Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-07-03T13:49:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_MarinaLimaSilvaSantos (2).pdf: 2635807 bytes, checksum: c598c1386e331ed15526c363ab1c2321 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-07-03T13:49:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_MarinaLimaSilvaSantos (2).pdf: 2635807 bytes, checksum: c598c1386e331ed15526c363ab1c2321 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-07-03T13:54:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_MarinaLimaSilvaSantos (2).pdf: 2635807 bytes, checksum: c598c1386e331ed15526c363ab1c2321 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-03T13:54:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_MarinaLimaSilvaSantos (2).pdf: 2635807 bytes, checksum: c598c1386e331ed15526c363ab1c2321 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / Plasmodium vivax tem sido reconhecido por sua capacidade de causar malária grave, o que torna prioritário os estudos acerca dos mecanismos patogênicos associados a essa espécie. Dado o caráter inflamatório exibido pela malária vivax, faz-se relevante estudar os fatores genéticos do hospedeiro vertebrado que podem influenciar o curso da doença. Nesse sentido, o presente trabalho investigou a influência da variabilidade genética de componentes plaquetários e do inflamossoma sobre a morbidade na infecção por P. vivax. Mais especificamente, a primeira hipótese avaliada foi a de que alterações clínicas e hematológicas na malária vivax estão envolvidas com polimorfismos em genes de receptores plaquetários, relacionados ao aumento da adesão e/ou agregação das plaquetas: integrina α2 (C807T), integrina β3 (T1565C) e glicoproteína GPIbα (T-5C). A partir do estudo de aproximadamente 200 indivíduos sintomáticos infectados por P. vivax, foi possível confirmar que os polimorfismos do receptor para colágeno (α2) e do receptor para fator de von Willebrand (GPIbα) estão associados a duas das complicações mais frequentes na malária: trombocitopenia grave e anemia. A segunda hipótese investigada foi a de que polimorfismos em genes de componentes do inflamossoma – plataforma molecular capaz de desencadear a produção de citocinas inflamatórias – estão associados à morbidade em pacientes infectados por P. vivax. Nossos achados confirmaram essa hipótese e sugeriram que polimorfismos nos genes de NLRP1, NLRP3 e CARD8 podem contribuir para as alterações clínicas e hematológicas observadas nos indivíduos estudados. Em conjunto, os dados aqui apresentados constituem a primeira demonstração de que a variabilidade genética de receptores plaquetários e componentes do inflamossoma pode influenciar na patogenia da malária causada por P. vivax. Estudos futuros visando esclarecer o papel da cascata de coagulação inflamação na morbidade dessa doença fazem-se necessários. / Plasmodium vivax is increasingly recognized as an important cause of severe malaria, making studies on the mechanisms involved on its pathogenesis of high priority. Given the marked inflammatory status of P. vivax infection, it seems to be relevant to investigate host genetic polymorphisms that might influence the course of disease. In this context, the present study investigated whether genetic variability in platelets and inflammasome components would contribute to vivax malaria morbidity. More specifically, the first hypothesis investigated was that susceptibility to P. vivax disease could be associated with polymorphisms in relevant platelet membrane glycoproteins that result in gain of function: integrin α2 (C807T), integrin β3 (T1565C) and GPIbα (T-5C). By studying about 200 symptomatic patients, we confirmed that polymorphisms associated with collagen (α2), and von Willebrand factor (GPIbα) receptors were associated with two of the most common P. vivax complications: severe thrombocytopenia and anemia. The second hypothesis investigated was that polymorphisms in inflammasome genes – molecular platforms capable of promoting pro-inflammatory cytokines production – could be associated with P. vivax disease. Our findings confirmed this hypothesis and suggested that genetic variability in NLRP1, NLRP3 and CARD8 would partially explain the differences in hematological and clinical profiles of P. vivax patients. All together, this study represents the first demonstration that genetic variability in platelet receptors and inflammasome components might contribute to P. vivax pathogenesis, and it opens new possibilities to investigate the crosstalk between coagulation and inflammation on malaria morbidity.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T14:50:53Z No. of bitstreams: 1 Antonio mauro Rezende.pdf: 690614 bytes, checksum: b6e63e721fa01db8344fd047db4db0fe (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T14:50:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio mauro Rezende.pdf: 690614 bytes, checksum: b6e63e721fa01db8344fd047db4db0fe (MD5) Previous issue date: 2009 / A malária humana é causada por protozoários do gênero Plasmodium. Atualmente, mais de 2 bilhões de pessoas estão sob risco de contrair malária sobretudo em áreas tropicais e subtropicais. No Brasil, a malária está concentrada na região da Amazônia Legal, onde se registram mais de 99% dos casos, sendo cerca de 80% causados pelo Plasmodium vivax. Estratégias efetivas de combate ao parasito são essenciais para o controle da doença, e estas dependem do entendimento de diversos fatores como, por exemplo, a variabilidade genética e a estrutura populacional do P. vivax. Desta maneira, os marcadores moleculares são importantes ferramentas que podem auxiliar na elucidação destes aspectos biológicos do parasito. Contudo, poucos marcadores moleculares estão disponíveis para estudos populacionais de P. vivax, comparado ao P. falciparum, principalmente marcadores neutros ou quase neutros, ideais para esse tipo de estudo. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar novos microssatélites em P. vivax e realizar análises de genética de população em isolados de cinco áreas da Amazônia Brasileira utilizando esses microssatélites e os cinco marcadores do tipo TR mais polimórficos descritos na literatura. Deste modo, uma busca in silico foi realizada utilizando o rascunho do genoma do parasito, e foram selecionados microssatélites com unidades repetitivas variando de 2 a 4 pares de base. Cada locus foi amplificado utilizando iniciadores específicos, incluindo os TRs cujos iniciadores foram baseados na literatura. O DNA molde para a realização da amplificação foi extraído de pacientes com infecção aguda de P. vivax. Os produtos amplificados foram analisados em seqüenciadores automáticos de DNA utilizando programas de análise de tamanhos de fragmentos. As análises de genética de população foram realizadas utilizando vários pacotes computacionais. Ambos marcadores detectaram uma alta diversidade nas populações estudadas. Porém, algumas diferenças foram identificadas nas análises com cada tipo de marcador molecular, dentre elas: as populações geneticamentes próximas foram diferentes juntamente com o padrão de desequilíbrio de ligação em cada população e a taxa de multiplicidade de infecção também variou entre os tipos de marcadores. Além disso, foi possível, utilizando os microssatélites, estruturar as populações, o que não ocorreu utilizando os TRs. Por fim, foi possível perceber que os microssatélites se mostraram mais polimórficos, mais bem distribuídos pelo genoma do parasito e ainda assim, o seu mecanismo de manutenção de variabilidade é conhecido, logo, eles aparentam ser mais aptos na utilização de estudos de genética de população de P. vivax. / Human malaria is caused by a protozoan from genus Plasmodium. Currently, more than 2 billion people are under risk to contract malaria mainly in tropical and subtropical areas. In Brazil, malaria is concentrated in the Legal Amazon, where more than 99% of the cases are registered, being around 80% caused by Plasmodium vivax. Effective strategies of combating are essential to control the disease, and these ones depend on understanding of many factors such as the genetic variability and population structure of P. vivax. Hence, molecular markers are important tools that can help to elucidate these biological aspects of the parasite. However, few molecular markers are available for population studies of P. vivax, compared with P. falciparum, mainly neutral or near neutral markers, which are indicated for this kind of study. Thus, the aim of this work was to identify new polymorphic microsatellite loci in P. vivax and to perform population genetic analyses with isolates from five areas of Brazilian Amazon using these microsatellites and also the five most polymorphic tandem repeats markers described in literature. For this, an in silico search was performed using the genome draft of the parasite, and microsatellite with repeat units ranging from 2 to 4 base pairs were selected. Each locus was amplified using specific primers, including the TRs whose primers were previously described. The template DNA for amplification was obtained from patient’s blood with acute P. vivax infection. The amplified products were analyzed in automatic DNA sequencer using software to identify fragments size. The genetic population analyses were performed with several computational packages. Although, some differences were identified among the measured parameters with each kind of molecular marker: the populations genetically close, linkage disequilibrium pattern in each population and level of multiple infection were different. Besides, it was possible, using the microsatellites, to detect structuring of the populations, what did not happen using the TRs. In conclusion, it was possible to notice that the microsatellite are more polymorphic, more spread across parasite genome, and its variability maintenance mechanism is known; thus, they seem to be more useful in population genetic studies of P. vivax field isolates.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-07-03T14:15:05Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_DeniseAneteMadureiradeAlvarenga.pdf: 2391638 bytes, checksum: 254783266513aa9d2f11652f9faa7625 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-07-03T14:15:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_DeniseAneteMadureiradeAlvarenga.pdf: 2391638 bytes, checksum: 254783266513aa9d2f11652f9faa7625 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-07-03T14:15:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_DeniseAneteMadureiradeAlvarenga.pdf: 2391638 bytes, checksum: 254783266513aa9d2f11652f9faa7625 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-03T14:15:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_DeniseAneteMadureiradeAlvarenga.pdf: 2391638 bytes, checksum: 254783266513aa9d2f11652f9faa7625 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundacão Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoracão. Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoracão. Belo Horizonte, MG, Brazil / No Brasil, foram descritas duas espécies de plasmódios simianos, Plasmodium brasilianum e Plasmodium simium, que são morfológica, genética e imunologicamente similares aos plasmódios humanos Plasmodium malariae e Plasmodium vivax, respectivamente. Plasmodium brasilianum infecta naturalmente macacos das famílias Cebidae, Aotidae, Pitheciidae e Atelidae, e foi detectado em uma ampla região geográfica. Já P. simium foi encontrado em uma área muito mais restrita, com descrições apenas nas regiões Sul e Sudeste, infectando naturalmente somente os gêneros Alouatta e Brachyteles, da família Atelidae. Apesar da malária no Brasil estar restrita como endemia à região amazônica, também são descritos casos da doença na região extra-amazônica, entre eles casos autóctones de malária, como os notificados em áreas de Mata Atlântica. Sugere-se que a manutenção destes casos envolva a presença de macacos infectados, que podem atuar como reservatórios da doença. Portanto, estudos moleculares das espécies de plasmódios simianos são fundamentais para o entendimento da real prevalência da doença, da dinâmica de transmissão, diversidade dos parasitos, assim como para esclarecer as relações filogenéticas entre as diferentes espécies de Plasmodium. O relato recente de casos autóctones no estado do Rio de Janeiro nos motivou a investigar a malária simiana na região. O presente estudo foi realizado em parceria com o Centro de Primatologia do Rio de Janeiro (CPRJ), que está localizado no município de Guapimirim, onde foram relatados alguns destes casos autóctones. Foi realizada a extração de DNA a partir de amostras de sangue de 30 primatas do CPRJ para o diagnóstico molecular por Nested PCR e sequenciamento. O resultado do diagnóstico molecular indicou uma taxa de infecção de 30% nos primatas do CPRJ (9 amostras positivas), sendo 5 amostras positivas para P. brasilianum; 3 amostras positivas para P. simium e 1 amostra positiva para ambos os parasitos (infecção mista). O fragmento do 18SSU rRNA amplificado para o diagnóstico foi sequenciado e as sequencias obtidas de P. simium alinhadas com sequências de outras espécies de Plasmodium disponíveis no GenBank e utilizadas para reconstrução da árvore filogenética. A partir do alinhamento, fica evidente que o fragmento analisado é bastante conservado, mostrando uma alta similaridade genética entre P. simium e P. vivax. É importante ressaltar que o nosso estudo mostra de forma inédita a descrição de infecção malárica por P. simium nos gêneros Cebus e Sapajus. Essa descoberta é de suma relevância uma vez que ressalta a possibilidade de malária por P. simium em outras espécies de primatas não humanos, cujo impacto pode ser significativo para a epidemiologia da doença. A presença de símios infectados atuando como reservatórios da malária pode sugerir um caráter zoonótico da doença nas regiões de Mata Atlântica. Além disso, abre a possibilidade de utilizar estes macacos como novo modelo de malária vivax. Ademais, o maior entendimento da saúde dos animais selvagens é um ponto chave para a sua conservação. As doenças parasitárias e infecciosas estão envolvidas em eventos de declínios populacionais, e até mesmo de extinções de espécies. Logo, este estudo pode contribuir para a conservação dos primatas, especialmente aqueles que estão ameaçados de extinção, como alguns Cebus e Sapajus. / In Brazil, have been described two species of simian plasmodia, Plasmodium brasilianum and Plasmodium simium. These parasites are morphologically, genetically and immunologically similar to the human parasites P. malariae and P. vivax, respectively. Plasmodium brasilianum naturally infects monkeys of the Cebidae, Aotidae, Pitheciidae and Atelidae families, and was detected in a large geographic area. On the other hand, P. simium was described in a restricted area, only in the Atlantic Forest of the South and Southeast regions of Brazil naturally infecting monkeys of the genus Alouatta and Brachyteles, of the Atelidae family. Although malaria in Brazil been restricted as endemic to the Amazon region, cases of the disease have also been described in extra-Amazon region, including autochthonous cases, as reported in the Atlantic Forest. It is suggested that the maintenance of these cases involve the presence of infected monkeys, which can act as reservoirs of the disease. Therefore, molecular studies of simian plasmodia species are paramount to understand the true prevalence, transmission dynamics, diversity of parasite, as well as to clarify phylogenetic relationships between different Plasmodium species. The report of autochthonous cases in Rio de Janeiro motivated us to study the simian malaria in the region. This study is conducted in collaboration with the Primate Center of Rio de Janeiro (CPRJ), located in Guapimirim municipality, where autochthonous cases have been reported. DNA extraction from blood samples of 30 non-human primates kept in captivity in CPRJ for plasmodium molecular diagnosis by nested PCR (18SSuRNA) and DNA sequencing were performed. The result of the molecular diagnosis shows an infection rate of 30% in the captivity non-human primates from CPRJ (nine samples positive), of which five samples were positive for P. brasilianum; three samples were positive for P. simium and one sample positive for both parasites (mixed infection). The sequences obtained for P. simium were aligned with other Plasmodium species available in GenBank and then used to reconstruct a phylogenetic tree. From the alignment, it is evident that the fragment analyzed is highly conserved, showing a high genetic similarity between P. vivax and P. simium. Importantly, our study shows for the first time the description of malarial infection by P. simium in the genus Cebus and Sapajus. This discovery is of great importance since highlighted the possibility of malaria by P. simium in other species of non-human primates whose impact could be significant for the epidemiology of the disease. The presence of infected apes acting as reservoirs of malaria may suggest zoonotic disease transmission in areas of the Atlantic Forest. In addition, it opens the possibility of using these monkeys as a new model for vivax malaria. Beyond that, the greater understanding of wildlife health is a key to their conservation. Parasitic and infectious diseases are involved in population declines events, and even species extinctions. Therefore, this study can contribute to the conservation of primates, especially those who are threatened with extinction, as some Cebus and Sapajus.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-24T17:59:24Z No. of bitstreams: 1 D_Mestrado_Camila_Barbosa_Analise_CPqRR_2016.pdf: 594407 bytes, checksum: 9810f750425fd643ea5aeebcee118c95 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-24T17:59:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 D_Mestrado_Camila_Barbosa_Analise_CPqRR_2016.pdf: 594407 bytes, checksum: 9810f750425fd643ea5aeebcee118c95 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T17:59:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 D_Mestrado_Camila_Barbosa_Analise_CPqRR_2016.pdf: 594407 bytes, checksum: 9810f750425fd643ea5aeebcee118c95 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 3 D_Mestrado_Camila_Barbosa_Analise_CPqRR_2016.pdf.txt: 99207 bytes, checksum: 7138ee2affbb1ed24e564e6839fee7fb (MD5) D_Mestrado_Camila_Barbosa_Analise_CPqRR_2016.pdf: 594407 bytes, checksum: 9810f750425fd643ea5aeebcee118c95 (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A malária é uma doença parasitária prevalente principalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Indivíduos infectados com Plasmodium vivax, mais prevalente espécie do parasito no Brasil, apresentam dentre outras características, a anemia como uma das principais complicações. Além disso, essa espécie é capaz de desenvolver hipnozoítos que podem levar ao reaparecimento dos sintomas em episódios denominados recaídas. No entanto, os mecanismos responsáveis pela ativação desses hipnozoítos ainda são desconhecidos. O metabolismo do ferro tem sido associado com o desenvolvimento de diversos organismos, inclusive Plasmodium, além de estar envolvido em distúrbios hematológicos, como a anemia. Assim, a hipótese investigada neste trabalho é que as moléculas envolvidas na homeostase do ferro podem ser utilizadas como biomarcadores de recaída e/ou de anemia através da análise dos polimorfismos C282Y e H63D no gene da hemocromatose (HFE) e C326Y/S no gene da ferroportina (FPN). Os indivíduos analisados foram divididos segundo os dois grandes temas desse estudo: (1) indivíduos que tiveram uma ou múltiplas recaídas por P. vivax e (2) indivíduos anêmicos e não anêmicos infectados por P. vivax. A frequência do polimorfismo H63D identificada no grupo de múltiplas recaídas foi de 17%, enquanto que no grupo de uma recaída foi de apenas 2%. Não foi observada diferença significativa entre indivíduos anêmicos e não anêmicos para os polimorfismos HFE H63D e C282Y. Tanto no grupo de anemia quanto no grupo de recaída não foram encontrados os polimorfismos C326Y e C326S no gene da ferroportina. Os resultados obtidos nesse estudo evidenciam que o polimorfismo HFE H63D pode estar relacionado ao acúmulo de ferro nos indivíduos com múltiplas recaídas, sugerindo que esse polimorfismo pode ser considerado um biomarcador de múltiplas recaídas. Além disso, esses resultados abrem a perspectiva de realização de novos estudos que contribuam para a elucidação dos mecanismos que desencadeiam as múltiplas recaídas. Esses resultados podem inclusive contribuir para novas estratégias nos programas de eliminação da malária, como projetos de monitoramento de indivíduos que possuam predisposição ao acúmulo de ferro, e também resistência ao tratamento, principalmente nas áreas endêmicas. / Malaria is one of the most prevalent parasitic diseases in tropical and subtropical regions of the world. Plasmodium vivax, the major species of the parasite in Brazil, has among other characteristics: anemia as one of the main symptoms, and the ability to develop latent forms in the liver, called hypnozoites, responsible for the reappearance of symptoms months or even years after infection. However, the mechanisms accountable for activation of these hypnozoites are still unknown. The iron metabolism has been associated with the development of many organisms, including Plasmodium, as well as being involved in hematological disorders such as anemia. Therefore, the hypothesis of this study is that the molecules involved in iron homeostasis can be used as biomarkers of relapse and/or anemia by analysis of the polymorphisms C282Y and H63D in the hemochromatosis gene (HFE) and C326Y/S in the ferroportin gene (FPN). The individuals analyzed were divided according to the two areas of this study: Relapse and anemia. By PCR-RFLP were found 33% heterozygotes for the HFE H63D polymorphism and only 4% heterozygous (n=35). The frequency of the HFE H63D polymorphism in multiple relapses group was 17% of the mutated allele, while in the group of one relapse was 2%. There was no significant difference between anemic and non-anemic individuals for HFE H63D and C282Y polymorphism. In both groups of anemia and relapse the C326Y and C326S polymorphisms were not found in the ferroportin gene. The results of this study show that the HFE H63D polymorphism may be related to the accumulation of iron in individuals with multiple relapses, suggesting that this polymorphism can be considered a biomarker of multiple relapses. Moreover, these findings open up the prospect of new studies that contribute to the elucidation of the mechanisms that trigger multiple relapses. These results may contribute to new strategies for malaria elimination programs, such as monitoring projects of individuals who have predisposition to iron accumulation, especially in endemic areas

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T16:18:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_AraceleMariadeSouza.pdf: 1969310 bytes, checksum: ae3fecb3017333f3a7da611ca9281165 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T16:18:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_AraceleMariadeSouza.pdf: 1969310 bytes, checksum: ae3fecb3017333f3a7da611ca9281165 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T16:18:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_AraceleMariadeSouza.pdf: 1969310 bytes, checksum: ae3fecb3017333f3a7da611ca9281165 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T16:18:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_AraceleMariadeSouza.pdf: 1969310 bytes, checksum: ae3fecb3017333f3a7da611ca9281165 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A malária é causada por parasitos do gênero Plasmodium, sendo P. vivax a espécie mais amplamente distribuída no mundo. Em áreas endêmicas, é frequente a coinfecção em um mesmo indivíduo por diferentes variantes de P. vivax, caracterizando uma infecção múltipla. Nestas infecções, diferentes proporções das variantes podem ser relevantes na competição entre elas, na virulência e na resistência às drogas. O objetivo deste trabalho foi de avaliar a eficiência dos marcadores moleculares na identificação de infecções múltiplas por P.vivax. Desta forma, foram selecionados seis marcadores (MS06, MS07, MSP-3α, MSP-1B2, MSP-1B10 e MN21) caracterizados por polimorfismos de tamanho analisados por eletroforese capilar. Para cumprir este objetivo foram usadas três estratégias metodológicas. Inicialmente dois diferentes alelos amplificados de cada loci foram clonados em plasmídeos para o estabelecimento de infecções múltiplas artificiais. Na segunda estratégia foram realizadas misturas artificiais de DNAs de pacientes com parasitemia e níveis de leucócitos semelhantes. E por fim, realizou-se a genotipagem de isolados de P. vivax de 47 pacientes da Amazônia Brasileira, sendo 22 pacientes com infecção múltipla previamente identificada. Ao simularmos infecções múltiplas artificiais com diferentes proporções de cada clone ou DNA de paciente verificamos que: (1) para os MS e TR, alelos menores foram preferencialmente amplificados por PCR; (2) para ambos os blocos da MSP-1, ocorreu titulação nos resultados; (3) para MSP-3α não houve amplificação preferencial do alelo menor; (4) a utilização do critério de altura mínima de ¼ da do pico predominante para a detecção dos alelos raros foi mais eficiente na detecção da multiplicidade de infecção. Na genotipagem de isolados de campo os marcadores MS06, MS07, MSP-1B10, MSP-3α e MN21 foram suficientes para detecção de 100% das infecções múltiplas em pacientes. Assim, estamos propondo um painel de marcadores neutros (MS06, MS07 e MN21) e não neutros (MSP-3α e MSP-1B10) na detecção de infecções múltiplas utilizando o critério menos estringente para detecção dos alelos raros. / Plasmodium vivax infection is often characterized by the presence of two or more genetically distinct variants co-infecting the same human host (multiple-clone infection). Competition between co-infecting parasite clones is a major factor in the evolution of phenotypes such as virulence, transmissibility and drug resistance. Thus, accurate detection of multiple-clone P. vivax infections is very important for malaria control. The accuracy of P. vivax genotyping and multiple-clone infections characterization depend on several factors, such as the methods and the molecular markers of choice used in genotyping, the number of markers assessed, and the population diversity of the markers. Thus, the present study sought to evaluate the efficiency of different molecular markers – antigen-coding genes (MSP-1B2 , MSP-1B10), tandem repeat (MN21) and microsatellites (MS06 and MS07) – to detect multiple-clone P. vivax infections. In addition, this study enabled us to compare the efficiency of molecular markers to detect multiple-clone infections with well known proportions of clones. These six markers are characterized by size polymorphisms, being amplified by PCR and analyzed by capillary electrophoresis. Three methodological strategies were used. Initially, two different fragments for each lócus were cloned into plasmids for the establishment of artificial multiple-clone infections. In the second strategy, artificial mixtures of DNA from patients with similar levels of parasitemia and leukocytes were performed. Finally, we genotyped 47 isolates of P. vivax from patients living in the Brazilian Amazon, being 22 patients with previously identified multiple-clone infections. From the artificial multiple-clone infections, the most important data were: (1) for microsatellites and the tandem repeat, the minor alleles were preferentially amplified by PCR; (2) for both blocks of the MSP-1, reliable estimates were obtained of the relative abundance of alleles present in clone mixtures; (3) for MSP-3α, no preferential amplification of the minor allele occurred, and (4) a minimum value of ¼ of the predominant peak for detection of rare alleles was more efficient in detecting the multiplicity of infection. For field isolate genotyping, a relevant result was that five markers - MS06, MS07, MSP-1B10, MSP-3α and MN21 - were sufficient for detection of 100% of multiple infections in patients. Considering all these findings, we were able to define a panel of markers to be used in determining multiple-clone infections in epidemiological studies composed by neutral (MS06, MS07 and MN21) and non neutral (MSP-3α and MSP-1B10) markers using the less stringent criteria for detection of rare alleles.

Submitted by JACIARA CRISTINA ALMEIDA DO AMARAL (jaciaramaral@ufpa.br) on 2018-09-24T14:00:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Tamirys Simão Pimenta.pdf: 2171990 bytes, checksum: 5a03ee3e20f4e48c0195145b0d6abc43 (MD5) / Approved for entry into archive by JACIARA CRISTINA ALMEIDA DO AMARAL (jaciaramaral@ufpa.br) on 2018-09-24T14:01:04Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Tamirys Simão Pimenta.pdf: 2171990 bytes, checksum: 5a03ee3e20f4e48c0195145b0d6abc43 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-24T14:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Tamirys Simão Pimenta.pdf: 2171990 bytes, checksum: 5a03ee3e20f4e48c0195145b0d6abc43 (MD5) Previous issue date: 2018-07-19 / A malária é uma das mais importantes doenças transmitidas por vectores e que acomete grande parte da população mundial. O P. vivax é a espécie predominante nas Américas, representando 64% dos casos. A área endêmica da malária no Brasil compreende a Região Amazônica, responsável por 99% dos casos autóctones. Trabalhos anteriores demonstraram a alta prevalência da malária em garimpeiros na região Amazônica e a espécie mais frequente envolvida é o P. vivax. A resistência à malária faz parte da interação de diferentes fatores que regulam as relações entre o parasito e o hospedeiro. Essa interação é um fator determinante na resposta imune a infecção. Os polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) nos genes de citocinas têm sido explorados em estudos de variação genética humana e tentam explicar a influência dessa variação na susceptibilidade as doenças infecciosas. As variações no número de cópias (CNVs) também podem afetar potencialmente a expressão dos genes de várias maneiras, contudo pouco se sabe sobre o papel dessa variação genética na adaptação humana frente à infecção pelo P. vivax. O estudo objetivou investigar se as alterações genômicas quantitativas e os SNPs nos genes TNFA-308A>G, IFNG+874T>A, IL6-174C>G e do haplótipo -1082/-592/-819 no gene IL10, associados à produção de citocinas podem influenciar na fisiopatogenia da malária vivax. O estudo selecionou 129 pacientes, a partir de 288 atendidos na cidade de Itaituba, estado do Pará, sendo 79 pacientes sem infecção para malária e 50 pacientes positivos para P. vivax e destes, 15 tinham infecção primária a malária e 35 pacientes relataram episódios anteriores a infecção. Foi determinada a carga parasitária pela gota espessa; os parâmetros hematológicos; as citocinas foram dosas por citometria de fluxo; a genotipagem dos SNPs foi feita por PCR-SSP e a variação no número de cópias foi determinada pela técnica do aCGH. A análise estatística foi realizada utilizando o programa Bioestat e Graph-pad prim. Observados que ambos os grupos maláricos (primário e recorrente) apresentaram redução significativa no número de plaquetas; no grupo recorrente observamos aumento significativo na porcentagem de monócitos; não observamos diferenças significativas na frequência dos SNPs; não observamos associações dos SNPs com a infecção pelo P. vivax; observamos diferenças significativas nos níveis plasmáticas das citocinas entre os grupos; observamos níveis significativamente maiores nos indivíduos com o haplótipo IL10GCC/GCC e correlação entre os níveis das citocinas IL-10, TNF-α e IL-6 e a carga parasitária; observamos um aumento significativo no nível das citocinas IFN-γ, IL-6 e IL-10 no grupo com malária primária em comparação ao controle endêmico, bem como um aumento significativo na expressão das citocinas TNF-α, IL-6 e IL-10 no grupo recorrente em comparação ao grupo controle, enquanto que a expressão da citocina IFN-γ foi significativamente maior no grupo primário em comparação com o grupo recorrente. Descrevemos pela primeira as alterações quantitativas no genoma dos pacientes infectados com P. vivax e identificamos 112 genes amplificados e 12 genes deletados na população em estudo, e, apesar das CNVs encontradas não incluírem nenhum gene relacionado com receptores ou fatores de resistência a malária vivax e nem estarem correlacionados com os dados clinico-patológicos da doença, observamos vários genes com alterações no número de cópias relacionados a outras doenças. Este estudo fornece dados adicionais sobre a resposta imune entre P. vivax e o hospedeiro e as alterações genômicas quantitativas no hospedeiro de uma área endêmica de garimpo. / In endemic areas of Asia, Oceania, Central and South America and in the horn of Africa P. vivax malaria is a major cause of morbidity with 35 million cases annually. In Brazil, the Amazon region concentrates almost all cases and infections registered countrywide, with more than three hundred thousand cases per year. Several evidences suggest that an exacerbated inflammatory response associated to density parasite is likely to aggravate the malaria symptoms. We assessed the haematological and immunological aspects, genetic alterations related to CNVs that could lead to phenotypic alterations, conferring resistance or susceptibility to malaria, as well the presence of polymorphisms in cytokine genes and their association with the infection in patients living in a gold-mining area in a gold-mining in the Brazilian Amazon Region, establishing patterns of immune response characteristic of primary malaria, recurrent malaria and endemic control. Six SNPs (TNFA-308G/A, IFNG+874T/A, IL6-174G/C, IL10-1082G/A, -819C/T, -592C/A) in four genes were determined; blood cell count was conducted on automatic analyzer; plasmatic cytokines IL-6, IL-10, TNF-α and IFN-γ were quantified by flow cytometry and density parasite was estimated by thick blood films with confirmation by nested-PCR; the CNV was estimated by aCGH and association between copy number and phenotypes (parasite load, mean number of clinical infections of malaria and gender) was assessed. The statistical analyzes were performed by Graph-pad prism 6.0 and Bioestat 5.0. No significant association was found between SNPs and malaria infection; cytokine levels were higher in malaria group when compared to endemic control; production of IL-10 was higher in the presence of GCC/GCC haplotype; IFN-γ levels were correlated with previous malaria episodes; malaria patients showed lower platelet numbers, reduction on white blood cells count and an increased monocyte percentage; significant increase in the IL-6 and IL-10 plasmatic levels in both malaria groups; the primary malaria patients displayed the highest significant plasmatic IFN-γ levels; recurrent malaria patients displayed the highest significant plasmatic TNF-α; malaria infection demonstrated correlation between parasite density and TNF-α, IL-6 and IL-10 levels; a total of 112 amplified genes and 12 deleted genes were observed and the CNVs found did not include any gene related to receptors or vivax malaria resistance factors. There were no statistically significant correlations between the clinical and pathological data (parasite load, mean number of clinical infections of malaria and gender) and the presence of CNVs in the patients studied. This study provides additional data on Plasmodium-host immune response and describes the quantitative changes in the human genome in P. vivax infection in an endemic area of garimpo. / INSTITUTO EVANDRO CHAGAS