<p>Nearly thirty percent of all newly synthesized polypeptides are targeted for rapid proteasome-mediated degradation. These rapidly degraded polypeptides (RDPs) are the primary source of antigenic substrates for the major histocompatibility complex (MHC) class I presentation pathway, allowing for the immunosurveillance of newly synthesized proteins by cytotoxic T lymphocytes. Despite the recognized role of RDPs in MHC class I presentation, it remains unclear what molecular characteristics distinguish RDPs from their more stable counterparts. It has been proposed that premature translational termination products may constitute a form of RDP; indeed, in prokaryotes translational drop-off products are normal by-products of protein synthesis and are subsequently rapidly degraded. </p><p>To study the cellular fate of premature termination products, the antibiotic puromycin was used to modulate prematurely terminated polypeptide production in human cells. At low concentrations, puromycin doubled the fraction of rapidly degraded polypeptides, with enhanced degradation predominantly affecting small polypeptides, consistent with rapid degradation of truncated translation products. Immunoprecipitation experiments using anti-puromycin antisera demonstrated that the majority of peptidyl-puromycins are rapidly degraded in a proteasome-dependent manner. Low concentrations of puromycin increased the recovery of cell surface MHC class I-peptide complexes, indicating that prematurely terminated polypeptides can be processed for presentation via the MHC I pathway. In the continued presence of puromycin, MHC I export to the cell surface was inhibited, coincident with the accumulation of polyubiquitinated proteins. The time- and dose-dependent effects of puromycin suggest that the pool of peptidyl-puromycin adducts differ in their targeting to various proteolytic pathways which, in turn, differ in the efficiency with which they access the MHC class I presentation machinery. These studies highlight the diversity of cellular proteolytic pathways necessary for the metabolism and immunosurveillance of prematurely terminated polypeptides which are, by their nature, highly heterogeneous.</p> / Dissertation

My dissertation hypothesis is that bovine trophoblast cells express cell-surface and secreted non-classical major histocompatibility complex class I (MHC-Ib) proteins which inhibit NK cells and other leukocytes by binding to inhibitory receptors (e.g., LILRB1, LILRB2, KIR2DL4, and/or CD94/NKG2A). Extremely polymorphic and ubiquitously expressed classical MHC class I (MHC-Ia) proteins, which present foreign antigenic peptides to CD8+ T lymphocytes, are involved in acceptance or rejection of tissue grafts. Non-classical MHC class I (MHC-Ib) glycoproteins, such as Human Leukocyte Antigen-G (HLA-G) and murine Qa-2, are important modulators of the maternal immune system during pregnancy. MHC-Ib proteins are: (a) oligomorphic or monomorphic, (b) expressed in specific tissues under specific condtions, and (c) produced as surface and/or soluble isoforms due to alternative splicing. Third trimester-bovine trophoblast cells express both MHC-Ia and MHC-Ib proteins. The MHC-Ib proteins expressed by trophoblast cells during the third trimester of pregnancy are encoded by four bovine leukocyte antigen (BoLA) loci: BoLA-NC1, BoLA-NC2, BoLA-NC3, and BoLA-NC4. Two MHC-Ia (N*01701 and N*01802) and three MHC-Ib (NC1*00501, NC3*00101 and NC4*00201) proteins showed cell-surface expression in transfection studies performed in murine P815 and human K562 cells. Two additional isoforms, NC1*00401 and NC2*00102, were not detected on the surface of these cells. Nevertheless, both class Ia proteins, N*01701 and N*01802, and five class Ib proteins, NC1*00401, NC1*00501, NC2*00102, NC3*00101, and NC4*00201, were detected in crude cell lysates on Western blots. Precipitation of proteins from culture supernatants showed that cell-surface MHC-Ia (N*01701 and N*01802) and MHC-Ib proteins (NC1*00501, NC3*00101, and NC4*00201) are shed from the surface of these cells into the media. The mechanism of shedding of these proteins is, however, not known. Monoclonal antibodies W6/32, IL-A88, H1A, H6A, H11A, H58A, and PT-85A recognized surface MHC-I isoforms with varying affinity. We were able to develop a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using either H1A or IL-A88 antibody as the capture antibody and the W6/32 antibody for detection. We produced monoclonal antibodies against cattle NC1*00501 and NC3*00101 proteins. One monoclonal antibody generated against BoLA-NC3*00101 was highly specific. Unfortunately, due to failure to clone the NC3*00101- hybridoma, we no longer have an infinite source of this monoclonal antibody for NC3*00101. We eluted peptides from NC3*00101-transfected MHC-null K562 cells and identified peptides using liquid chromatography-mass spectrum (LC-MS) analysis. Analysis of peptide binding data using the SAS Proc mixed statistical program, suggested that the peptide EVTNQLVVL is a potential peptide ligand, which can be used to make tetramers for enumeration of antigen-specific leukocytes.

Increasing evidence of non-canonical protein translation has sparked interest in their identification and characterization for use in immunotherapy. In addition, recent studies on the repertoire of major histocompatibility complex class I (MHC-I) associated peptides (MAPs or immunopeptidome), have suggested that MAPs derived from these translations are potential targets for cancer immunotherapy. Therefore, the aim of this study was to assess the impact of these MAPs in cancer by developing methods to facilitate their identification and their validation as potential targets for immunotherapy. To facilitate the identification of non-canonical proteins, we developed Ribo-db, a proteogenomic approach that combines RNA sequencing, ribosome profiling and mass spectrometry. This approach enables the generation of specific databases aimed at including protein diversity. The use of Ribo-db to analyze diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) samples revealed that approximately 10% of MAPs were derived from non-canonical proteins. These proteins had distinct properties compared to those derived from canonical proteins. They had shorter lengths and lower stability, but greater efficiency in generating MAPs. Importantly, we found limited overlap between the non-canonical proteins detected in the immunopeptidome and those detected in the whole proteome suggesting the existence of two distinct non-canonical protein repertoires. Knowing that non-canonical MAPs can be effective targets for cancer immunotherapy, we developed BamQuery, a tool to assess their expression in tissues to determine whether they can be used in a vaccine. BamQuery aims to predict the probability of MHC-I presentation of each peptide in different tissues based on its RNA expression. Using BamQuery, we found that previously identified tumor antigens (TA) would be highly expressed in healthy tissues, making them poor candidates for immunotherapy. In addition, we also identified highly potential immunotherapeutic targets in DLBCL that were derived from non-canonical translations. These targets showed promising as they were poorly expressed in normal tissues but highly expressed and shared in tumor samples. Thus, BamQuery proved to be a useful tool for identifying and prioritizing potential immunotherapeutic targets. Overall, our research indicated that non-canonical regions of the genome increase the diversity of MAPs that can be recognized by T cells. Furthermore, the expression of MAPs in tissues can be used as a predictor of their presentation to MHC I to identify reliable targets for immunotherapy, for which BamQuery is an effective tool. / Les preuves de plus en plus nombreuses de la traduction des protéines non canonique ont suscité l'intérêt pour leur identification et leur caractérisation en vue de leur utilisation dans les immunothérapies. En outre, des études récentes sur le répertoire des peptides associés au complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH-I, connus sous le nom de MAPs ou immunopeptidome), ont suggéré que les MAPs dérivés de ces traductions sont des cibles potentielles pour l'immunothérapie du cancer. L'objectif de cette étude était donc d'évaluer l'impact de ces MAP dans le cancer en développant des méthodes pour faciliter leur identification et leur validation en tant que cibles potentielles pour l'immunothérapie. Afin de faciliter l'identification des protéines non canoniques, nous avons développé Ribodb, une approche protéogénomique qui combine le séquençage de l'ARN, le profilage ribosomal et la spectrométrie de masse. Cette approche permet de générer des bases de données spécifiques visant à inclure la diversité des protéines. Notre analyse avec Ribo-db d'échantillons de lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) a révélé qu'environ 10% des MAP étaient dérivés de protéines non canoniques. Ces protéines avaient des propriétés distinctes par rapport à celles dérivées de protéines canoniques. Elles étaient plus courtes et avaient une stabilité plus faible, mais une plus grande efficacité dans la génération de MAPs. Fait important, nous avons constaté un chevauchement limité entre les protéines non canoniques détectées dans l'immunopeptidome et celles détectées dans le proteome entier, ce qui suggère l'existence de deux répertoires distincts de protéines non canoniques. Sachant que les MAP non canoniques peuvent être des cibles efficaces pour l'immunothérapie du cancer, nous avons développé BamQuery, un outil permettant d'évaluer leur expression dans les tissus afin de déterminer s'ils peuvent être utilisés dans un vaccin. BamQuery vise à prédire la probabilité de présentation au CMH-I de chaque MAP dans différents tissus sur la base de son expression ARN. En utilisant BamQuery, nous avons découvert que des antigènes tumoraux (TA) précédemment identifiés seraient fortement exprimés dans les tissus sains, ce qui en fait de mauvais candidats pour l'immunothérapie. En outre, nous avons également ii identifié des cibles immunothérapeutiques très potentielles dans DLBCL qui étaient dérivées de traductions non canoniques. Ces cibles se sont révélées prometteuses car elles étaient peu exprimées dans les tissus normaux mais fortement exprimées et partagées dans les échantillons tumoraux. Ainsi, BamQuery s'est avéré être un outil utile pour identifier et hiérarchiser les cibles immunothérapeutiques potentielles. Dans l'ensemble, nos recherches ont indiqué que les régions non canonique du génome augmentent la diversité des MAPs qui peuvent être reconnues par les cellules T. De plus, l'expression des MAPs dans les tissus peut être utilisée comme un prédicteur de leur présentation au CMH I afin d'identifier des cibles fiables pour l'immunothérapie, ce pour quoi BamQuery est un outil efficace.

La présentation d'antigène par les molécules d'histocompatibilité majeure de classe I (CMHI) permet au système immunitaire adaptatif de détecter et éliminer les agents pathogènes intracellulaires et des cellules anormales. La surveillance immunitaire est effectuée par les lymphocytes T CD8 qui interagissent avec le répertoire de peptides associés au CMHI présentés à la surface de toutes cellules nucléées. Les principaux gènes humains de CMHI, HLA-A et HLA-B, sont très polymorphes et par conséquent montrent des différences dans la présentation des antigènes. Nous avons étudié les différences qualitatives et quantitatives dans l'expression et la liaison peptidique de plusieurs allotypes HLA. Utilisant la technique de cytométrie de flux quantitative nous avons établi une hiérarchie d'expression pour les quatre HLA-A, B allotypes enquête. Nos résultats sont compatibles avec une corrélation inverse entre l'expression allotypique et la diversité des peptides bien que d'autres études soient nécessaires pour consolider cette hypothèse. Les origines mondiales du répertoire de peptides associés au CMHI restent une question centrale à la fois fondamentalement et dans la recherche de cibles immunothérapeutiques. Utilisant des techniques protéogénomiques, nous avons identifié et analysé 25,172 peptides CMHI isolées à partir des lymphocytes B de 18 personnes qui exprime collectivement 27 allotypes HLA-A,B. Alors que 58% des gènes ont été la source de 1-64 peptides CMHI par gène, 42% des gènes ne sont pas représentés dans l'immunopeptidome. Dans l'ensemble, l’immunopeptidome présenté par 27 allotypes HLA-A,B ne couvrent que 17% des séquences exomiques exprimées dans les cellules des sujets. Nous avons identifié plusieurs caractéristiques des transcrits et des protéines qui améliorent la production des peptides CMHI. Avec ces données, nous avons construit un modèle de régression logistique qui prédit avec une grande précision si un gène de notre ensemble de données ou à partir d'ensembles de données indépendants génèrerait des peptides CMHI. Nos résultats montrent la sélection préférentielle des peptides CMHI à partir d'un répertoire limité de produits de gènes avec des caractéristiques distinctes. L'idée que le système immunitaire peut surveiller des peptides CMHI couvrant seulement une fraction du génome codant des protéines a des implications profondes dans l'auto-immunité et l'immunologie du cancer. / Antigen presentation by major histocompatibility complex class I (MHCI) molecules allows the adaptive immune system to detect and eliminate intracellular pathogens or abnormal cells. Immune surveillance is executed by CD8 T cells that monitor the repertoire of MHCI-associated peptides (MAPs) presented at the surface of all nucleated cells. The primary human MHCI genes, HLA-A and HLA-B, are highly polymorphic and consequentially demonstrate differences in antigen presentation. We investigated qualitative and quantitative differences in expression and peptide binding. Using quantitative flow cytometry we establish clear hierarchy of expression for the four HLA-A,B allotypes investigated. Our results are consistent with an inverse correlation between expression and peptide diversity although further work is necessary to solidify this hypothesis. The global origins of the MAP repertoire remains a central question both fundamentally and in the search for immunotherapeutic targets. Using proteogenomics, we identified and analyzed 25,172 MAPs isolated from B lymphocytes of 18 individuals who collectively expressed 27 HLA-A,B allotypes. While 58% of genes were the source of 1-64 MAPs per gene, 42% of genes were not represented in the immunopeptidome. Overall, we estimate the immunopeptidome presented by 27 HLA-A,B allotypes covered only 17% of exomic sequences expressed in subjects’ cells. We identified several features of transcripts and proteins that enhance MAP production. From these data we built a logistic regression model that predicts with high accuracy whether a gene from our dataset or from independent datasets would generate MAPs. Our results show preferential selection of MAPs from a limited repertoire of gene products with distinct features. The notion that the immune system can monitor MAPs covering only a fraction of the protein coding genome has profound implications in autoimmunity and cancer immunology.

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Presque toutes les cellules nucléées expriment des peptides associés au CMH I (HLA I chez l’humain)(MAP) qui sont échantillonnés à partir du protéome cellulaire et transportés vers la surface cellulaire pour inspection par les lymphocytes T CD8. En tant que tel, la collection de MAP à la surface des cellules, ou immunopeptidome, informe les lymphocytes T CD8 de l’état cellulaire interne. L’immunosurveillance du cancer repose sur la capacité des lymphocytes T CD8 à reconnaître les MAP anormaux sur les cellules tumorales et à les éliminer tout en épargnant les cellules saines. Par conséquent, l’existence du cancer indique que bien souvent, les lymphocytes T CD8 spécifiques à la tumeur sont impuissants, dysfonctionnels ou incapables d’exercer leur fonction. Les vaccins anticancéreux peuvent actionner la destruction des tumeurs en stimulant la reconnaissance des MAP anormaux. Toutefois, le développement de vaccins anticancéreux efficaces est entravé par le manque de MAP exploitables, ou antigènes tumoraux (TA), exprimés exclusivement sur les cellules tumorales. La recherche et l’identification de TA ont été largement limitées aux MAP dérivés de mutations non synonymes situées dans des exons canoniques codant pour des protéines. Ces régions génomiques ne représentent que 2% du génome humain. Le fait que les MAP puissent potentiellement dériver de la traduction non canonique de toutes les régions génomiques n’a été pleinement compris que récemment. Ici, nous avons utilisé la protéogénomique pour découvrir des TA exploitables dérivés de produits de traduction canoniques et non canoniques partagés au sein ou entre divers types de cancers humains. Premièrement, nous avons utilisé des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pour identifier les MAP associés à la pluripotence (paMAP) étant partagés par les cellules cancéreuses. Les antigènes pluripotents sont exprimés dans les tissus embryonnaires et absents des tissus adultes sains, mais anormalement réexprimés par les cellules cancéreuses. Ainsi, bien qu'ils ne soient pas mutés, les paMAP constituent des cibles idéales et spécifiques au cancer. Nous avons identifié un ensemble de 48 paMAP dérivés de transcrits codants et non codants (48 %) impliqués dans le maintien de la pluripotence et exprimés de manière aberrante dans plusieurs types de cancer. Ainsi, bien qu’elles proviennent de différents types de cellules et de tissus, des tumeurs 4 distinctes convergent vers un programme transcriptionnel associé à la pluripotence. En effet, l’expression des paMAP dans les cancers est corrélée à l’hypométhylation récurrente de leurs gènes sources, la présence d’aberrations génomiques courantes et l’adoption par les tumeurs de stratégies d’évasion immunitaire communes. Enfin, comme plusieurs paMAP sont immunogènes, leur utilisation comme cibles dans des vaccins anticancéreux pourrait entrer en synergie avec les inhibiteurs disponibles des voies d'évasion immunitaire et améliorer le traitement de plusieurs cancers agressifs. Ensuite, nous avons évalué l’ensemble des TA ayant un potentiel thérapeutique dans deux types de tumeurs présentant une charge mutationnelle particulièrement élevée, le mélanome et le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Nous avons constaté que les TA mutés (mTSAs) représentent une minorité (1 %) des TA exploitables dans ces deux types de cancer. Cela peut s'expliquer par une faible expression d'ARN de la plupart des mutations non synonymes ainsi que par leur localisation en dehors des régions génomiques les plus efficaces pour la génération de MAP. En revanche, 99 % des TA dérivent de séquences génomiques non mutées spécifiques au cancer (aeTSA), surexprimées dans le cancer (TAA) ou spécifiques à la lignée cellulaire d'origine (LSA, exprimés par les mélanocytes ou par les cellules épithéliales pulmonaires, pour le mélanome et le NSCLC, respectivement). Tout comme les paMAP, environ 50 % des aeTSA identifiés dans le mélanome et le NSCLC proviennent de séquences non canoniques et sont régulés de manière épigénétique. Alors que les mTSA sont exclusivement spécifiques à chaque patient patient, les aeTSA sont partagés entre les échantillons tumoraux. De plus, leur absence dans les tissus normaux, leur abondance et leur capacité à activer les lymphocytes T CD8 en font des cibles idéales pour traiter les mélanomes et les NSCLC. En conclusion, cette thèse fournit un aperçu de la biogenèse de différents types de TA dans diverses cohortes de patients et ouvre la voie au développement d’immunothérapies ciblées et efficaces contre une grande variété de cancers. / Nearly all nucleated cells express MHC I (HLA I in humans)-associated peptides (MAPs) which are sampled from the cellular proteome and transported to the cell surface for inspection by CD8 T cells. As such, the collection of cell-surface MAPs, or the immunopeptidome, informs CD8 T cells on the inner cell state. Cancer immunosurveillance relies on the capacity of CD8 T cells to recognize abnormal MAPs on tumor cells and eliminate them while sparing healthy cells. Hence, the existence of cancer indicates that tumor-specific CD8 T cells are underpowered, dysfunctional or inhibited from exerting their function. Anti-cancer vaccines can boost tumor killing by stimulating the recognition of abnormal MAPs. The development of effective anti-cancer vaccines is limited by the identification of actionable MAPs, or tumor antigens (TAs), expressed exclusively on tumor cells. The TA search space has been largely limited to MAPs derived from non-synonymous mutations in canonical protein-coding exons which represent a mere 2% of the human genome. That MAPs can derive from the non-canonical translation of potentially all genomic regions has only recently been fully appreciated. Herein, we used proteogenomics to discover actionable TAs derived from canonical and non-canonical translation products shared within or across different types of human cancer. First, we used induced pluripotent stem cells (iPSCs) to identify pluripotency-associated MAPs (paMAPs) shared by cancer cells. Pluripotency antigens are restricted to embryonic tissues and absent from healthy adult tissues but abnormally re-expressed by cancer cells, which makes them ideal tumor-specific targets despite being unmutated. We identified a set of 46 paMAPs derived from coding and allegedly non-coding (48%) transcripts involved in pluripotency maintenance and aberrantly expressed in multiple cancer types. Thus, despite originating from different cell types and tissues, distinct tumor types converged towards a pluripotency-associated transcriptional program. Indeed, the expression of paMAPs across cancers correlated with recurrent source gene hypomethylation, genomic aberrations, and immune evasion properties. Several paMAPs were immunogenic, thus their targeting could synergize with available inhibitors of immune evasion pathways to improve the outcome of multiple aggressive cancers. 7 Next, we evaluated the actionable TA landscape of two tumor types with particularly high mutational load, melanoma and non-small cell lung cancer (NSCLC). We found that mutated TAs (mTSAs) represent a minority (1%) of actionable TAs in both cancer types, which can be explained by a low RNA expression of most non-synonymous mutations and their localization outside genomic regions proficient for MAP generation. By contrast, 99% of TAs derived from unmutated genomic sequences specific to cancer (aeTSAs), overexpressed in cancer (TAAs), or specific to the cell lineage of origin (LSAs, expressed by melanocytes or by lung epithelial cells, for melanoma and NSCLC LSAs, respectively). As for paMAPs, around 50% of aeTSAs in melanoma and NSCLC were non-canonical and were epigenetically regulated. Whereas mTSAs were exclusively patient-specific, aeTSAs were shared among tumor samples and exhibited all characteristics of targetable TAs, including tumor-specificity, high abundance, and immunogenicity. Altogether, this thesis provides insights into the biogenesis of different TA types in various patient cohorts and paves the way for the development of effective TA-based immunotherapies against a large variety of cancers.