Resumo: Clicar acesso eletrônico abaixo. / Abstract: Click electronic access below. / Orientador: Ricardo Luiz Dantas Machado / Coorientador: Andréa Regina Baptista Rossit / Banca: Sandra do Lago Moraes de Ávila / Banca: Luiz Carlos de Mattos / Mestre

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T11:22:10Z No. of bitstreams: 1 Robortella_Diagnóstico molecular de infecção maláricas_2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T11:22:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Robortella_Diagnóstico molecular de infecção maláricas_2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T11:22:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robortella_Diagnóstico molecular de infecção maláricas_2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:24:59Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Robortella_Diagnostico molecular de infeccao malaricas_2016.pdf.txt: 147676 bytes, checksum: e74efc2c2c5793a2927f4ba6c4952b6f (MD5) Robortella_Diagnostico molecular de infeccao malaricas_2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Nos últimos anos, a incidência de malária no Brasil vem reduzido significativamente, particularmente, em virtude das medidas de controle. Neste novo cenário, faz-se necessário identificar e tratar a malária submicroscópica, uma vez que estes indivíduos constituem fonte de infecção para o mosquito vetor. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa vem aprimorando o diagnóstico molecular de malária e, recentemente, padronizou uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), altamente sensível, para a detecção de alvos não ribossomais (Pvr47 e Pfr364) dos plasmódios. Baseado nestes achados, o objetivo do presente trabalho foi investigar a malária subpatente em tribos indígenas de povos Ianomâmis, onde as baixas parasitemias parecem ser frequentes. A população de estudo foi constituída de indivíduos pertencentes a cinco aldeias ianomâmis do Polo Base Marari, estado do Amazonas. O estudo envolveu dois cortes transversais, sendo realizados nos meses de setembro (primeiro corte transversal) e novembro (segundo corte trans versal) de 2014. Foram incluídos no estudo um total de 914 indígenas, com cerca de 1590 amostras de sangue coletadas em papel de filtro. Para o diagnóstico molecular de malária, quatro diferentes protocolos de PCR foram utilizados, sendo três baseados em alvos ribossomais (18S rRNA) e um em alvos não ribossomais (Pvr47/Pfr364) dos plasmódios. Os resultados aqui obtidos permitiram demonstrar que os alvos Pvr47/Pfr364 foram os mais sensíveis para o diagnóstico de malária submicroscópica, embora não se mostraram adequados para o diagnóstico de espécie. Dentre os protocolos baseados no gene 18S rRNA aqui utilizados (Nested-PCR, RT-Mangold e RT-Rougemont), a Nested-PCR (método molecular de referência) se mostrou mais apropriada para o diagnóstico específico das infecções maláricas submicroscópicas. Em conjunto, este estudo de infecção malárica em populações ianomâmis permitiu demonstrar que: (i) enquanto 0,9% das amostras foram positivas pela microscopia ótica (MO), diagnóstico de rotina, os protocolos moleculares identificaram 7,8% de postividade; (ii) P. vivax foi a espécie predominante, seguido do P. malariae e P. falciparum em proporções similares; (iii) a positividade por malária diminuiu com a idade (crianças>adolescentes>adultos) e foi influenciada pelas variações sazonais (setembro>novembro); (iv) a prevalência de malária variou significativamente nas diferentes aldeias, sugerindo que a doença não está homogeneamente distribuída na área de estudo. Espera-se que os resultados aqui obtidos possam contribuir para o direcionamento e monitoração de medidas de controle em reservas indígenas, bem como estimar a real incidência de malária nas áreas sob vigilância epidemiológica. / In the last few years, considerable success in reducing malaria incidence has been achieved in Brazil mainly as result of global efforts to control disease. In this new scenario, the need to detect and treat submicoscopic infections is becoming increasing important, as these individuals can be a source of infection for mosquito vectors. Aiming to improve molecular diagnosis of malaria, our research group has standardized a real-time PCR protocol (RT-PCR), highly sensible, for the detention of non-ribossomal plasmodium targets. Based on these findings, the goal of the present work was to investigate subpatent malaria infection in ianomâmis indigenous tribes, where low levels of parasitaemia seems to be common. The study population involved five Ianomâmis communities from the indigenous district of “Polo Base Marari”, Amazon state. Two cross-sectional studies were carried-out by the research team, in september (first survey) and november (second survey) of 2014. A total of 914 indigenous were involved in the study, and 1590 blood samples were collected in filter paper. For molecular diagnosis of malaria, four different PCR protocols were tested, three based on ribossomal (18S rRNA) target and one non-ribosomal (Pvr47/Pfr364). The result s obtained demonstrated that Pvr47/Pfr364 was the most sensitive protocol, however, these targets did not differentiate Plasmodium species. Among the protocols based on the 18S rRNA gene (Nested-PCR, RT-Mangold and RT-Rougemont), the Nested-PCR (reference molecular method) was more suitable for the specific diagnosis of submicroscopic infection. Taken together, this study of malaria infection in Yanomani population showed that: (i) while 0.9% of positivity was detected by the optical microscopy (MO), the conventional routine diagnosis, molecular diagnosis was able to detect 7,8%; (ii) P. vivax was the most prevalent specie in the area, followed by P. malariae and P. falciparum in similar proportions; (iii) malaria positivity decreased with age (children>teenagers>adults) and fluctuates according to seasonal variations (september>november); (iv) malaria prevalence varied accor ding to the Yanomani tribe, which suggest that malaria is not homogeneous transmitted in the study area. The results presented here may account for strategic plans to control malaria in indigenous populations, and to estimate the real malaria incidence in areas under epidemiological vigilance.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-24T18:25:15Z No. of bitstreams: 1 D_Mestrado_Robortella_Diagnóstico_CPqRR-2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-24T18:25:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 D_Mestrado_Robortella_Diagnóstico_CPqRR-2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T18:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 D_Mestrado_Robortella_Diagnóstico_CPqRR-2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 3 D_Mestrado_Robortella_Diagnostico_CPqRR-2016.pdf.txt: 147676 bytes, checksum: e74efc2c2c5793a2927f4ba6c4952b6f (MD5) D_Mestrado_Robortella_Diagnostico_CPqRR-2016.pdf: 1869875 bytes, checksum: f2ad512eae8aaa93188f43cda2c1a19a (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Nos últimos anos, a incidência de malária no Brasil vem reduzido significativamente, particularmente, em virtude das medidas de controle. Neste novo cenário, faz-se necessário identificar e tratar a malária submicroscópica, uma vez que estes indivíduos constituem fonte de infecção para o mosquito vetor. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa vem aprimorando o diagnóstico molecular de malária e, recentemente, padronizou uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR), altamente sensível, para a detecção de alvos não ribossomais (Pvr47 e Pfr364) dos plasmódios. Baseado nestes achados, o objetivo do presente trabalho foi investigar a malária subpatente em tribos indígenas de povos Ianomâmis, onde as baixas parasitemias parecem ser frequentes. A população de estudo foi constituída de indivíduos pertencentes a cinco aldeias ianomâmis do Polo Base Marari, estado do Amazonas. O estudo envolveu dois cortes transversais, sendo realizados nos meses de setembro (primeiro corte transversal) e novembro (segundo corte transversal) de 2014. Foram incluídos no estudo um total de 914 indígenas, com cerca de 1590 amostras de sangue coletadas em papel de filtro. Para o diagnóstico molecular de malária, quatro diferentes protocolos de PCR foram utilizados, sendo três baseados em alvos ribossomais (18S rRNA) e um em alvos não ribossomais (Pvr47/Pfr364) dos plasmódios. Os resultados aqui obtidos permitiram demonstrar que os alvos Pvr47/Pfr364 foram os mais sensíveis para o diagnóstico de malária submicroscópica, embora não se mostraram adequados para o diagnóstico de espécie. Dentre os protocolos baseados no gene 18S rRNA aqui utilizados (Nested-PCR, RT-Mangold e RT-Rougemont), a Nested-PCR (método molecular de referência) se mostrou mais apropriada para o diagnóstico específico das infecções maláricas submicroscópicas. Em conjunto, este estudo de infecção malárica em populações ianomâmis permitiu demonstrar que: (i) enquanto 0,9% das amostras foram positivas pela microscopia ótica (MO), diagnóstico de rotina, os protocolos moleculares identificaram 7,8% de postividade; (ii) P. vivax foi a espécie predominante, seguido do P. malariae e P. falciparum em proporções similares; (iii) a positividade por malária diminuiu com a idade (crianças>adolescentes>adultos) e foi influenciada pelas variações sazonais (setembro>novembro); (iv) a prevalência de malária variou significativamente nas diferentes aldeias, sugerindo que a doença não está homogeneamente distribuída na área de estudo. Espera-se que os resultados aqui obtidos possam contribuir para o direcionamento e monitoração de medidas de controle em reservas indígenas, bem como estimar a real incidência de malária nas áreas sob vigilância epidemiológica. / In the last few years, considerable success in reducing malaria incidence has been achieved in Brazil mainly as result of global efforts to control disease. In this new scenario, the need to detect and treat submicoscopic infections is becoming increasing important, as these individuals can be a source of infection for mosquito vectors. Aiming to improve molecular diagnosis of malaria, our research group has standardized a real-time PCR protocol (RTPCR), highly sensible, for the detention of non-ribossomal plasmodium targets. Based on these findings, the goal of the present work was to investigate subpatent malaria infection in ianomâmis indigenous tribes, where low levels of parasitaemia seems to be common. The study population involved five Ianomâmis communities from the indigenous district of “Polo Base Marari”, Amazon state. Two cross-sectional studies were carried-out by the research team, in september (first survey) and november (second survey) of 2014. A total of 914 indigenous were involved in the study, and 1590 blood samples were collected in filter paper. For molecular diagnosis of malaria, four different PCR protocols were tested, three based on ribossomal (18S rRNA) target and one non-ribosomal (Pvr47/Pfr364). The results obtained demonstrated that Pvr47/Pfr364 was the most sensitive protocol, however, these targets did not differentiate Plasmodium species. Among the protocols based on the 18S rRNA gene (Nested-PCR, RT-Mangold and RT-Rougemont), the Nested-PCR (reference molecular method) was more suitable for the specific diagnosis of submicroscopic infection. Taken together, this study of malaria infection in Yanomani population showed that: (i) while 0.9% of positivity was detected by the optical microscopy (MO), the conventional routine diagnosis, molecular diagnosis was able to detect 7,8%; (ii) P. vivax was the most prevalent specie in the area, followed by P. malariae and P. falciparum in similar proportions; (iii) malaria positivity decreased with age children>teenagers>adults) and fluctuates according to seasonal variations (september>november); (iv) malaria prevalence varied according to the Yanomani tribe, which suggest that malaria is not homogeneous transmitted in the study area. The results presented here may account for strategic plans to control malaria in indigenous populations, and to estimate the real malaria incidence in areas under epidemiological vigilance.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T19:15:34Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao_LaraCottaAmaral.pdf: 1571356 bytes, checksum: d96cdf3ef9b085b1c5f6bb55657eaaac (MD5) Dissertacao_LaraCottaAmaral.pdf: 1571356 bytes, checksum: d96cdf3ef9b085b1c5f6bb55657eaaac (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T19:15:44Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_LaraCottaAmaral.pdf: 1571356 bytes, checksum: d96cdf3ef9b085b1c5f6bb55657eaaac (MD5) Dissertacao_LaraCottaAmaral.pdf: 1571356 bytes, checksum: d96cdf3ef9b085b1c5f6bb55657eaaac (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T19:15:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_LaraCottaAmaral.pdf: 1571356 bytes, checksum: d96cdf3ef9b085b1c5f6bb55657eaaac (MD5) Dissertacao_LaraCottaAmaral.pdf: 1571356 bytes, checksum: d96cdf3ef9b085b1c5f6bb55657eaaac (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T19:15:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_LaraCottaAmaral.pdf: 1571356 bytes, checksum: d96cdf3ef9b085b1c5f6bb55657eaaac (MD5) Dissertacao_LaraCottaAmaral.pdf: 1571356 bytes, checksum: d96cdf3ef9b085b1c5f6bb55657eaaac (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / O diagnóstico adequado de malária permanece como um dos pilares dos programas de controle da doença no mundo, já que um diagnóstico eficiente permite a identificação precoce de casos e definição do esquema terapêutico, contribuindo para interrupção do ciclo biológico do parasito. A microscopia óptica (MO), atual diagnóstico de referência para malária, tem apresentado limitações, principalmente em casos de co-infecções e baixas parasitemias. Assim sendo, busca-se por técnicas mais sensíveis e específicas para auxiliar a MO, sendo os métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) considerados mais adequados para identificação de indivíduos com infecção submicroscópica. Entretanto, os vários protocolos de PCR apresentados até o momento tem se baseado no gene da subunidade menor do RNA ribossomal 18S dos plasmódios (18S rRNA), que se encontra em poucas cópias no genoma destes parasitos. Recentemente, foram descritas sequências não ribossomais para identificação de Plasmodium vivax (Pvr47) e Plasmodium falciparum (Pfr364), sendo estas sequências promissoras para o diagnóstico molecular de malária. Baseando-se nestes achados, este trabalho propôs o desenvolvimento de um protocolo de Real-Time PCR para validar os alvos Pvr47 e Pfr364 para o diagnóstico de malária vivax e falciparum, respectivamente, com ênfase em infecções mistas e baixas parasitemias. Após padronização com sucesso da técnica de Real-Time PCR (RT-LAMAL), a mesma foi comparada a três outros protocolos moleculares, sendo duas técnicas baseadas no gene 18S rRNA – Nested-PCR (Snounou et al., 1993) e Real-Time PCR (Mangold et al., 2005) – e uma PCR convencional baseada nos alvos Pvr47/Pfr364 (Demas et al., 2011). Para avaliar os protocolos quanto aos seus limites de detecção de infecções únicas e mistas por P. vivax e P. falciparum, foram realizadas titulações de misturas artificiais com diferentes concentrações dos parasitos. Os resultados obtidos nesta etapa revelaram que a PCR-Demas e RT-LAMAL apresentaram os menores limites de detecção para P. vivax e P. falciparum, tanto em infecções únicas quanto mistas, e que o protocolo de RT-Mangold foi incapaz de detectar coinfecções. Posteriormente, os protocolos foram avaliados para o diagnóstico de malária em amostras de campo, incluindo área não endêmica (n=117) e área endêmica para malária (n=163). Os resultados revelaram que os protocolos de RTMangold, PCR-Demas e RT-LAMAL foram mais eficientes na detecção de parasitemias submicroscópicas, porém, o protocolo de RT-Mangold novamente mostrou ser incapaz de detectar infecções mistas. Em conjunto, os dados obtidos demonstraram que os alvos Pvr47/Pfr364 foram mais adequados para o diagnóstico molecular de malária vivax e falciparum do que o gene 18S rRNA. Contudo, o protocolo aqui desenvolvido (RT-LAMAL) se mostra em vantagem à PCR-Demas, com maior rapidez na obtenção de resultados, dispensando a revelação em gel de agarose e uso de brometo de etídeo, além de diminuir a possibilidade de contaminação de reagentes e amostras. Portanto, conclui-se que a RT-LAMAL possui grande potencial para o diagnóstico molecular de certeza de pacientes com infecções mistas e baixas parasitemias. / Accurate diagnosis of malaria remains as one of the pillars for prevention and control of the disease. An efficient diagnostic test may allow early case detection and appropriate treatment, therefore contributing to the interruption of malaria transmission cycle. Because the optical microscopy (OM) – the gold standard of malaria diagnosis – presents significant limitations, mainly in cases of co-infections and low parasitemias, it seems to be essential to develop a more sensitive and specific diagnostic tool. In this context, methods based on the polymerase chain reaction (PCR) seem to be more suitable for detecting individuals with submicroscopic malaria infections. Unfortunately, the majority of PCR-based methods still rely on the 18S rRNA gene targets, present in few copies in the parasite genome. Recently, new target DNA sequences were described for the identification of Plasmodium vivax (Pvr47) and Plasmodium falciparum (Pfr364). Due to the importance of these findings, the goal of the present study was to validate the Pvr47 and Pfr364 targets for the diagnosis of vivax and falciparum malaria, focusing on the development of a real-time PCR for detection of mixed infection and sub-microscopic parasitemia. After successful standardization of the Real-Time PCR (RT-LAMAL), this-PCR protocol was compared with three well-established PCR protocols, two of them relied on the gene 18S rRNA – Nested-PCR (Snounou et al., 1993) and Real-Time PCR (Mangold et al., 2005) -- and a third protocol based on the Pvr47/Pfr364 as target for a conventional PCR assay (Demas et al., 2011). In order to evaluate these different PCR-protocols in terms of their limit of detection, titrations of artificial mixtures of DNA plasmodial were performed. The results revealed that the PCRDemas and RT-LAMAL presented the lowest limit of detection for either single or mixed P. vivax and P. falciparum infections. In addition, the RT-Mangold protocol was unable to detect co-infections. To further evaluate the performance of these four PCR protocols for diagnosis of malaria in the field, we analyzed samples from malaria-endemic areas (n=163) as well as from non-endemic area (n = 117). While the results confirmed that PCR-Demas and RT-LAMAL protocols as being more appropriate for the diagnosis of submicroscopic infection, the data demonstrated again that the RT-Mangold protocol was unable to detect mixed infections. Together, the data confirmed Pvr47/Pfr364 targets as more suitable for molecular diagnosis of P. vivax and P. falciparum. Of interest, the Real-time PCR developed here (RTLAMAL) offers several advantages over the traditional PCR-Demas, including faster processing time and decreased risk of contamination. In conclusion, that RT-LAMAL has great potential for molecular diagnosis of patients with mixed infections and low levels of parasitemia.

Orientador: Ricardo Luiz Dantas Machado / Banca: Mauro Toledo Marrelli / Banca: Carlos Eugênio Cavasini / Resumo: Responsável por 300 a 500 milhões de novas infecções e 1,5 a 3 milhões de mortes por ano no mundo inteiro, a malária continua sendo a principal doença parasitária. Se importante é o combate contra os parasitos, importante também é o conhecimento dos aspectos de incidência, distribuição, especificidade de hospedeiros, além do conhecimento de fatores biológicos e moleculares que determinam a distribuição destes. Neste cenário, um dos principais parâmetros analisados para o controle e monitoramento da malária é a detecção de espécies de Plasmodium nos vetores capazes de infectarem humanos. Embora existam diversas metodologias com este fim, a maioria delas apresenta algumas limitações. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método que permita a identificação do P. falciparum, do P. malariae e das variantes do P. vivax no vetor. Uma PCR foi padronizada, utilizando iniciadores contra regiões específicas do gene CS. A PCR-RFLP foi utilizada para distinguir as variantes do P. vivax. A eficiência da metodologia desenvolvida foi comparada com uma nested-PCR, utilizando Anopheles infectados experimentalmente. Um total de 90 mosquitos foram infectados artificialmente com P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) e P.malariae (n = 30). Estes mosquitos infectados, juntamente com outros 30 não infectados foram avaliados em relação a identificação do Plasmodium por nested PCR e com o CS-PCR. A nested PCR para o P. vivax, P. falciparum e P. malariae identificou 19, 16 e 21 mosquitos positivos, respectivamente; enquanto o CS-PCR detectou em 17, 14 e 16 mosquitos, respectivamente. A comparação entre os dois métodos revelou uma boa concordância (κ = 0,723, 0,867 e 0,657, respectivamente, para P. vivax, P. falciparum... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Malaria remains the most serious vector-borne disease, affecting some 300-500 million people annually, causing 1.5-3 million deaths. Is important the fight against the parasites, but it is also important the knowledge of the incidence, host specificity, molecular and biological factors determining the distribution of these parasites. In this scenario, identification of the human-specific Plasmodium species in the mosquito host is an essential component for planning and monitoring of malaria control operations. However, most of the detection methods show some potential limitations. The objective of this study was development an effective assay for detecting Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae and Plasmodium vivax variants in Anopheles mosquitoes. A PCR was development targeting the CS gene. A PCR-RFLP was used to distinguish the P. vivax variants VK210, VK247 and P. vivax-like. The new PCR assay was compared against a nested PCR using artificially infected Anopheles mosquitoes. A total of 90 mosquitoes were artificially infected with P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) and P. malariae (n = 30). These infected mosquitoes along with another 30 unfed mosquitoes were checked for the identification of Plasmodium by nested PCR and with the CS-PCR. Nested PCR for P. vivax, P. falciparum and P. malariae detected positive infection in 19, 16 and 21 mosquitoes respectively; whereas CS-PCR detected in 17, 14 and 16 mosquitoes, respectively. The comparison revealed a close agreement between the two assays (κ = 0.723, 0.867 and 0.657, respectively for P. vivax, P. falciparum and P. malariae groups). Subsequently, PCR-RFLP efficiently discriminate P. vivax variants... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Janaina Roriz Hipolito.pdf: 4312682 bytes, checksum: ecb7ef268b16e006660e9770d5f663b4 (MD5) Previous issue date: 2006-07-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / A malária é um problema de saúde pública na região Amazônica, mais de 200 mil casos dessa doença ocorrem anualmente no Amazonas, sendo 80% deles causados pelo P. vivax, que vem apresentando índices crescentes de morbidade, principalmente associados à diminuição da sensibilidade aos antimaláricos. Dentre as estratégias para combate e controle da doença, a identificação rápida e precisa da espécie é ferramenta indispensável para um tratamento apropriado, diminuição do risco de transmissão e melhor entendimento da epidemiologia desses parasitas. A técnica microscópica da gota espessa é a principal para diagnóstico da malária, entretanto, outros métodos vêm sendo testados, principalmente os moleculares que tem se mostrado mais sensíveis e específicos para detectar e diferenciar as espécies em baixas parasitemias. Avanços desse método, como a PCR em tempo real, permitem que o resultado do teste seja detectado simultaneamente a amplificação, diminuindo o tempo gasto para a realização do diagnóstico. Com o intuito de detectar molecularmente a malária, verificando a presença de plasmódios, o diagnóstico molecular foi realizado através das técnicas de PCR em tempo real e nested-PCR, para se fazer uma comparação desses dois métodos com o diagnóstico microscópico da gota espessa em 300 amostras criopreservadas, 200 coletadas no dia inicial do tratamento (D0), das quais 88% (176/200) eram provenientes de pacientes de Manaus, as 24 amostras restantes (12%) eram provenientes de localidades do interior do Amazonas: São Gabriel da Cachoeira (09), Tefé (08), Humaitá (04) e Careiro (03). Apenas 9% dessas amostras tinham diagnóstico microscópico de monoinfecção por P. falciparum e 91% (182/200) por P. vivax, não havia nenhuma amostra mista pelo diagnóstico microscópico. O diagnóstico molecular por nested-PCR confirmou a presença de DNA de plasmódio em 100% das amostras monoinfectadas. Adicionalmente, foram observadas infecções mistas, co-infecção de P. falciparum e P. vivax, em 19% (38/200) destas amostras. O diagnóstico molecular por PCR em tempo real (Lightcycler, Roche®) foi realizado em apenas 17% (34/200) dessas amostras. A co-positividade (sensibilidade) dos testes para P. vivax foi em média 71% e a co-negatividade (especificidade) 92%, para P. falciparum a co-positividade foi 91% e a conegatividade 79%. A concordância entre os testes foi regular. As 100 amostras restantes haviam sido coletadas no sétimo dia (D7) de tratamento e eram negativas pela microscopia. O diagnóstico molecular demonstrou 21% de positividade. Este estudo mostrou que muitas infecções mistas vêm sendo subestimadas para fins de avaliação epidemiológica, demonstrando que a sensibilidade e especificidade do diagnóstico molecular são superiores a do teste microscópico. O diagnóstico molecular seria então mais indicado como teste complementar no diagnóstico de pacientes com baixas parasitemias, na análise da quantidade de portadores assintomáticos, em estudo de infecções criptônicas e na avaliação da negativação da parasitemia para monitoramento terapêutico, e em estudos que visem a diminuição da transmissão pela existência de prováveis gametócitos persistentes após o tratamento. Entretanto, esse método não é indicado para rotina de diagnóstico de malária, uma vez que os resultados positivos por essa técnica não significam necessariamente que o paciente desenvolva a doença.