evolutionären Prozess, in dessen Verlauf es zu einer Diversifizierung der von den B-Zellen kodierten B-Zell-Rezeptoren durch somatische Hypermutation und anschließender Selektion derjenigen B-Zellen mit den besten Bindungseigenschaften gegenüber dem Antigen kommt. In den letzten Jahren waren große Fortschritte hinsichtlich der Aufklärung der molekularen Mechanismen die zur Diversifizierung der B-Zell-Rezeptoren beitragen zu verzeichnen, wohingegen die Dynamik, der Mechanismus und die treibenden Kräfte der Selektion bisher weitgehend unverstanden sind. In Kürze zusammengefasst trägt die vorliegende Arbeit durch folgende Erkenntnisse zum Verständnis der Evolution von B-Zellen in Keimzentren bei: (1) nicht-synchronisiertes Wachstumsverhalten von Keimzentren, (2) mehrstufige Selektionsstrategie (Verknüpfung von lokaler und globaler Selektion durch Rezirkulation von ausgewanderten Keimzentrums-B-Zellen), (3) zentrale Rolle von Makrophagen für die Homöostase von Keimzentren und die Verhinderung von Autoimmunität, (4) bisher angenommene molekulare Signaturen sind unzulänglich, um positiv und negativ selektierte B-Zellen zu unterscheiden und (5) das Überleben bzw. positive Selektion von Keimzentrums-B-Zellen ist von der Abwesenheit überschüssiger, nachteiliger Mutationen in den CDRs abhängig. / Central to the humoral immune response is the commonly observed improvement of antibody affinity over time, a phenomenon referred to as affinity maturation. Affinity maturation takes place in so-called germinal centers (GC) that are transiently formed in secondary lymphoid tissues (e.g. spleen) following immunization with T cell-dependent antigens. Within GC, B lymphocytes are subjected to a micro-evolutionary process that includes multiple rounds of diversification of their B cell receptors (BCRs) by somatic hypermutation (SHM) and subsequent selection of those B cells showing improved binding characteristics towards the antigen. However, despite recent advances in defining the mechanisms contributing to diversification of B lymphocytes within GC, the dynamics, mechanisms and forces of their selection are poorly understood. The current thesis provides new insights into the evolution of B cells within GC by proposing: (1) non-synchronized GC formation and growth, (2) a multilevel selection strategy (intercalation of local and global selection by recirculation of GC emigrant B cells), (3)a central role for macrophages in retaining germinal center B cell homeostasis and preventing autoimmunity, (4) the failure of commonly supposed molecular signatures to demarcate positively and negatively selected B cells and (5) the survival fate of GC B cells is particularly driven by absence of excess mutations within CDRs that have an adverse effect with respect to antigen binding.

Die adaptive Immunantwort wird von T-und B-Lymphozyten realisiert. Nachdem der Antigenrezeptor auf T-Zellen durch die Interaktion mit einem MHC-Peptid Komplex auf APZ getriggert wurde, sind kostimulatorische Moleküle ein zweiter Kontrollpunkt für die Immunantworten interagierender Zellen. Für das Abschalten von ungewollten Immunantworten, z.B. Autoimmunantworten, sind Moleküle der kostimulatorischen Molekülfamilien auf den T- und B-Zellen von außerordentlicher Bedeutung. Ein zentrales kostimulatorisches Molekül ist das Molekül CTLA-4. Wir untersuchten den Einfluss von regulatorischen Zellen auf den Verlauf einer EAE, die durch einen Wechsel von Remission und Rezidiv gekennzeichnet ist. Neben den CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+ T-Zellen konnten wir ebenfalls CD4+CD25-Foxp3+CTLA-4+ T-Zellen in den das Gehirn infiltrierenden Lymphozyten sichtbar machen. Wir fanden gleiche Zahlen an CD4+CD25+ Zellen, die auch intrazellulär CTLA-4 exprimierten, während der akuten Phase und ersten Remission, wobei aber Oberflächen CTLA-4+CD4+ Zellen während der akuten Phase deutlich erhöht waren. Eine Depletion der natürlich vorkommenden CD4+CD25+ Treg Zellen vor dem Auslösen einer EAE führte zu einem schnelleren Krankheitsausbruch und schwererem sekundär progressivem Krankheitsverlauf. Obwohl die erste Remission von der CD4+CD25+ Treg Zelldepletion unbeeinflußt blieb, konnten bereits im ersten Krankheitsschub signifikant erhöhte Antigen spezifische proinflammatorische Zytokine der T-Zellen detektiert werden. Damit wird deutlich, dass der sekundär progressive Verlauf durch CD4+CD25+ Treg Zelldepletion bereits zeitig während des Krankheitsverlaufes eingeleitet wird. Wir konnten CTLA-4 ebenfalls in B-Zellen nachweisen. Die Expression von intrazellulärem und Oberflächen CTLA-4 in aktivierten B-Zellen ist strikt T-Zellen abhängig und hat ihr Maximum 48-72h nach Stimulation in vitro. Durch den Einsatz hochsensitiver Zellanreicherungsverfahren konnte der Nachweis der mRNA für CTLA-4 in den B-Zellen aus T-Zellabhängigen Zellkultursystemen erbracht werden. Die Induktion der mRNA für CTLA-4 kann unter bestimmten Umständen durch CD19 Kreuzvernetzung in B-Zellen erfolgen. Durch den Einsatz von Knochenmarkschimären, in denen CTLA-4 spezifisch nur in B-Zellen deletiert wird, konnte gezeigt werden, dass CTLA-4 in B-Zellen die primäre IgE und IgM und die sekundäre IgM Produktion in Thymus abhängigen Immunantworten steuert. Diese Daten implizieren für alle Thymus abhängigen Immunantworten eine noch komplexere Regulation, bei der CTLA4 in B-Zellen deren Effektorfunktion intrinsisch modulieren kann. / T and B lymphocytes carry out the adaptive immune response. After the antigen receptor on T cells is triggered through interaction with an MHC:peptide complex on APCs, costimulatory molecules are a second checkpoint for immune responses of interacting cells. To terminate unwanted immune responses, such as autoimmune responses, molecules of the costimulatory molecule family on T and B cells are of great importance. A central costimulatory molecule is CTLA-4 (CD152). We investigated the influence of regulatory cells on the course of an EAE, a disease marked through alterations of remission and relapses. Apart from the CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+ T cells we also detected CD4+CD25-Foxp3+CTLA-4+ T cells within the brain-infiltrating lymphocyte population. Furthermore we found similar numbers of CD4+CD25+ cells that also expressed intracellular CTLA-4, during the acute phase and first remission from EAE, whereas surface CTLA-4+CD4+ cells were clearly elevated during the acute phase. The depletion of the natural occurring CD4+CD25+ Treg cells before EAE induction leads to an accelerated disease onset and an increase in disease severity combined with a secondary progressive disease course. Even though the first remission was unaffected by the depletion of CD4+CD25+ Treg cells before disease induction, the antigen specific proinflammatory cytokine production of T cells during the acute phase was already significantly increased. The data show, that the secondary progressive disease course after CD4+CD25+ Treg cell depletion is already determined early during the course of EAE. On a second approach we found CTLA-4 expression as well on B lymphocytes. The expression of intracellular and surface CTLA-4 on activated B cells is strictly T cell dependent and the expression is maximal 48-72h after stimulation in vitro. Through the use of highly sensitive cell sorting strategies we were able to detect the mRNA for CTLA-4 in B cells cultured with activated T cells. CTLA-4 mRNA in B cells is inducible in isolated B cells via crosslinking of CD19 in vitro. We generated bone marrow chimeric mice, in which only B cells were CTLA-4 deficient. With these mice we could show, that CTLA-4 on B cells controls the primary IgE and IgM, as well as the secondary IgM production in thymus dependent immune responses. These data imply a more complex regulation of thymus dependent immune responses, in which CTLA-4 on B cells can modulate B cell effector functions.

Konventionelle CD8 T-Zellen im intestinalen Epithel unterscheiden sich von T-Zellen gleicher Spezifität in anderen Organen. In dieser Arbeit sollten Mechanismen identifiziert werden, welche die Migration dieser T-Zellen in intestinale Gewebe bestimmen und/oder welche die funktionelle Adaption der T-Zellen an die mukosale Umgebung beeinflussen. Hierfür wurden Mäuse mit einem rekombinanten Listeria monocytogenes Stamm (LmOVA) infiziert, OVA-spezifische CD8 T-Zellen aus der Milz und dem intestinalem Epithel isoliert, und die mRNA-Expressionsprofile dieser Zellen mittels einer Mikroarray-Analyse verglichen. Eine Gruppe von NK-Rezeptoren zeigte auf OVA-spezifischen CD8 T-Zellen aus der intestinalen Mukosa eine geringere Expression. Dieser Unterschied war nach einer oralen Infektion wesentlich stärker ausgeprägt, als nach einer intravenösen Infektion. Die Präsenz der natürlichen Darmflora hatte nur einen sehr geringen Einfluss auf diese organspezifisch unterschiedliche NK-Rezeptor-Expression. Untersuchungen in transgenen CD4dnTGFbetaRII Mäusen wiesen auf TGFbeta als ein entscheidendes Element für die niedrigere NK-Rezeptor-Expression auf T-Zellen in der Darmmukosa hin. Die zweite Fragestellung war die, ob nach einer Lm-Infektion die primäre Aktivierung naiver CD8 T-Zellen und die Re-Aktivierung von Gedächtnis-T-Zellen auch außerhalb sekundärer lymphoider Organe stattfinden kann. Hierfür wurden Mäuse mit der immunmodulatorischen Substanz FTY720 behandelt und splenektomiert. Eine FTY720-Behandlung beeinträchtigte nach iv und nach ig Infektion weder die Ausbreitung der Lm, noch die Fähigkeit der Mäuse zu einer Elimination der Bakterien. Orale Infektionen sowie höher dosierte iv Infektionen führten auch in FTY720-behandelten und zusätzlich splenektomierten Mäusen zu einer T-Zell-Akkumulation und Proliferation in nicht-lymphoiden Organen. Nach einer niedrig dosierten iv Lm-Infektion wurden dagegen in FTY720-behandelten und splenektomierten Mäusen keine OVA-spezifischen T-Zell-Antworten ausgelöst. Insbesondere die Milz schien hier für die T-Zell Aktivierung und Proliferation erforderlich zu sein. Auch für eine Sekundärantwort nach einer iv Infektion mit LmOVA waren lymphoide Gewebe für die Ausbildung einer effektiven T-Zell-Antwort essentiell. / Conventional CD8 T cells in the intestinal epithelium differ from T cells with identical antigen specificity in other organs. One aim of this study was, to identify mechanisms, which determine gut-tropism of these T cells or which influence the functional adaptation of these cells to the mucosal environment. For this purpose, mice were infected with a recombinant Listeria monocytogenes strain (LmOVA). OVA-specific CD8 T cells were isolated from spleen and intestinal epithelium and the mRNA-expression profiles of these cells were compared in a microarray-analysis. One group of NK-receptors were substantially less expressed on Lm-specific CD8 T cells from the intestinal mucosa than on corresponding cells from the spleen. This difference was much more pronounced following oral infection than following iv infection. The presence of the natural gut-flora only slightly influenced the organ-specific NK-receptor expression in CD8 T cells. Experiments with transgenic CD4dnTGFbetaRII mice point to TGFbeta as a decisive factor for the low NK-receptor expression on T cells from the gut mucosa. In the second part of this study it was investigated, whether, following Lm infection, priming of naive CD8 T cells and re-activation of memory T cells could occur outside of secondary lymphoid organs. Mice were treated with the immunomodulatory drug FTY720 and splenectomized. Treatment with FTY720 did neither diminish bacterial dissemination into spleen, liver and MLN, nor impaired the ability of the mice to control the bacteria and to eradicate them from these organs. Oral infection and high dose iv infection led to T cell accumulation and proliferation in nonlymphoid organs of FTY720-treated and additionally splenectomized mice. Following low dose iv infection with LmOVA, no OVA-specific T cell responses were induced in FTY720-treated and additionally splenectomized mice. Especially the spleen seemed to be important for T cell activation and proliferation under these conditions. Also following a secondary iv infection with LmOVA, lymphoid tissues were essential for the generation of an effective T cell response.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von intraepithelialen Lymphozyten (IEL), oxidativem Streß und endogenen Schutzmechanismen bei GvHR, Dünndarmtransplantation, Sepsis, Morbus Crohn sowie intestinalem Ischämie/Reperfusionsschaden (I/RS) analysiert. Die Bestimmung der phänotypischen und funktionellen Charaktistika der IEL im Rahmen der o. g. Erkrankungen wies auf eine Selektion bestimmter T-Zell Subpopulationen in der Darmschleimhaut hin. Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß IEL nicht nur als Effektorzellen zur mukosalen Barrierefunktion beitragen, sondern auch regulierende Funktionen bei weiteren Abwehrmechanismen der Darmschleimhaut, wie z.B. der NOS-2 Expression besitzen. Die Untersuchungen zum intestinalen I/RS zeigten eine Gewebeschädigung nicht nur im Darm sondern auch der Leber nach selektiver intestinaler Ischämie. Dabei konnte in beiden Organen oxidativer Streß als ein Faktor der Gewebeschädigung nachgewiesen werden. Bei der Modulation des I/RS durch Gabe von Zytokinen konnte eine Zunahme des I/RS durch Gabe von IL-10 und eine Abnahme des I/RS durch IL-2 erreicht werden. Der positive Effekt der IL-2 Gabe war von einer verstärkten und verlängerten NOS-2 mRNA Expression sowie einer gesteigerten NO-Freisetzung begleitet. Im Gegensatz dazu fehlte nach IL-10 Gabe die Zunahme der NOS-2 Epxression ebenso wie ein Anstieg der NO-Metabolite im Serum. Die verminderte NO-Produktion könnte somit den negativen Effekt des anti-inflammatorischen IL-10 auf den I/RS erklären. / In this study, the role of intraepithelial lymphocytes (IEL) was analyzed in Graft-versus-Host disease, small bowel transplantation, sepsis and inflammatory bowel disease. Furthermore, the influence of oxidative stress and endogenous protective mechanisms on the development of intestinal ischemia/reperfusion injury was determined. The phenotypic and functional characteristics of IEL in these diseases indicated that only specific T-cell subsets selectively migrate and/or survive in the intestinal mucosa. In addition, it was demonstrated that IEL display several functions in the intestinal barrier system: they are cytolytic effector cells, but do also exert regulatory functions on the expression of mucosal host defense mechanisms such as NOS-2 expression. The investigations on intestinal ischemia / reperfusion injury revealed that selective intestinal ischemia induces tissue injury not only in the intestine, but in the liver as well. In both organs, oxidative stress plays a predominant role in the development of tissue destruction. Modulation of I/RS by administration of cytokines lead to increased tissue damage after IL-10 administration and reduced tissue injury after IL-2 administration. The beneficial effect of IL-2 may have been due to an increased NOS-2 mRNA expression and the subsequently increased NO production. In contrast, IL-10 administration failed to induce an increased NOS-2 mRNA expression or NO production in the intestine and liver.

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Subklinische entzündliche Veränderungen des Endometriums können nur durch die histopathologische Untersuchung eines Bioptates diagnostiziert werden und sind von besonderer Bedeutung bei Fertilitätsstörungen. Die nicht-eitrige (NE) Endometritis ist gekennzeichnet durch eine Infiltration des Endometriums mit Lymphozyten, Plasmazellen und/oder Makrophagen. Die genaue Pathogenese ist unklar. Die immunhistologische Phänotypisierung dieser Zell-(sub-)populationen kann möglicherweise pathogenetische Hinweise geben. Der immunhistologische Nachweis equiner Immunzellen ist jedoch fast ausschließlich an Gefrierschnitten etabliert. Dies ist für die Routinediagnostik ungeeignet. Demzufolge ergaben sich die folgenden Ziele: 1. Eine alternative Methode zur Gewebsfixierung zu etablieren, die in der Routinediagnostik praktikabel einsetzbar ist, die einen guten Strukturerhalt, eine geeignete Anfärbbarkeit und ideale Auswertbarkeit gewährleistet sowie umfangreiche immunhistochemische Untersuchungen ermöglicht; 2. Die immunhistochemische Phänotypisierung von Lymphozyten- und Makrophagen-(sub-)populationen an fixierten equinen Gewebeproben zu entwickeln; 3. Eine semiquantitative Bestimmung der endometrialen Entzündungszellen ohne und mit einer NE Endometritis durchzuführen. Tiere, Material & Methoden: Gewebeproben (Lymphknoten als Referenzgewebe und endometriales Gewebe) wurden von 5 Stuten im Rahmen der Sektion entnommen, in Formalin (F), HOPE® (H) oder IHC Zinc Fixative (Z) fixiert und zusätzlich als natives Gefriermaterial aufgearbeitet. Es erfolgte eine vergleichende Beurteilung der Gewebemorphologie, des Färbeverhaltens und der Artefakte am equinen Endometrium in HE gefärbten Gefrierschnitten bzw. im fixierten, Paraffin-eingebetteten Material (F, H und Z). Equine Lymphknoten dienten als Referenzgewebe für die immunhistochemische Etablierung der Lymphozytenmarker (anti-CD3, -CD4, -CD8) an Gefrierschnitten und am fixierten, Paraffin-eingebetteten Material (F, H und Z). F- und Z-fixiertes Referenzgewebe (Leber, Dünndarm, Darmlymphknoten) von 4 Stuten wurde für die Etablierung der Makrophagenmarker (anti-CD172a, -CD14, -CD206) verwendet. Die Immunreaktionen der Primärantikörper wurden verglichen. Als Resultat aus den vergleichenden Analysen wurde die Z-Fixierung als effektivste alternative Fixierungsmethode ausgewählt. Im abschließenden Teil der Untersuchungen wurden 28 Z-fixierte Endometriumbioptate hinsichtlich der Entzündungszellen semiquantitativ ausgewertet. 4 Stuten zeigten keine Entzündungsreaktion und dienten als Kontrolle. 24 Stuten wiesen eine oberflächliche NE Endometritis auf. Die Anzahl CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD14+ und CD206+ Zellen sowie die Anzahl von Plasmazellen mittels Methylgrün-Pyronin-Färbung wurde an Serienschnitten in 5 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern (400x) jeweils für das Stratum compactum, Stratum spongiosum und das luminale sowie glanduläre Epithel erhoben. Ergebnisse: 1. Die Z-Fixierung zeigt mit der F-Fixierung vergleichbare, exzellente Eigenschaften hinsichtlich des Strukturerhalts, der Anfärbbarkeit und Auswertbarkeit. Sie übersteigt insgesamt die Eigenschaften der H-Fixierung: die Z-Fixierung erweist sich einfacher in der Anwendung und zeigt eine geringere Artefaktbildung. 2. Die immunhistochemische Charakterisierung von T- und B-Lymphozyten, Helfer-T-Lymphozyten sowie zytotoxischen T-Lymphozyten und Makrophagenpopulationen sowie der Nachweis von Plasmazellen mittels Methylgrün-Pyronin-Färbung an Z-fixierten equinen Gewebeproben ist möglich. 3. Im entzündlich veränderten Endometrium sind mehr CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD206+ Zellen sowie Plasmazellen nachweisbar als in unveränderten Gewebeproben bezogen auf das Stratum compactum und Stratum spongiosum. Die durchschnittliche Anzahl CD3+ Zellen ist im Stratum compactum NE Endometritiden knapp 3x höher als im unveränderten Endometrium. Wenige CD20+ B-Zellen und CD172a+ Makrophagen sowie eine unterschiedliche Anzahl an Plasmazellen sind innerhalb des Stratum compactum entzündlich veränderter Endometrien nachweisbar. Es existieren große individuelle Unterschiede in der Anzahl CD4+ und CD8+ T-Zellen in Endometrien ohne sowie mit einer Entzündung. Schlussfolgerungen: Eine Integration der Z-Fixierung in die Routinediagnostik mit zusätzlichen Anwendungsmöglichkeiten ist problemlos möglich. Die immunhistochemische Entzündungszelldifferenzierung im Endometrium der Stute kann an fixierten equinen Endometriumbioptaten durchgeführt werden und bietet darüber hinaus die Möglichkeit, diese Methode an anderen equinen Organen anzuwenden. Die Ergebnisse der semiquantitiven Auswertung deuten auf das mögliche Vorliegen unterschiedlicher Formen der nicht-eitrigen Entzündung hin. Das etablierte Verfahren gibt möglicherweise nähere Hinweise auf immunologische Konstellationen, die das Auftreten einer nicht-eitrigen Endometritis begünstigen.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS II 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Das Endometrium der Stute 2 2.1.1 Endometritiden 4 2.1.1.1 Eitrige Endometritis 4 2.1.1.2 Nicht-eitrige Endometritis 5 2.1.1.3 Sonderformen 6 2.1.2 Resistant und susceptible mares 8 2.1.3 Entzündungszelltypisierung im Endometrium der Stute 10 2.1.4 Diagnostische Bedeutung des Endometriumbioptates 13 2.2 Immunologie 14 2.2.1 T-Lymphozyten 14 2.2.2 B-Lymphozyten 17 2.2.3 Makrophagen 18 2.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung von equinen Entzündungszellen 21 2.3 Fixierungsmethoden 24 2.4 Fazit aus der Literatur bezüglich der Fragestellung dieser Arbeit 26 3 PUBLIKATIONEN 28 3.1 Publikation 1 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 28 3.2 Publikation 2 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 39 4 DISKUSSION 53 4.1 Etablierung alternativer Methoden zur Gewebefixierung 54 4.2 Immunhistochemische Detektion von Immunzell- (sub-)populationen 59 4.3 Erkenntnisse im Hinblick auf die Pathogenese nicht-eitriger Endometritiden 60 5 ZUSAMMENFASSUNG 63 6 SUMMARY 65 7 LITERATURVERZEICHNIS 67 8 DANKSAGUNG 81 / Clinically unapparent inflammatory alterations of the equine endometrium can only be diagnosed by the histopathological examination of a biopsy and are the main cause of subfertility in mares. The non-suppurative endometritis is characterised by infiltration of the endometrium with lymphocytes, plasma cells and/or macrophages. So far, the cause and pathogenesis of non-suppurative endometritis are unclear. The subclassification of the immune cell populations involved will likely provide important information on the etiology and pathogenesis of this disease. Available antibodies are often established exclusively for immunohistochemistry on cryostat sections of native frozen equine tissue. However, this method is impractical for the routine diagnostic work-up. The aim of the present study was: 1. To reveal the method most suitable for a routine diagnostic work-up in combination with proper tissue preservation, staining results as well as histological and immunohistochemical analysis; 2. To establish an immunohistochemical method for the detection of lymphocytes and macrophages including their subpopulations in fixed equine tissue samples; 3. To characterize the immune cell populations in fixed endometria of mares without and with non-suppurative endometritis. Material & methods: Equine endometrial tissue and intestinal lymph node were obtained from five mares during post mortem examination and were either fixed in formalin, HOPE® or IHC Zinc Fixative. Aditionally snap frozen tissue samples were processed for cryostat sectioning. HE stained cryostat sections and fixed paraffin embedded tissue samples (formalin, HOPE®, IHC Zinc Fixative) of the equine endometrium were analysed regarding tissue preservation, staining results and artefacts. To establish lymphocyte markers (anti-CD3, anti-CD4 and anti-CD8) immunohistochemically on cryostat sections and fixed paraffin embedded tissue samples (formalin, HOPE®, IHC Zinc Fixative) equine lymph node was used as reference. Formalin fixed and zinc fixed tissue samples with macrophage populations (liver, small intestine, intestinal lymph node) from four mares were used for the immunohistochemical establishment of the macrophage markers (anti-CD172a, anti-CD14, anti-CD206). The immunoreactivity of the primary antibodies was compared. The results of the comparative analysis revealed the most suitable alternative fixation method (zinc fixation). Finally, 28 zinc fixed endometrial biopsies were evaluated semiquantitatively with regard to the numbers of CD3+, CD4+, CD8+, CD20+ lymphocytes, CD172+, CD14+, CD206+ macrophages as well as plasma cells. Four mares had no evidence of endometritis and represent the control group. The remaining 24 mares showed a mild superficial non-suppurative endometritis. The comparative analysis was performed in serial sections within five randomly selected high power fields (400x). Positive cells were counted separately within the luminal and glandular epithelium, the stratum compactum and the stratum spongiosum. Results: 1. The zinc fixation provides excellent staining results, tissue preservation and allows histological and immunohistochemical analysis. It has even some advantages compared to the HOPE® fixation regarding the routine diagnostic work-up. The zinc fixation produces less artefacts. 2. The zinc fixation allows the immunohistochemical detection of all applied T- and B-lymphocyte-, helper- and cytotoxic-T-cell- and macrophage-markers and the histochemical detection of plasma cells (methyl green-pyronin stain) within equine fixed tissue. 3. Endometria with non-suppurative endometritis have higher numbers of CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD206+ as well as plasma cells within the stratum compactum and stratum spongiosum than endometria without inflammation. The average cell count of CD3+ lymphocytes within the stratum compactum was approximately 3 x higher within inflamed endometria than this value obtained from endometria without endometritis. Few CD20+ B cells and CD172+ macrophages as well as variable numbers of plasma cells could be detected within the stratum compactum of mares with non-suppurative endometritis. Endometria with and without inflammation showed marked differences in the numbers of CD4+ and CD8+ T cells. Conclusion: The zinc fixation can be easily incoorporated into the routine diagnostic work-up and offers additional application possibilities. Immunohistochemical phenotyping of immune cells in the equine endometrium can be performed on fixed endometrial biopsies of the mare. Furthermore, a widespread applicability is possible, e. g. on other equine organs. These findings suggest the existence of different forms of non-suppurative endometritis. The established method will likely assist to reveal possible etiologies and predisposing conditions for non-suppurative endometritis.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS II 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Das Endometrium der Stute 2 2.1.1 Endometritiden 4 2.1.1.1 Eitrige Endometritis 4 2.1.1.2 Nicht-eitrige Endometritis 5 2.1.1.3 Sonderformen 6 2.1.2 Resistant und susceptible mares 8 2.1.3 Entzündungszelltypisierung im Endometrium der Stute 10 2.1.4 Diagnostische Bedeutung des Endometriumbioptates 13 2.2 Immunologie 14 2.2.1 T-Lymphozyten 14 2.2.2 B-Lymphozyten 17 2.2.3 Makrophagen 18 2.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung von equinen Entzündungszellen 21 2.3 Fixierungsmethoden 24 2.4 Fazit aus der Literatur bezüglich der Fragestellung dieser Arbeit 26 3 PUBLIKATIONEN 28 3.1 Publikation 1 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 28 3.2 Publikation 2 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 39 4 DISKUSSION 53 4.1 Etablierung alternativer Methoden zur Gewebefixierung 54 4.2 Immunhistochemische Detektion von Immunzell- (sub-)populationen 59 4.3 Erkenntnisse im Hinblick auf die Pathogenese nicht-eitriger Endometritiden 60 5 ZUSAMMENFASSUNG 63 6 SUMMARY 65 7 LITERATURVERZEICHNIS 67 8 DANKSAGUNG 81

Nasale Pathologien des Hundes, wie nasale Tumoren, idiopathische Rhinitiden, oronasale Defekte und sinonasale Aspergillosen, äußern sich in der klinischen Untersuchung meist mit ähnlichen lokalen Symptomen, wie chronischem Nasenausfluss, Niesen und nasalem Stridor. Für die Diagnose der Nasenhöhlenerkrankungen sind umfassende Untersuchungen in Narkose nötig. Bisher gibt es nur wenige Studien, in denen untersucht wird, ob und welche Veränderungen bei nasalen Erkrankungen im Blutbild und in blutchemischen Parametern nachweisbar sind. Um zu evaluieren, inwiefern Nasenhöhlenpathologien in Blutuntersuchungen detektiert werden können, wurden Serumentzündungsmarker und Blutratios bei den verschiedenen nasalen Erkrankungen untersucht und verglichen. Dazu sollten die Akute-Phase-Proteine C-reaktives Protein (CRP) und Haptoglobin, 25(OH)Vitamin D, die Neutrophilen-Lymphozyten-Ratio (NLR), Thrombozyten-Lymphozyten-Ratio (TLR) und Albumin-Globulin-Ratio (AGR) von Hunden mit verschiedenen nasalen Erkrankungen und gesunden Kontrolltieren bestimmt werden.

Die Entzündungsreaktion der Arthrose wird als eine sekundäre Reaktion auf einen degenerativen Prozeß des Gelenkknorpels angesehen. Die Ursache für die Degeneration kann im Mißverhältnis zwischen Belastbarkeit und Beanspruchung liegen, es können metabolische Störungen (Urämie, Diabetes mellitus) verantwortlich gemacht werden, weswegen von sekundärer Arthrose gesprochen wird. Die Ursache der primären Arthrose bleibt unbekannt. Es kann als bewiesen angesehen werden der Zusammenhang mit Alter und Geschlecht der Patienten, denn Arthrose ist in der Regel eine Erkrankung jenseits des fünfzigsten Lebensjahres und betrifft vornehmlich Frauen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Synovialis von 20 Patienten aufgearbeitet und hinsichtlich des enthaltenen entzündlichen Infiltrates untersucht. Unter Anwendung der indirekten Immunperoxidase Technik und der indirekten Immunfluoreszenz Technik wurde die Expression der Antigene CD 20, CD 23, CD 40, CD 27, IgG, IgA, IgM, Kappa, Lambda, CD 3, CD 4, CD 8, Ki M4, CD 68, Ki 67 sowie die Expression der Cytokine IL 2 und IL 10 analysiert. Die Synovialmembran zeigte histologisch eine Verbreiterung der Deckzellschicht, Knorpelfragmente innerhalb der Synovialmembran und ein insgesamt schwach ausgeprägtes entzündliches Infiltrat. In lediglich drei von 20 Fällen fand sich eine stärkere entzündliche Infiltration. Diese entzündlichen Infiltrate wiesen eine perivaskuläre Verteilung auf. Am häufigsten wurden in gefäßnahen Regionen B Lymphozyten identifiziert, Plasmazellen wiesen in der Regel einen deutlich größeren Abstand zum Gefäß auf. Unter den nachgewiesenen Plasmazellen fand sich eine prädominante Expression an IgG bei ausgewogener Anwesenheit sowohl der Kappa- als auch der Lambda- Leichtketten. T Lymphozyten waren ebenfalls zirkulär um die Gefäße anzutreffen und zeigten eine prädominante Interleukin 10 Expression. Lymphozytäre Aggregate, mit follikelähnlicher Struktur ließen sich in lediglich in 4 von 20 Fällen nachweisen. Makrophagen waren sowohl perivaskulär als auch in der Deckzellschicht nachweisbar. Ki M4 positive Retikulumzellen (FDC) waren dagegen nur in einem von 20 Fällen nachweisbar. Alle Zellpopulationen der Membrana synovialis wiesen nur eine schwache Proliferationsaktivität auf. Das Fehlen von dem Keimzentrum des Lymphfollikels vergleichbaren Strukturen, die deutliche Abwesenheit von Ki M4 positiver FDC's sowie die schwache Expression von Ki 67, sprechen trotz Anwesenheit der ebenfalls zur Antigenpräsentation befähigten Makrophagen gegen eine Einwanderung und Maturation nativer B Lymphozyten in die Membrana Synovialis. Wandern dagegen Gedächtniszellen in die Membrana synovialis ein, so ist eine Maturation mit Follikelbildung nicht mehr notwendig. Unter der Mithilfe von T Lymphozyten und Makrophagen können die B Lymphozyten zu Plasmazellen differenzieren. T Lymphozyten zeichnen sich ebenfalls durch eine starke perivaskuläre Verteilung aus. Dabei ist die Expression von IL 10 prädominant, was sich als eine Immunantwort von TH2-Typus interpretieren läßt. Diese ermöglicht eine Differenzierung der B Lymphozyten zu Plasmazellen. Reife B Lymphozyten, die unter dem Einfluß einer TH2 Subpopulation von CD 4 positiven T Lymphozyten ohne Keimzentrum zu Plasmazellen differenzieren, könnten ein Grund dafür sein, daß follikuläre Strukturen fehlen. Vorgereifte B Lymphozyten benötigen auch keine inflammatorisch hochpotenten Zytokine um eine schnelle Reifung und eine Immunantwort zu ermöglichen. Dies könnte ein Grund sein, warum die entzündliche Reaktion bei Arthrose so schwach ausgeprägt ist. / Inflammation in osteoarthritis is a secondary reaction to a degenerating process of the articular cartilage. Cause of Degeneration can be a disproportion of mechanical stress and resistance or metabolic diseases like diabetes mellitus. This kind of osteoarthritis is called "secondary osteoarthritis". Primary osteoarthritis has an unknown cause. Age and sex of the patient are a predictor for osteoarthritis, hense it is a disease of people above the age of 50 and more often it is found in women than in men. This paper investigated the synovial membranes of twenty patients to characterize the inflammatory Infiltrate. It characterized the cell surface antigen CD 20, CD 23, CD 40, CD 27, CD 3, CD 4, CD 8, Ki M4, CD 68, the antibodies IgG, IgA, IgM, Kappa, Lambda, the proliferating antigen Ki 67 and the expression profile of the cytokines IL 2 and IL 10 by using immunohistochemical staining (indirect immunoperoxidase technique and indirect immunofluorescence technique) with monoclonal antibodies. The synovial membrane shows in histology a dissemination of cover cells, fragments of cartilage and a slight expression of inflammatory infiltrate with a perivascular allocation. In only three of twenty cases we detected stronger inflammatory infiltrates. Most of the perivascular cells express CD 20. They are B lymphocytes. Plasma cells have more distance to the blood vessels and showed a predominant expression of IgG. T-lymphocytes were also detected perivascular. The expression of IL 10 was predominant. Lymphocytes aggregates like lymph follicle were detected in four of twenty cases. Macrophages were proved perivascular as well as in the cover cells. Ki M4 positive reticulum cells were found in only one of twenty cases. All kind of cells in the synovial membrane showed a low proliferation activity. The absence of germinal centers or comparable structures, the low expression of Ki M4 and Ki 67 speak against the immigration and maturation of native B lymphocytes in the synovial membrane. Memory B-lymphocytes don't need germinal centers or compatible structures for maturation, they can mature to plasma cells by help of T-lymphocytes, macrophages or other B-lymphocytes. It is more probably that the detected B lymphocytes are memory cells. The perivascular T lymphocytes in combination with the predominant expression of IL 10 may be interpreted as a TH2 immune reaction. This supports the maturation of B-lymphocytes to plasma cells. The maturation of memory B-lymphocytes under influence of TH2 immune reaction can be the reason for the missing of germinal centers or comparable structures. Matured B-lymphocytes don't need high-grade inflammatory cytokines for quick immune response. This is the possible reason for the low-grade inflammatory reaction of osteoarthritis.