Universiẗat, Diss., 2002--Bonn.

Universiẗat, Diss., 2003--Bonn.

University, Diss., 2004--Mainz.

Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Untersuchung von Sepsis-assoziierten Veränderungen des Arachidonsäure (AA)-Metabolismus und die Identifikation differentiell regulierter AA-Metabolite mit Prüfung ihres diagnostischen Potentials bei Patienten mit Sepsis unter Anwendung eines in-vitro Lipopolysaccharid (LPS) Vollblutaktivierungs-Modells. In Zellüberständen von nicht-aktiviertem und LPS-aktiviertem Heparinblut (25 Sepsis- Patienten, 15 Gesunde) wurden AA-Metabolite mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem- Massenspektrometrie analysiert. In einer unabhängigen Kohorte (10 Sepsis-Patienten, 3 Gesunde) wurden nach RNA-Isolation aus Zellmaterial zusätzlich Target-Gene des AAMetabolismus (Cyclooxygenase (COX)-2 und mikrosomale Prostaglandin-E-Synthase (mPGES)-1 mittels quantitativer Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Es konnte eine differentielle Freisetzung von AA, AA-Analoga und der COX-assoziierten Metabolite Prostaglandin (PG) E2, 11-Hydroxyeicosatetraensäure (HETE) und Thromboxan (TX) B2 zwischen Patienten und gesunden Kontrollpersonen gezeigt werden. Sepsis-Patienten wiesen dabei gegenüber Gesunden eine deutlich reduzierte Freisetzung von AA und den COXassoziierten Metaboliten 11-HETE und PGE2 auf. Das Ausmaß der reduzierten Mediatorenfreisetzung bei Sepsis-Patienten war mit der Schwere der Erkrankungssymptomatik und dem klinischen Outcome assoziiert. Auf Genexpressionsebene zeigte sich eine reduzierte Induzierbarkeit der COX-2 mRNA-Expression bei Sepsis-Patienten gegenüber Gesunden, jedoch eine erhaltene Induzierbarkeit auf der Ebene der mPGES-1.

Over the past decades, electrospray ionization for mass spectrometry (ESI-MS) has become one of the most commonly employed techniques in analytical chemistry, mainly due to its broad applicability to polar and semipolar compounds and the superior selectivity which is achieved in combination with high resolution separation techniques. However, responsiveness of an analytical method also determines its suitability for the quantitation of chemical compounds; and in electrospray ionization for mass spectrometry, it can vary significantly among different analytes with identical solution concentrations. Therefore, we investigated the ESI-response behavior of 56 nitrogen-containing compounds including aromatic amines and pyridines, two compound classes of high importance to both, synthetic organic chemistry as well as to pharmaceutical sciences. These compounds are increasingly analyzed employing ESI mass spectrometry detection due to their polar, basic character. Signal intensities of the peaks from the protonated molecular ion (MH+) were acquired under different conditions and related to compound properties such as basicity, polarity, volatility and molecular size exploring their quantitative impact on ionization efficiency. As a result, we found that though solution basicity of a compound is the main factor initially determining the ESI response of the protonated molecular ion, other factors such as polarity and vaporability become more important under acidic solvent conditions and may nearly outweigh the importance of basicity under these conditions. Moreover, we show that different molecular descriptors may become important when using different types of instruments for such investigations, a fact not detailed so far in the available literature.

Heutige naturwissenschaftliche Forschung, beispielsweise in Biologie oder Chemie, ist ohne die Unterstützung durch informationstechnische Systeme nicht realisierbar. Verbesserte Verfahren und Messegeräte ermöglichen detailliertere Erkenntnisse und erzeugen dabei signifikante Datenmengen, die ohne IT-Systeme nicht mehr effizient verarbeitet und verwaltet werden können. Die Datenmengen wachsen kontinuierlich und mit ihnen die Komplexität durchzuführender wissenschaftlicher Berechnungen. Diese Berechnungen und das damit verbundene Lösen komplexer wissenschaftlicher Probleme sind weitere Gründe für die Notwendigkeit dieser Systeme.

Mass spectrometry is the primary technology of proteomics. For the analysis of complex proteomes, protein identities and quantities are inferred from their peptides that are generated by cleaving all proteins with the endopeptidase trypsin. But there is one major disadvantage that is due to biophysical differences, different peptides cause different intensities. Miscellaneous approaches have been developed to circumvent this problem based on the chemical or metabolic introduction of heavy stable isotopes. This enables to monitor protein abundance differences of two or more samples on the same tryptic peptides that differ in mass only. Absolute quantification can be achieved similar by spiking-in synthetic isotopical labeled counterparts of a sample’s tryptic peptides. However, labeling technics suffer from high prices, introduced biases, need for extensive manual control, laborious implementation and implementation restrictions. Therefore, a multiplicity of label-free approaches have been developed that profit from instrumental improvements targeting reliability of identifications and reproducibility of quantitative values. No extensive systematic comparison of label-free quantitative parameters has been published so far presumably because of the laborious implementation. An analysis of primary label-free parameters and associated normalization methods is presented here that compares dynamic and linear ranges and accuracies in the estimation of protein amounts. This facilitated the establishment of label-free procedures addressing three fundamental questions in proteomics: what is a sample’s composition, are proteins that share a specific property enriched and what are the differences between two (or more) samples. A new mathematic model is presented that defines and elucidates enrichment. The procedures were applied first to analyze and compare stem cell plasma membrane proteomes. This is an ambitious model for proteomics because of only small amounts of arduous to analyze, partial hydrophobic proteins in a complex proteomic and chemical background. It is of scientific relevance, as membrane proteins are the cell’s communication interface that enable cell type specific processes and hence can be used to define, isolate and quantify those. The success of cell surface proteome enrichment, the quantitative composition of the proteome and the proteomic difference between stem cells isolated from the dental pulp and cultivated in different media is shown. Secondly, the procedures were applied to the analysis of transient protein networks that assemble onto proteo-liposomes in a newly designed recruitment assay that fully recapitulates membrane sorting as seen in vivo. All transmembrane proteins need to be trafficked to other organelles’ membranes by vesicular trafficking. Sorting signals within the cytosolic regions of the protein cargos trigger the formation of trafficking complexes around those. The transient membrane complexes additionally recognize organelle or organelle-domain specific membrane lipids, such as phosphatidylinositol phosphates. Different trafficking ways are characterized by different trafficking complexes. The elucidation of trafficking complexes that form around a transmembrane protein of interest discloses its trafficking routes and involved signaling processes. The synthetic proteo-liposomes were prepared from chemically defined lipids and heterologous expressed cytosolic domains of type I or type II membrane receptors. The proteomic analyses of such samples are challenging because of huge proteomic backgrounds of proteins binding to the liposomes irrespective of the receptor and relatively small amounts and numbers of receptor-specific binders. Though the basic idea is to elucidate sorting machineries and study membrane trafficking processes, such experiments are untargeted and miscellaneous discoveries were achieved. We elucidated that the apical determinant crumbs 2 is a cargo of the retromer complex. This revealed a fameless level of control for the establishment of cell polarity. We found retromer along with the adapter complexes AP 4 and AP 5 trafficking the beta amyloid precursor protein APP. This confirmed recent publications and yielded new insights. Moreover, many more proteins and complexes appeared to associate with the cytosolic part of APP (AICD) in a membrane context-dependent or -independent manner. Among those, some were so far unknown to interact with AICD, like mTORC1 and the PIKFyve complex.

Das Glioblastom ist eine hochmaligne Tumorerkrankung des zentralen Nervensystems und geht trotz intensiver Forschungsbemühungen mit einer eingeschränkten Prognose und einer Überlebenszeit im Rahmen von einigen Monaten nach Diagnosestellung einher. Cerebrale Metastasen maligner Tumoren treten in Abhängigkeit vom Primärtumor auf, und beschränken nach Erreichen des ZNS die Überlebenszeit ebenfalls auf wenige Monate. Etwa 10% der Glioblastome weisen zystische Veränderungen auf, cerebrale Metastasen maligner Tumoren präsentieren sich ebenfalls nicht selten mit einer zystischen Konfiguration. Streng histologisch gesehen handelt es sich hierbei um Pseudozysten, in denen sich eine zellarme Flüssigkeit befindet, die tumorzellassoziierte Proteine in einer geringen Konzentration enthält. Aufgrund der engen Beziehung der Zysten zu den Tumorzellen gibt die Proteinanalyse der Zystenflüssigkeit über Tumorgenese und Metabolismus Aufschluss. Bereits in einer vorangegangenen Promotionsarbeit der neuroonkologischen Arbeitsgruppe war es gelungen, Proben zystischer Glioblastome und Metastasen im Vergleich zu Liquorproben tumorfreier Patienten mittels SELDI (surface enhanced laser desorption / ionisation) TOF (time of flight) MS (Massenspektrometrie) zu vermessen. Hierbei wurden Alleinstellungsmerkmale im Sinne von isoliert auftretenden Protein-Massenpeaks sowohl in den neoplastischen Proben, als auch in den Liquorproben detektiert. Der theoretische Teil der vorliegenden Arbeit widmet sich der Charakterisierung möglicher Tumorsuppressorproteine, mittels einer Evidenzanalyse / Literaturrecherche unter Verwendung der SELDI-TOF-MS Daten. Da mittlerweile mehrere Bestandteile der SELDI-TOF Hardware kommerziell nicht mehr verfügbar sind, bestand die Notwendigkeit, ein Alternativverfahren zur Proteinbestimmung von Zystenflüssigkeiten zu etablieren. Hierzu wurde in dieser Dissertation die Methode der MALDI (matrix assisted laser desorption / ionisation) TOF-MS zur Messung eines Sets neuer Proben angewendet. Die MALDI-TOF-MS war bereits in mehreren Publikationen zur Massenspektroskopie von Liquorproben beschrieben worden, wohingegen zur Untersuchung cerebraler Zystenflüssigkeiten bisher keine Berichte zu finden sind. Dementsprechend wurde im praktischen Teil ein Aufbereitungs- und Untersuchungsprotokoll eigenständig etabliert. Hiermit konnten Massenspektren der Proben abgeleitet werden, welche in den drei Diagnosegruppen (GBM, Metastasen, Liquorproben) untereinander verglichen wurden. Ergebnisse: Anhand von 20 Massenpeaks aus der SELDI-TOF Untersuchung wurden mittels Datenbanksuche in Expasy Tagident (UniProt) initial 792 Kandidatenproteine ermittelt, welche in Vergleichsliquorproben gesunder Probanden nachweisbar, in Glioblastomzysten aber absent waren, und somit eine tumorsuppressive Aktivität besitzen können. Mittels Evidenzanalyse und erweiterter Literaturrecherche wurde ein Bewertungsalgorithmus erstellt, und es konnte die Anzahl auf 54 Kandidaten reduziert werden. Unter diesen befinden sich bereits bekannte Tumorsuppressoren wie Tumor-Nekrose-Faktoren und Kinase-Inhibitoren, aber auch beispielsweise Ciliary neurotrophic factor und Inhibitor of growth protein als mögliche Tumorsuppressoren, deren Bezug zu Glioblastomen in aktuellen Veröffentlichungen diskutiert wird. Im experimentellen Teil wurde festgestellt, dass die massenspektrometrische MALDI-TOF Messung von nativer Hirntumorzystenflüssigkeit oder nativem Liquor keine verlässlichen Spektren liefert, sodass ein standardisiertes Aufarbeitungsprotokoll notwendig wurde. Nach Einsatz verschiedener Aufreinigungsverfahren, Verdünnungsreihen und Matrices erwiesen sich die Aufreinigung per magnetic beads mit schwachem Kationen-Austausch (WCX) und die Verwendung von 4mg/ml HCCA-Matrix als reliabel. Zusätzlich erfolgte eine 1:5 Vorverdünnung der neoplastischen Proben mit TRIS Puffer pH 6,8, während Liquorproben unverdünnt blieben. Insgesamt wurden 62 Proben untersucht, 25 aus Glioblastomzysten, 15 aus zystischen Hirnmetastasen und 22 Liquorproben als Kontrollgruppe. Im Schnitt konnten 20 Peaks pro Probe abgebildet werden; die jeweils 10 intensitätsstärksten hiervon wurden zur statistischen Aufarbeitung innerhalb der jeweiligen Diagnosegruppe herangezogen. Hierbei zeigten sich signifikante Unterschiede des Auftretens bestimmter Proteinbanden im Vergleich von Tumorproben zu Liquor, zum Teil auch zwischen Metastasen und Glioblastomen. Besonders hervorzuheben sind: - Der in Glioblastomproben signifikant häufig auftretende Peak bei 6433 Dalton entspricht dem Protein LuzP6 oder einer Splice-Variante des Apo-C1. o Für LuzP6 werden in der Literatur Assoziationen mit Neoplasien wie myeloproliferative Erkrankungen und Prostatakarzinom beschrieben. Das Gen für LuzP6 befindet sich auf Chromosom 7q33 und sein Translationsprodukt ist als Self-Tumor-Antigen beschrieben worden. o Apo-C1 wird als Mediator des Lipidstoffwechsels in der Leber synthetisiert und kann immunhistochemisch in Liquor und Gehirngewebe nachgewiesen werden. Eine weitere Splicevariante besitzt eine Größe von 6632 Dalton, dieser Peak liegt ebenfalls signifikant häufiger in Glioblastomen als in Liquor vor. - Der Peak 4303 Dalton wird in Metastasen signifikant häufig nachgewiesen. Als Kandidat findet sich unter anderen der angiogenetische Faktor Adrenomedullin 2, dessen protoonkogene Funktion in mehreren Publikationen beschrieben wird. - In über 95% der Vergleichsliquorproben und in unter 10% der neoplastischen Diagnosegruppen findet sich die Bande 3513 Dalton. In der UniProt Datenbank gibt es hierfür jedoch keine Entsprechung. Auch für ein möglicherweise doppelt geladenes Protein mit 7026 Dalton sind bis dato keine bekannt tumorsuppressiv wirkenden Kandidaten hinterlegt. Die Aufgabe zukünftiger Arbeiten besteht somit in der Identifizierung des zugrundeliegenden Proteins. - Als ubiquitäre Bande in allen drei Diagnosegruppen lässt sich 11725 Dalton beispielsweise dem beta-2-Mikroglobulin zuordnen, das auf allen Körperzellen vorhanden ist und die Antigenpräsentation an das Immunsystem vermittelt. Aufgrund einer Vielzahl weiterer möglicher Kandidatenproteine dieser Größe steht auch hier die eindeutige Identifizierung aus. Antworten auf die Problemstellung 1. Sowohl MALDI, als auch SELDI TOF MS sind geeignet um Flüssigkeiten aus Glioblastomzysten massenspektrometrisch zu analysieren. Um eine verlässliche Messung per MALDI-TOF zu erreichen, müssen die Proben zuvor eine Aufreinigung erfahren. Die Ergebnisse innerhalb der Diagnosegruppen sind reproduzierbar; die MALDI-TOF MS bildet insbesondere niedrige m/z (1.500Da - 20.000Da) ab, und verschiebt somit im Vergleich zur SELDI-TOF MS (4.000Da - 145.000Da) den Messbereich in Richtung kleinerer Molekulargewichte. 2. Unter Anwendung des Aufreinigungsprotokolls gelingt die Abbildung aussagekräftiger Spektren auch bei Proben zystischer Hirnmetastasen. 3. Für lediglich in den Liquor-Vergleichsproben nachweisbare Massenpeaks lassen sich in den verfügbaren Datenbanken sowohl Proteine finden, welche nachgewiesenermaßen tumorsuppressive Aktivität besitzen, als auch solche, bei denen diese noch diskutiert wird. Eine eindeutige Zuordnung eines Peaks zu einem Protein ist mittels MALDI-TOF MS nicht möglich. Hierzu müssen weitere proteomische Methoden wie Proteinsequenzierung, Immunhistochemie oder mRNA-Analysen eingesetzt werden. 4. Aufgrund der Heterogenität der Messergebnisse und der geringen Fallzahl untersuchter Proben lässt sich eine Massenpeak-Tumorsignatur nicht erstellen. Dies betrifft die Glioblastomsubtypisierung und die Primärtumorbestimmung bei Metastasen, aber auch die Unterscheidung von Tumor- und Liquorprobe. Aus heutiger Sicht steht die eindeutige Identifizierung der zu den Peaks korrespondierenden Proteine mittels supplementärer proteomischer, histologischer und molekularbiologischer Verfahren an. Somit kann, ausgehend von dem hier vorgestellten „discovery oriented approach“ als langfristiges Ziel die Beschreibung von Tumormetabolismus und Proteinregulation verbunden mit der Etablierung von Biomarkern angestrebt werden, um neue therapeutische Ansätze zu ermöglichen.:Inhaltsverzeichnis 2 Tabellenverzeichnis 4 Abbildungsverzeichnis 5 Abkürzungsverzeichnis 6 1. Einleitung 8 1.1 Hirneigene Tumore 8 1.1.1 Diagnostik 10 1.1.2 Operatives Vorgehen 11 1.1.3 Postoperative Weiterbehandlung – Adjuvante Therapie 12 1.2 Metastasen 14 1.3 Zystische Tumore 16 1.4 Proteomik 20 1.4.1 Proteomanalyse 21 1.4.2 Protein-Analyseverfahren 21 1.4.3 MALDI TOF 23 1.4.4 SELDI TOF 25 2. Problemstellung 26 3. Material und Methoden 27 3.1 Materialliste 27 3.2 Internetbasierte Recherche möglicher Tumorsuppressorgene 27 3.2.1 Evidenzlevel (gemäß der Internet Datenbank UniProt) 30 3.2.2 Proteincharakteristika 30 3.2.3 Schlagwortbezogene Literatursuche 31 3.3 Massenspektrometrische Untersuchungen 31 3.3.1 Probengewinnung und Aufbewahrung 31 3.3.2 Verwendung und Aufreinigung der Proben 32 3.3.3 Messverfahren 36 4. Ergebnisse 41 4.1 Recherche möglicher Tumorsuppressoren 41 4.2 Probenaufbereitung 48 4.2.1 Ergebnisse der verschiedenen Adaptationsversuche Probe / Matrix ohne weitere Aufreinigung 48 4.2.2 Kit-basierte Aufreinigung 50 4.3 Messergebnisse 52 4.3.1 Häufigkeit der intensitätsstärksten Peaks bei Glioblastomen 54 4.3.2 Häufigkeit der intensitätsstärksten Peaks bei Metastasen 55 4.3.3 Häufigkeit der intensitätsstärksten Peaks der Liquorproben 56 4.3.4 Automatisierte Kontrolle 56 4.3.5 Entitätenvergleich 57 4.4 statistische Aufarbeitung 60 4.4.1 Glioblastom 60 4.4.2 Metastasen 60 4.4.3 Liquor 60 4.5 Nachbetrachtung ausgewählter Peaks (Top 3 jeder Entität) 61 4.5.1 Glioblastom 61 4.5.2 Metastasen 61 4.5.3 Vergleichsproben 62 4.5.4 Exemplarische Vorstellung möglicher Proteinkandidaten 62 5. Diskussion 66 5.1 Diskussion möglicher Tumorsuppressoren 66 5.2 Diskussion der Probenaufbereitung und des Messverfahrens 68 5.3 Diskussion der Messergebnisse 72 5.4 Antworten auf die Problemstellung 76 6. Zusammenfassung 79 Literaturverzeichnis 84 Anlagen 94 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 101 Lebenslauf 102 Danksagung 104

-:INHALTSVERZEICHNIS I BIBLIOGRAPHISCHE BESCHREIBUNG II REFERAT III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV 1 EINLEITUNG 5 1.1 Rheumatoide Arthritis 5 1.2 Stellenwert von Biomarkern bei Rheumatoider Arthritis 5 1.3 Massenspektrometrie 6 1.3.1 Einführung in die Massenspektrometrie 6 1.3.2 MALDI MS Imaging 7 1.3.2.1 Vorteile von MALDI MS Imaging 8 1.3.2.2 Nachteile von MALDI MS Imaging 8 1.3.3 Massenspektrometrie in der Arthritisforschung 9 1.4 Histopathologie bei Rheumatoider Arthritis 9 1.5 Potentielle Biomarker bei Rheumatoider Arthritis 10 1.6 Fragestellung 11 2 PUBLIKATIONSMANUSKRIPT 12 3 ZUSAMMENFASSUNG 17 4 LITERATURVERZEICHNIS 20 5 ANHANG 27 5.1 Selbständigkeitserklärung 27 5.2 Lebenslauf 28 5.3 Danksagungen 30

Ziel dieser Arbeit war es, neue Ansätze für die Analytik kleiner und hochpolarer Pflanzenschutzmittelrückstände in unterschiedlichsten pflanzlichen Materialien zu entwickeln. Dabei standen die Präzision der Analysenergebnisse, der Arbeitsaufwand, sowie die Robustheit der Methoden und die daraus resultierende Übertragbarkeit für die Routineanalytik im Vordergrund. Hierzu wurden verschiedene Arbeitsschritte von Analysenmethoden an ausgewählten Beispielen von hochpolaren Pflanzenschutzmittelrückständen mit niedrigem Molekulargewicht untersucht.:1 Einleitung 2 Zielstellung 3 Theoretische Grundlagen von Pflanzenschutzmitteln 3.1 Begriffsdefinition 3.2 Forschung und Entwicklung 3.3 Zulassung und rechtliche Grundlagen für Pflanzenschutzmittel 4 Matrixeffekte in der LCMS-Analytik 5 Vorstellung der Zielanalyten und bisherige Analytik 5.1 Triazol-Metaboliten 5.2 Difluoressigsäure 5.3 Ethephon und HEPA 5.4 Phosphonsäure 5.5 Glufosinat-Ammonium und dessen Metaboliten 6 Experimenteller Teil 6.1 Extraktion 6.1.1 Test verschiedener Extraktionsmittel 6.1.2 Test verschiedener Behandlungen während der Extraktion 6.2 Extraktaufreinigung 6.2.1 Extraktverdünnung 6.2.2 Festphasenextraktion 6.2.2.1 Triazol-Metaboliten 6.2.2.1.1 Unpolare SPE 6.2.2.1.2 Kationenaustausch-SPE 6.2.2.1.3 Anionenaustausch-SPE 6.2.2.2 DFA 6.2.2.2.1 Unpolare SPE 6.2.2.2.2 Kationenaustausch-SPE 6.2.2.3 Ethephon und HEPA 6.2.2.3.1 Unpolare SPE 6.2.2.3.2 Kationenaustausch-SPE 6.3 Trennverfahren 6.3.1 Flüssigkeitschromatographie 6.3.2 Kapillarelektrophorese 6.4 Detektion 6.4.1 Tandem-Massenspektrometrie 6.4.2 Differential-Mobilitäts-Spektrometrie 6.4.3 Time-of-Flight Detektion 7 Ergebnisse und Diskussion 7.1 Extraktion 7.1.1 Test verschiedener Extraktionsmittel 7.1.2 Test verschiedener Behandlungen während der Extraktion 7.2 Extraktaufreinigung 7.2.1 Extraktverdünnung 7.2.2 Festphasenextraktion 7.2.2.1 Triazol-Metaboliten 7.2.2.1.1 Unpolare SPE 7.2.2.1.1.1 Vortests 7.2.2.1.1.2 Ergebnisse und Diskussion der finalen Durchführung 7.2.2.1.2 Kationenaustausch-SPE 7.2.2.1.2.1 Wahl des pH-Wertes für die Probenaufgabe auf die SPE 7.2.2.1.2.2 Wahl des pH-Wertes für die Elution vom SPE-Material 7.2.2.1.2.3 Ergebnisse und Diskussion der finalen Durchführung 7.2.2.1.3 Anionenaustausch-SPE 7.2.2.1.3.1 Wahl des pH-Wertes für die Probenaufgabe auf die SPE 7.2.2.1.3.2 Wahl des pH-Wertes für die Elution vom SPE-Material 7.2.2.1.3.3 Ergebnisse und Diskussion der finalen Durchführung 7.2.2.2 DFA 7.2.2.2.1 Unpolare SPE 7.2.2.2.1.1 Vortests 7.2.2.2.1.2 Ergebnis und Diskussion der finalen Durchführung 7.2.2.2.2 Kationenaustausch-SPE 7.2.2.2.3 Anionenaustausch-SPE 7.2.2.2.3.1 Wahl des pH-Wertes für die Probenaufgabe auf die SPE 7.2.2.2.3.2 Wahl des pH-Wertes für die Elution vom SPE-Material 7.2.2.3 Ethephon und HEPA 7.2.2.3.1 Unpolare SPE 7.2.2.3.1.1 Vortests 7.2.2.3.1.2 Ergebnisse und Diskussion der finalen Durchführung 7.2.2.3.2 Kationenaustausch-SPE 7.2.2.3.3 Anionenaustausch-SPE 7.2.2.3.3.1 Wahl des pH-Wertes für die Probenaufgabe auf die SPE 7.2.2.3.3.2 Wahl des pH-Wertes für die Elution vom SPE-Material 7.3 Trennverfahren 7.3.1 Flüssigkeitschromatographie 7.3.1.1 Triazol-Metaboliten 7.3.1.2 DFA 7.3.1.3 Ethephon und HEPA 7.3.1.4 Phosphonsäure 7.3.1.5 Glufosinat und dessen Metaboliten 7.3.2 Kapillarelektrophorese 7.3.2.1 Triazol-Metaboliten 7.3.2.2 Difluoressigsäure 7.3.2.3 Ethephon und HEPA 7.3.2.4 Phosphonsäure 7.4 Detektion 7.4.1 Tandem-Massenspektrometrie 7.4.2 Differential-Mobilitäts-Spektrometrie 7.4.2.1 Triazol-Metaboliten 7.4.2.2 Difluoressigsäure 7.4.3 Time-of-Flight Detektion 7.4.3.1 Triazol-Metaboliten 7.4.3.2 Interferenz des 1,2,4-Triazol 8 Zusammenfassung und Ausblick 9 Anhang 9.1 Verwendete Referenzsubstanzen und Interne Standards 9.2 Physikalisch-chemische Eigenschaften der Analyten 9.3 Strukturformeln der Analyten und Internen Standards 9.4 Anwendungsbeispiele der Analyten 9.5 Massenspektrometrische Parameter der Analyten 9.6 Verwendete LC-Parameter 9.7 Verwendete CE-MS/MS-Parameter 9.8 Verwendete Differential-Mobilitäts-Spektrometrie Parameter 9.9 Verwendete QTOF-Parameter 9.10 Verwendete Formeln 9.11 Ergebnisse 9.11.1 Test verschiedener LC-Phasen 9.11.1.1 Triazol-Metaboliten 9.11.1.1.1 Aquasil C18 9.11.1.1.2 Hypercarb 9.11.1.1.3 Luna SCX 9.11.1.1.4 ZIC-pHILIC 9.11.1.2 Difluoressigsäure 9.11.1.2.1 ZIC-pHILIC 9.11.1.2.2 Hypercarb 9.11.1.3 Ethephon und HEPA 9.11.1.3.1 Hypercarb 9.11.1.3.2 Luna NH2 9.11.1.4 Phosphonsäure 9.11.1.4.1 Hypercarb 9.11.1.5 Glufosinat und dessen Metaboliten 9.11.1.5.1 Hypercarb 9.11.1.5.2 ZIC-pHILIC 9.11.2 Validierung LC-DMS-MS/MS für TDMs 9.11.3 Validierung LC-DMS-MS/MS für DFA 9.11.4 Validierung MRMHR für TDMs 10 Literaturverzeichnis 11 Versicherung und Erklärung gemäß Promotionsordnung