Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 6645115 bytes, checksum: deca0339070b70563febd2b8fada82ec (MD5) Previous issue date: 2014-08-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Snakebites are and global endemic problem and the study of its components is important to understand and prevent them. Among its components, phospholipase A2 have been strongly studies as Lys49 myotoxins. However, understanding the molecular mechanisms of its pharmacological effects remains controversial until now. This work studied the Lys49 myotoxins pharmacological structural determinants, emphasizing cytotoxic and myotoxic effects. Protein sequence analysis as well as molecular docking with myotoxin Bn IV and VEGFR-II receptor and different anionic molecules, such as phosphate, heparin and lipopolysaccharide were performed. Sequence analyses showed defied regions within Lys49 myotoxins group, especially cationic regions. In accordance with this, molecular dockings performed in this work observed the presence of anionic non-specific sites, also a heparin recognition site. Molecular dockings between myotoxin Bn IV and VEGFR-II were satisfactory and indicated C-terminal tail as an important interactive region. Our results determine cationic regions as important for cytotoxic effects and bring a new molecular approach to the myotoxic effects, via VEGFR-II. In additional, molecular cytotoxic and myotoxic models for myotoxic Lys49 were presented / Acidentes ofídicos constituem um problema endêmico global, e o estudo de seus componentes é importante para compreender e preveni-los. Dentre seus componentes, fosfolipases A2 têm sido fortemente estudadas, bem como as miotoxinas Lys49. Contudo, o entendimento dos mecanismos moleculares que promovem seus efeitos farmacológicos permanece controverso até hoje. O presente trabalho buscou estudar os determinantes estruturais dos efeitos farmacológicos das miotoxinas Lys49, enfaticamente seus efeitos citotóxicos e miotóxicos. Foram realizados testes de análise de sequências entre tais proteínas, bem como dockings moleculares entre a miotoxina Bn IV e o VEGFR-II e diferentes moléculas aniônicas, como fosfato, heparina e lipopolissacarídeo. As análises das sequências apresentaram regiões bem definidas dentro do grupo das miotoxinas Lys49, notadamente regiões catiônicas. Em concordância com isto, os dockings moleculares realizados neste trabalho apontam para a presença de um sítio não-específico para cargas aniônicas, bem como um sítio de reconhecimento para heparina. Já os dockings moleculares entre a miotoxina Bn IV e o VEGFR-II foram satisfatórias e apontaram a cauda C-terminal como uma importante região de interação. Tais resultados determinam regiões catiônicas importantes para a realização dos efeitos citotóxicos, através do reconhecimento de fosfolipídios aniônicos, e trazem uma nova abordagem molecular para os efeitos miotóxicos, via VEGFR-II. Além disso, são apresentados modelos moleculares para os efeitos citotóxicos e miotóxicos das miotoxinas Lys49

As fosfolipases A2 (EC 3.1.1.4) catalisam a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídios. Membros da sub-família de fosfolipases A2-Lisina49 (PLA2-Lys49), isolados de venenos de serpentes Viperidae mostram uma substituição do resíduo de aspartato na posição 49 por uma lisina, com a eliminação concomitante da atividade hidrolítica contra fosfolipídeos. Apesar da ausência de atividade catalítica, as PLA2-Lys49 apresentam propriedades farmacológicas variadas incluindo miotoxicidade, e danifica membranas artificiais por um mecanismo Ca2+-independente, que não envolve hidrólise de fosfolipídeos. As PLA2-Lys49 formam homodímeros em solução, e estudos cristalográficos e espectroscópicos de Bothropstoxina-I, uma PLA2-Lys49 do veneno de Bothrops jararacussu, revelaram que a transição na estrutura quaternária do dímero provoca a mudança de posição da região C-terminal, apoiando a sugestão do envolvimento desta região no modelo proposto de danificação da membrana Ca2+-independente. Um papel para a região Cterminal das PLA2-Lys49 também foi sugerido na atividade bactericida observada para esta proteína, e o presente estudo investiga uma possível correlação entre a atividade de danificação de membranas Ca2+-independente e o efeito bactericida. O efeito bactericida de BthTx-I e mutantes da proteína na região C-terminal foi avaliado contra bactéria Escherichia coli (K12). A BthTx-I nativa e recombinante tiposelvagem apresentaram alta atividade bactericida com uma concentração de 5 mg/mL, porém as mutantes Y117W, Y119W, K122A e F125W reduziram significativamente este efeito, mostrando uma correlação entre os determinantes estruturais das atividades bactericida e de danificação em membranas artificiais. Na tentativa de correlacionar o mecanismo de danificação de membranas artificiais com a atividade bactericida de BthTx-I contra linhagem E.coli (K12), um estudo por partição de sondas fluorescentes em compartimentos celulares específicos foi realizado. A sonda hidrofóbica N-fenil-N-naftilamina (NPN) foi utilizada para avaliar a integridade da membrana externa da bactéria e a sonda Sytox Green (SG) para avaliar a integridade da membrana citoplasmática bacteriana. A cinética de permeabilização da membrana externa é rápida e não foi influenciada por mutagênese da região C-terminal da proteína. Entretanto, a cinética de permeabilização da membrana plasmática mostrou-se lenta, com um efeito máximo de 2 horas de ação e identificou os mesmos determinantes estruturais como os identificados para a atividade bactericida de BthTx-I. Resultados obtidos pelas técnicas de citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão auxiliaram os dados evidenciando a importância da região C-terminal de BthTx-I na atividade bactericida contra linhagem E.coli. / Phospholipases A2 (PLA2 - EC 3.1.1.4) catalyze the hydrolysis of acid ester bonds at the sn-2 position of glycerophospholipids liberating fatty acids and lysophospholipids as catalysis products. Lysine 49 phospholipase A2 (Lys49-PLA2) are isolated from the venom of viperid snakes, and in these proteins, the aspartic acid at position 49 is replaced by a lysine, resulting in the elimination of hydrolytic activity against phospholipid substrates. Despite the absence of catalytic activity, these Lys49-PLA2s present various pharmacological properties and furthermore damage artificial membranes by a Ca2+-independent mechanism. Lys49- PLA2s form homodimers in solution, and crystallographic and spectroscopic studies of the bothropstoxin-I (BthTx-I), a Lys49-PLA2 isolated from venom of Bothrops jararacussu, reveal that a quaternary structure transition in the homodimer results in a change in the position of the C-terminal loop of the protein, suggesting the involvement of this region in the Ca2+- independent membrane damaging activity. A role for the C-terminal region of Lys49-PLA2 has also been suggested for the bactericidal activity of theses proteins, and using BthTx-I one as a model system, the present study investigates the possible correlation and between the Ca2+-independent membrane damaging and the bactericidal activities. The bactericidal effect of native BthTx-I and site-directed mutants of the C-terminal loop was evaluated using the Gram negative bacteria E. coli strain K12. Both the native and wild type recombinant BthTx-I presented a high bactericidal activity at a concentration of 5 mg/mL, whereas the mutants Y117W, Y119W, K122A and F125W showed significantly reduced the bactericidal effects, showing a correlation between the structural determinants of the bactericidal and membrane damaging activities. The fluorescent probe NPN was used to evaluate the integrity of the external membrane of the bacterial cells after exposure to the BthTx-I and mutants. The permeabilization of the external membrane is complete within 2 minutes, and neither the kinetics nor the extent of membrane damage was influenced by mutagenesis in the C-terminal region. The fluorescent probe Sytox Green (SG) was used to evaluate the integrity of the bacterial plasma membrane, an event which showed a significantly slower kinetic, with a maximum effect observed after two hours exposure to the BthTx-I. Furthermore, the extent of the membrane damage is influenced by mutagenesis in the C-terminal loop, and the structural determinants for the bactericidal activity of BthTx-I are the same as those that determine the permeabilization of the bacterial plasma membrane. Evidence obtained using flow cytometry and transmission electron microscopy support of the suggestion that the C-terminal region of BthTx-I is an important structural determinant of the plasma membrane damaging bactericidal activities.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-19T13:15:55Z No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-19T13:16:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-19T13:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-06-08 / Venom components from snakes of the Bothrops genus have a wide range of biological actions that are not yet fully identified or understood. Of these compounds, phospholipases A2 have shown different potential for biotechnological applications. The objectives of this study were to isolate and biochemically and biologically characterize a Lys49 phospholipase A2 from Bothrops neuwiedi urutu venom. The protein was obtained with an elevated degree of purity after two chromatographic steps, the first being anion exchange (DEAE column) and the second reverse phase in a C18 column. The degree of purity and relative molecular mass were assessed by SDS-PAGE, obtaining a typical molecular mass of an svPLA2 of approximately 14 kDa, which was later confirmed by Mass Spectrometry, obtaining a mass value (m/z) of 13,733 Da. Analysis of the phospholipase activity, carried out on the substrate 4N3OBA showed that the isolated PLA2 is enzymatically inactive. The analyses using the Edman degradation method and that of the peptide fragments allowed for the identification of 108 of the toxin’s amino acid residues; high identity was observed with other phospholipases present in the venom of other species of snakes of the Bothrops genus. The data confirmed that it is a novel PLA2-Lys49 isoform from B. n. urutu venom, called BnuTX-I. The modeling in the dimeric form of the molecular structure of the toxin showed about 99.15% homology with PLA2-homologue 1 from Bothrops jararacussu (PDB code: 3I03) and identified the tertiary structure and active site. Biological assays in murine models revealed that both BnuTX-I and the venom were able to induce edema and myotoxic responses. Hemorrhagic activity was only observed for the venom. The antimicrobial and parasitic assays with the venom and BnuTX-I showed, mostly, the growth inhibition of P. aeruginosa strains and L. amazonensis promastigote forms with a CC50 of 22.91 μg/mL and a selectivity index (SI) of 0.44. As for the cytotoxic effects of BnuTX-I in murine macrophages, the toxin presented cytotoxicity at different concentrations (μg/mL), and the production of IL 1β cytokines was observed. The results allowed for the identification and characterization of a new myotoxin isoform with potential for future biotechnological applications. / Os componentes do veneno de serpentes do gênero Bothrops apresentam uma variada gama de ações biológicas ainda não completamente identificadas ou esclarecidas. Dos compostos, as fosfolipases A2 vêm demonstrando diferentes potenciais para aplicações biotecnológicas. Os objetivos deste estudo foram isolar e caracterizar bioquímica e biologicamente uma fosfolipase A2 Lys49 do veneno da serpente Bothrops neuwiedi urutu. A proteína foi obtida com elevado grau de pureza após duas etapas cromatográficas, sendo a primeira de troca aniônica (coluna DEAE) e a segunda de fase reversa em coluna C18. O grau de pureza e a massa molecular relativa foram avaliados por SDS-PAGE, obtendo-se uma massa molecular típica de svPLA2 de aproximadamente 14 kDa, que foi posteriormente confirmada por Espectrometria de Massa obtendo-se o valor de massa (m/z) de 13.733 Da. A análise da atividade fosfolipásica, realizada sob o substrato 4N3OBA, mostrou que a PLA2 isolada é enzimaticamente inativa. As análises pelo método de degradação de Edman e dos fragmentos peptídicos permitiram a identificação de 108 resíduos de aminoácidos da toxina, sendo observada elevada identidade com outras fosfolipases presentes no veneno de outras espécies de serpentes do gênero Bothrops. Os dados confirmaram tratar-se de uma isoforma inédita de PLA2-Lys49 do veneno de B. n. urutu, denominada BnuTX-I. O modelamento, na forma dimérica, da estrutura molecular da toxina mostrou homologia com cerca de 99,15% com a PLA2-homóloga 1 de Bothrops jararacussu (código PDB: 3I03), bem como a identificação das estruturas terciária e do sítio ativo. Os ensaios biológicos mostraram, em modelos murinos, que tanto a BnuTX-I quanto o veneno foram capazes de induzir respostas edematogênica e miotóxica. A atividade hemorrágica foi observada somente para o veneno. Os ensaios antimicrobianos e parasitários realizados com veneno e BnuTX-I mostraram majoritariamente a inibição do crescimento das cepas de P. aeruginosa e de formas promastigota de L. amazonensis com CC50 de 22,91 μg/mL e com índice de seletividade (IS) de 0,44. Quanto aos efeitos citotóxicos, da BnuTX-I sobre macrófagos murinos, observou-se que a toxina apresentou citotoxidade em diferentes concentrações (μg/mL) e produção de citocinas IL 1β. Os resultados possibilitaram a identificação e caracterização de uma nova isoforma de miotoxina com pontecial para futuras aplicações biotecnológicas.

As fosfolipases A2 (EC 3.1.1.4) catalisam a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídios. Membros da sub-família de fosfolipases A2-Lisina49 (PLA2-Lys49), isolados de venenos de serpentes Viperidae mostram uma substituição do resíduo de aspartato na posição 49 por uma lisina, com a eliminação concomitante da atividade hidrolítica contra fosfolipídeos. Apesar da ausência de atividade catalítica, as PLA2-Lys49 apresentam propriedades farmacológicas variadas incluindo miotoxicidade, e danifica membranas artificiais por um mecanismo Ca2+-independente, que não envolve hidrólise de fosfolipídeos. As PLA2-Lys49 formam homodímeros em solução, e estudos cristalográficos e espectroscópicos de Bothropstoxina-I, uma PLA2-Lys49 do veneno de Bothrops jararacussu, revelaram que a transição na estrutura quaternária do dímero provoca a mudança de posição da região C-terminal, apoiando a sugestão do envolvimento desta região no modelo proposto de danificação da membrana Ca2+-independente. Um papel para a região Cterminal das PLA2-Lys49 também foi sugerido na atividade bactericida observada para esta proteína, e o presente estudo investiga uma possível correlação entre a atividade de danificação de membranas Ca2+-independente e o efeito bactericida. O efeito bactericida de BthTx-I e mutantes da proteína na região C-terminal foi avaliado contra bactéria Escherichia coli (K12). A BthTx-I nativa e recombinante tiposelvagem apresentaram alta atividade bactericida com uma concentração de 5 mg/mL, porém as mutantes Y117W, Y119W, K122A e F125W reduziram significativamente este efeito, mostrando uma correlação entre os determinantes estruturais das atividades bactericida e de danificação em membranas artificiais. Na tentativa de correlacionar o mecanismo de danificação de membranas artificiais com a atividade bactericida de BthTx-I contra linhagem E.coli (K12), um estudo por partição de sondas fluorescentes em compartimentos celulares específicos foi realizado. A sonda hidrofóbica N-fenil-N-naftilamina (NPN) foi utilizada para avaliar a integridade da membrana externa da bactéria e a sonda Sytox Green (SG) para avaliar a integridade da membrana citoplasmática bacteriana. A cinética de permeabilização da membrana externa é rápida e não foi influenciada por mutagênese da região C-terminal da proteína. Entretanto, a cinética de permeabilização da membrana plasmática mostrou-se lenta, com um efeito máximo de 2 horas de ação e identificou os mesmos determinantes estruturais como os identificados para a atividade bactericida de BthTx-I. Resultados obtidos pelas técnicas de citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão auxiliaram os dados evidenciando a importância da região C-terminal de BthTx-I na atividade bactericida contra linhagem E.coli. / Phospholipases A2 (PLA2 - EC 3.1.1.4) catalyze the hydrolysis of acid ester bonds at the sn-2 position of glycerophospholipids liberating fatty acids and lysophospholipids as catalysis products. Lysine 49 phospholipase A2 (Lys49-PLA2) are isolated from the venom of viperid snakes, and in these proteins, the aspartic acid at position 49 is replaced by a lysine, resulting in the elimination of hydrolytic activity against phospholipid substrates. Despite the absence of catalytic activity, these Lys49-PLA2s present various pharmacological properties and furthermore damage artificial membranes by a Ca2+-independent mechanism. Lys49- PLA2s form homodimers in solution, and crystallographic and spectroscopic studies of the bothropstoxin-I (BthTx-I), a Lys49-PLA2 isolated from venom of Bothrops jararacussu, reveal that a quaternary structure transition in the homodimer results in a change in the position of the C-terminal loop of the protein, suggesting the involvement of this region in the Ca2+- independent membrane damaging activity. A role for the C-terminal region of Lys49-PLA2 has also been suggested for the bactericidal activity of theses proteins, and using BthTx-I one as a model system, the present study investigates the possible correlation and between the Ca2+-independent membrane damaging and the bactericidal activities. The bactericidal effect of native BthTx-I and site-directed mutants of the C-terminal loop was evaluated using the Gram negative bacteria E. coli strain K12. Both the native and wild type recombinant BthTx-I presented a high bactericidal activity at a concentration of 5 mg/mL, whereas the mutants Y117W, Y119W, K122A and F125W showed significantly reduced the bactericidal effects, showing a correlation between the structural determinants of the bactericidal and membrane damaging activities. The fluorescent probe NPN was used to evaluate the integrity of the external membrane of the bacterial cells after exposure to the BthTx-I and mutants. The permeabilization of the external membrane is complete within 2 minutes, and neither the kinetics nor the extent of membrane damage was influenced by mutagenesis in the C-terminal region. The fluorescent probe Sytox Green (SG) was used to evaluate the integrity of the bacterial plasma membrane, an event which showed a significantly slower kinetic, with a maximum effect observed after two hours exposure to the BthTx-I. Furthermore, the extent of the membrane damage is influenced by mutagenesis in the C-terminal loop, and the structural determinants for the bactericidal activity of BthTx-I are the same as those that determine the permeabilization of the bacterial plasma membrane. Evidence obtained using flow cytometry and transmission electron microscopy support of the suggestion that the C-terminal region of BthTx-I is an important structural determinant of the plasma membrane damaging bactericidal activities.