The experimental work of this thesis addresses the questions of whether established cell lines injected into murine blastocysts find their way back home and seed preferentially at the site of their origin. Furthermore, can they change their fate and differentiate to unrelated cell types when exposed to the embryonic environment. This survey was based on the fact that different cell lines have different potentials in developing embryos, dependent on their cellular identity. The cell lines used in this survey were AGM region-deriving DAS 104-4, DAS 104-8 cells, yolk sac-deriving YSE cells and bone marrow-deriving FDCP mix cells. These cells were injected into mouse blastocysts. Donor cells were traced in developing embryos via specific markers. Analysis of the embryos revealed that DAS cells are promiscuous in their seeding pattern, since they were found in all analysed tissues with similar frequencies. YSE cells showed preferences in seeding yolk sac and liver. YSE donor cells in chimaeric tissues were not able to change their immuno-phenotype, indicating that they did not change their destiny. Analysis of adult mice did not reveal any of YSE-derived cells donor contribution. In contrast, FDCP mix cells mostly engrafted haematopoietic tissues, although the embryos analysed by in situ hybridization had donor signals frequently in cartilage primordia, heads, and livers. Analysis of whether FDCPmix-derived cells found in foetal livers were of haematopoietic or hepatocytes nature showed that progeny of injected FDCP mix cells do not differentiate into cells that express a hepatocyte-specific marker. Further analysis showed that FDCPmix-derived donor cells found in brain express neural or haematopoietic markers. In order to reveal if they transdifferentiate to neurons or fuse with neurons/glial cells, nuclear diameters of donor and recipient cells were determined. Comparison of the nuclear diameters of recipient and donor cells revealed no differences. Therefore this suggests that progeny of FDCP mix in brain are not fusion products. Analysis of adult mice tissues revealed that presence of FDCP mix-derived cells was the highest in brains. These results confirmed the assumption that the developmental potential of the analysed cells cannot be easily modified, even when exposed to early embryonic environment. Therefore one can conclude that the analysed cell types had different homing patterns depending on their origins. / In der vorliegenden Arbeit wurde als zentrale Frage untersucht, wie Zellen verschiedener etablierter Zelllinien nach Injektion in murine Blastozysten an der Entwicklung der resultierenden chimären Tiere beitragen. Insbesondere wurde untersucht, ob injizierte Zellen bevorzugt oder ausschließlich Gewebe ihres Ursprungs besiedeln (“Homing“), oder ob Donorzellen auch heterologe Gewebe infiltrieren und gegebenenfalls gar unter dem Einfluß der frühembryonalen Blastozysten-Umgebung ihr Zellschicksal ändern und in andere Zelltypen transdifferenzieren können. Diese Studie basiert auf früheren Arbeiten, in denen gezeigt wurde, daß unterschiedliche Zelllinien - in Abhängigkeit ihrer Identität - verschiedene Entwicklungspotentiale im frühen Embryonalstadium haben. Folgende Zelllinien wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht: DAS 104-4 und DAS 104-8 (beide aus der sogenannten AGM Region isoliert), YSE (aus dem Dottersack) und FDCP mix (aus Knochenmark abstammend). Zellen dieser Zelllinien wurden in Maus Blastozysten injiziert und der Chimärismus in sich entwickelnden Embryonen oder adulten Tieren mit Hilfe von Donorzell-spezifischen Markern analysiert. Die Analyse chimärer Embryonen ergab, daß DAS Zellen diese promiskuitiv besiedeln: DAS Zellen wurden in allen untersuchten Geweben mit ähnlichen Häufigkeiten gefunden. YSE Zellen hingegen wurden bevorzugt in der fötalen Leber und im Dottersack nachgewiesen. YSE Donorzellen in chimären Geweben zeigten keine Änderungen in ihrem Immunphänotyp und damit keine Hinweise auf eine mögliche Transdifferenzierung. In adulten Mäusen konnten keine YSE-abstammende Zellen mehr identifiziert werden. FDCP mix Zellen besiedelten vor allem hämatopoetische Gewebe. In Embryonen wurden allerdings auch häufig Donorzell-spezifische in situ Hybridisierungssignale in Knorpelvorläufergewebe, der Leber und in der Kopfregion erhalten. Die FDCP mix Marker positiven Zellen der fötalen Leber wurden negativ auf die Expression von Hepatozyten-Markern getestet. Dies spricht auch in diesem Fall gegen einen Wechsel der Donorzellidentität und Transdifferenzierung. Im Gegensatz dazu wurden im Gehirn FDCP mix abstammende Spenderzellen identifiziert, die entweder neurale oder hämatopoetische Marker tragen. Die Zellkerndurchmesser wurden für die Donor-abstammenden Zellen und für die endogenen Gehirnzellen bestimmt und wiesen keinen signifikanten Unterschied auf. Dieser Befund läßt vermuten, daß FDCP mix abstammende Zellen mit Expression von neuralen Markern nicht das Produkt von Zellfusion von Donorzellen mit Neuronen oder Gliazellen sind. In der Analyse von adulten Mäusen wurden FDCP mix abstammende Zellen am häufigsten im Gehirn identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen für die analysierten Zelllinien, daß sich deren Entwicklungspotential auch bei Exposition in frühembryonalem Milieu nicht leicht modifizieren läßt. Es wurde weiterhin gezeigt, daß die analysierten Zelltypen in Bezug auf ihren Ursprung ein sehr unterschiedliches “Homing“-Verhalten aufweisen.

Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex“ (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des präreplikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgelöst wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich für die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivität der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin für den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den präreplikativen Komplex vervollständigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzuklären. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-Färbung mit Antikörpern gegen eine konservierte Domäne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antikörpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch für die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zusätzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte über Immunpräzipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin präzipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine während der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down“ des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System ermöglicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte Störung des Zellwachstums hin. Zusätzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollständig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen möglichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auffällig häufig lagen in MCM3-„knock-down“-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Phänotypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukleärer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zurückzuführen. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down“-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des präreplikativen Komplexes eine zusätzliche Funktion in der Mitose ausüben. / The initiation of DNA replication is a highly conserved process which is subdivided into three steps. The first step is the binding of the “origin recognition complex” (ORC) to the replication origins in chromosomal DNA which triggers the assembly of the prereplicative complex at the origins. Subsequently the proteins CDC6 and the RLF-B/CDT1 bind to ORC which are both responsible for the recruitment of the heterohexameric MCM-complex to the prereplicative complex (preRC). The kinase CDC7/DBF4 licenses the origin after completion of the preRC by binding of the CDC45 protein. One task of this work was to dissolve the complex network of protein-protein interactions between the different initiator proteins using the method of FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Interactions were found between MCM5 and MCM3, MCM5 and MCM7, ORC5 and MCM7 as well as between CDT1 and MCM6. A further task of this work was to study the intracellular localization of the six murine MCM proteins in murine fibroblasts.In a MCM2-EGFP expressing cell population multinucleated cells occurred frequently. This indicates an incorrect cell division caused by overexpression of MCM2-EGFP and to a possible role of MCM2 in mitosis. Inspecting the intracellular localization of EGFP-fused MCM-proteins was shown, that EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, and EGFP-MCM7 were localized in the centrosomes. In contrast, the proteins MCM2-EGFP, EGFP-MCM2, MCM3-EGFP, EGFP-MCM3, MCM6-EGFP, MCM6-NLS-EGFP, MCM7-EGFP and MCM7-NLS-EGFP are not associated with centrosomes. The localization of endogeneous MCM proteins was analyzed by immunostaining using antibodies against a conserved region among all MCM proteins and also with specific antibodies against MCM3 and MCM6. Centrosomal localization was observed for the MCM proteins and in particular for MCM3 and MCM6. In addition to localization studies, immunoprecipitations showed that MCM3 and MCM6 precipitate with the centrosomal protein g-tubulin. The fact that all MCM proteins assemble at the centrosome, indicates that the MCM proteins act as a multiprotein complex at the centrosome. Since MCM3 and MCM6 are bound to centrosomes in all stages of mitosis these proteins may play a role in the progression of cell division. In the last part of this work, the function of MCM3 at the centrosome was analyzed by protein knock-down using the method of RNA interference. To approach this, an inducible MCM3siRNA-expressing system was established. Switching the transcription of MCM3siRNA on and off was made feasible using the TetOn-System. In this system the transcription is activated by addition of doxycycline, without doxycycline the transcription is switched-off. The influence of doxycycline on cell growth of the MCM3siRNA-expressing cell line was analyzed. By comparison to NIH/3T3 cells and NIH/3T3-TetOn cells a significantly reduced proliferation rate was observed after treatment with doxycycline. These results suggest a disturbance of cell growth by MCM3siRNA production. After treatment with doxycycline more cells are accumulated in G2/M phase compared to untreated cells. The expression of MCM3 was almost completely knocked-down by treatment of cells with doxycycline for 19 days. To analyze the influence of MCM3siRNA on other MCM proteins, the protein level of MCM6 was examined. An increased MCM6 expression was observed. This implies that MCM3siRNA influences the expression level of MCM6. More nuclei were frequently observed in MCM3 knocked-down cells. Cells with two nuclei as well as cells with an impaired number of nuclei were observed, indicating that probably the nuclei pass thruogh different cell cycle stages. Phenotypes observed after expression of MCM3siRNA showed defects in multiple stages of mitosis. The presence of multinucleated cells is apparently due to a blocked cytokinesis. Microtubuli were insufficiently organized and were deficiently bound to the cellular periphery. These results indicate an essential role of the MCM proteins in mitosis besides its described role in the establishment of the prereplicative complex.

Mit Hilfe von in vivo ChIP-Experimenten identifizierten wir eine präRC Bindungsstelle von -2519 bis -2152 (Fragment B) innerhalb eines „origin of bidirectional replication (OBR)“ der 44 kb langen Maus-rDNA-Einheit. Diese Bindungsstelle befindet sich ungefähr 2,3 kb ubstream des Transkriptionsstartpunktes der RNA-Poymerase I. An dieser Bindungsstelle konnte in der G1-Phase der komplette ORC-Komplex sowie Geminin, MCM3 und -6 nachgewiesen werden. Für den G1/S-Phasenübergang deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich ORC6 und Geminin von Fragment B ablösen, während sich CDC6 und -45 an den ORC-Komplex anlagern. Mit Erreichen der S-Phase konnte gezeigt werden, dass sich CDC6 und -45 sowie ORC1 wieder ablösen und ein Core-Komplex von ORC2-5 sowie MCM3 und -6 gebunden bleibt. Außerdem konnte an Fragment B eine spezifische Bindung eines aus FM3A-Zellkernprotein angereicherten präRC-Komplexes (Komplex A) auch in vitro mit Hilfe von EMSA-Experimenten beobachtet werden. Die Bindungsaktivität von Komplex A an Fragment B konnte durch ATP verstärkt werden. / Using chromatin immunoprecipitation assays (ChIP) we identified in vivo a preRC binding site located from -2519 to –2152 (fragment B) within a previously mapped origin of bidirectional replication of the murine rDNA locus located approximately 2.3 kb upstream of the transcription start site of RNA polymerase I. At this sequence, ORC1, -2, -3, -4, -5 -6 as well as Geminin, MCM3 and -6 are bound in G1 phase; at the G1/S transition also CDC6, and -45 interact whereas ORC6 as well as Geminin dissociates. In S phase, ORC1, CDC6 and -45 are released from the preRC. We have reproduced an ATP-dependent assembly of the preRC at origin DNA in vitro using EMSA-Experiments with partially purified proteins from murine nuclear extracts.

Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gewährleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform für weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abhängigkeit von Cdc6 und Cdt1 den prä-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase für die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies ermöglicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen für drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und räumlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivität und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgeführt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate für die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen ist für das Verständnis der Vorgänge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 und Plk1 & Dbf4 gezeigt werden. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch überexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung für die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschränkt ist. Mit der erst kürzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilität des binären Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erhöhten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 führt. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzelluläre Lokalisation und die intranukleäre Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilität von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert. / Eukaryotic DNA replication is a crucial event in the cell cycle ensuring precise duplication of the genome by the coordinated action of a multitude of proteins. To cope with this enormous logistical challenge DNA replication is organized in multiple steps comprising initiation processes, elongation and DNA repair. The initiation step is characterized by the chromatin association of the hexameric ORC (origin recognition complex) which selects controversely discussed DNA sequences as replication origins and serves as a landing pad for further protein components. The MCM complex consisting of the six subunits Mcm2-7 accomplishes the pre-RC in a Cdc6- and Cdt1-dependent manner and is supposed to be released from the origin following initiation to act as DNA helicase, triggering the unwinding of the DNA double helix. This allows the proteins of the elongation machinery to accurately synthezise DNA at distinct microscopically visible sites termed replication foci. A major component of replication foci, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) acts as a sliding clamp tethering the DNA polymerases and further replication factors to DNA. Within the scope of this thesis, the distribution of ORC, MCM and PCNA proteins was investigated in murine L fibroblasts by dual-color immunofluorescence (IF) studies. It could be shown that the proteins of the ORC, the MCM complex and the elongating machinery constitute locations for three different mechanistical events involved in DNA replication which occur at distinct and spatially separated sites, i. e. initiation, helicase activity and elongation. Additionally, IF studies suggest, that histone acetylation is involved in the selection of origins and the recruitment of the pre-RC to chromatin. The assembly of the pre-RC begins in mitosis and is regulated by the activity of multiple protein kinases. To test whether the key regulator of mitotic events, POLO-like kinase1 (Plk1), is capable of phosphorylating pre-RC components, in vitro kinase assays were carried out using full-length Plk1 and a kinase-deficient mutant Plk1 (K82M) as a negative control together with bacterially expressed target proteins. Orc2, Cdc7 and Cdc45 were found to be in vitro substrates of the Plk1 kinase. Furthermore, IF studies using specific antibodies against Orc2, Cdc7 and Cdc45 revealed conspicuous staining patterns for the Plk1 substrates in mitosis. While Orc2 was accumulated in the midbody region in telophase, Cdc7 was localized at the centrosomes and micotubules in anaphase. Cdc45 was found at the centrosomes and the microtubules from prometaphase to anaphase, and in the midbody region during telophase, strikingly matching the mitotic localization patterns of Plk1. The detection of protein-protein interactions is crucial for the understanding of the course of events in DNA replication. By using the bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technique interactions among components of the pre-RC were analyzed in living mammalian cells. The BRET studies revealed direct interactions between Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 and Plk1 & Dbf4. Furthermore, the influence of histone hyperacetylation, as well as the depletion of cyclin-dependent kinases (CDK) on the interaction between Orc2 and Orc3 was investigated. Orc2 and Orc3 were found to be localized in the nucleus and the cytoplasm. To investigate, whether nuclear import of Orc3 is a prerequisite for the interaction of Orc2 with Orc3 to occur, a putative nuclear localization signal (NLS) in the aminoterminal region of Orc3 was truncated in an EGFP-ORC3 fusion construct. Expression of this mutant in L fibroblasts and HEK293T cells resulted in exclusive cytoplasmatic localization. BRET assays using ORC2-Rluc and the NLS-deficient EGFP-ORC3 mutant were performed. In this experiment, a BRET signal was obtained which was indistinguishable from that obtained with wild-type EGFP-ORC3. Together, these findings strongly suggest that the interaction between Orc2 and Orc3 is not restricted to the nucleus. The nuclear as well as the cytoplasmatic distribution of the localization between Orc2 and Orc3 could furthermore be confirmed with a recently developed BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assay. FLIP (fluorescence loss in photobleaching) studies with BiFC-positive cells showing exclusive nuclear distribution revealed decreased mobility of Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) compared with EGFP fusion proteins of Orc2 (t ½ = 8 s) and Orc3 (t ½ = 6 s), suggesting that the association with its binding partner leads to an enhanced capability of Orc2 and Orc3 to bind to chromatin. Additionally, the influence of point mutations on the subcellular localization and intranuclear dynamics of a Cdc6-EGFP fusion protein, previously shown to be localized in replication foci, was analyzed. Further, the mobility of promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) and PML-associated proteins was investigated.

Platelet interaction with the subendothelium is essential to limit blood loss after tissue injury. However, upon rupture of atherosclerotic plaques, this interaction may result in blood vessel occlusion leading to life threatening diseases such as myocardial infarction or stroke. Among the subendothelial matrix proteins, collagen is considered to be the most thrombogenic component as it directly activates platelets. Platelets interact with collagen, either indirectly through glycoprotein (GP) Ib-V-IX receptor complex, or directly through the major collagen receptor on the platelet surface, GPVI. The work presented here focused on studying the cellular regulation of GPVI. In addition, a possible role for GPVI in thrombus formation induced by atherosclerotic plaque material was investigated and it was found that GPVI plays an important role in this process. Using a recently published mitochondrial injury model, it was found that GPVI contains a cleavage site for a platelet-expressed metalloproteinase. Further studies showed that platelet activation by CRP, or thrombin induced down-regulation of GPIb, but not GPVI. In parallel, cellular regulation of GPV was studied and it was found that GPV is cleaved in vitro by the metalloproteinase ADAM17. In previous studies it was shown that injection of mice with the anti-GPVI mAb, JAQ1, induces GPVI down-regulation, which is associated with a strong, but transient, thrombocytopenia. Using new anti-GPVI mAbs, which bind different epitopes on the receptor, it is shown in this study that GPVI down-regulation occurs in an epitope-independent manner. Further experiments showed that antibody treatment induces a transient, but significant increase in bleeding time. Using different genetically modified mice, it is shown that, upon antibody injection, GPVI is both, shed from the platelet surface and internalized into the platelet. Signaling through the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) of the FcR chain is essential for both processes, while LAT and PLC2 are essential for the shedding process only. Antibody-induced increase in bleeding time and thrombocytopenia were absent in LAT deficient mice, showing that it is possible to uncouple the associated side effects from the down-regulation process. As antibody-induced GPVI internalization still occurs in LAT and PLC2 deficient mice, this suggests a novel signaling pathway downstream of GPVI that has not been described so far. / Plättchen Interaktion mit dem Subendothel ist für die Blutstillung essentiell. Dies kann jedoch nach dem Aufbrechen atherosklerotischer Plaques zu lebensbedrohlicher Erkrankungen wie Infarkt oder Schlaganfall führen. Kollagen, welches die Plättchen dirket aktiviert, ist der thrombogenste Bestandteil der Extrazellularmatrix (EZM). Die Bindung zwischen Plättchen und Kollagen wird sowohl indirekt durch den Glykoprotein (GP) Ib-V-IX Rezeptorkomplex, als auch direkt durch den Kollagenrezeptor GPVI, auf der Plättchenoberfläche vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Regulation von GPVI untersucht. Des Weiteren wurde die Rolle von GPVI in durch atheroklerotisches Plaquematerial induzierter Thrombusbildung studiert. Hierbei wurde festgestellt, dass GPVI eine wichtige Funktion in diesem Prozess spielt. Mittels eines jüngst publizierten mitochondrialen Verletzungsmodels, konnte gezeigt werden, dass GPVI eine Erkennungsstelle für eine in den Plättchen exprimierte Metalloproteinase besitzt. Mehrere Versuche haben gezeigt, dass Plättchenaktivierung durch CRP, und Thrombin zur Runterregulierung von GPIb aber nicht von GPVI führt. Parallellaufende Untersuchungen zeigten, dass GPV durch die Metalloproteinase ADAM17 in vitro abgespalten wird. Vorherige Studien ergaben, dass die in vivo Behandlung von Mäusen mit dem anti-GPVI Antikörper, JAQ1, zur Runterregulierung des Rezeptors führt. Dieses ist mit einer starken, transienten Thrombozytopenie assoziiert. Mittels neu generierte anti-GPVI Antikörper (JAQ2, 3), die unterschiedliche Bindungsstellen auf GPVI erkennen, konnte demonstriert werden, dass die Antikörper vermittele GPVI Runterregulierung Epitop unabhängig ist. Weitere Untersuchungen ergaben, dass Anitkörperinjektion eine transiente Erhöhung der Blutungszeit verursacht. Mittels genetisch modifizierter Mäuse konnte dargestellt werden, dass die Antikörpergabe GPVI sowohl von der Plättchenoberfläche abgespalten, als auch internalisiert wird. Während die Signaltransduktion durch das ITAM Motif der FcR Kette essentiell für beide Prozesse ist, sind LAT und PLC2 nur für das Abspalten wichtig. Antikörper induzierte Erhöhung der Blutungszeit und Thrombozytopenie sind abwesend in LAT-defizienten Mäuse, was zeigt, dass möglicherweise die GPVI Runterregulierung von den assoziierten Nebenwirkungen zu trennen ist. Da die GPVI Runterregulierung in LAT und –PLC2 defizienten Mäusen weiterhin stattfindet, zeigt dies einen neuen GPVI Signalweg, der bisher noch nicht beschrieben wurde.

In der Embryonalentwicklung von Insekten, Nematoden und Vertebraten reguliert der delta-notch-Signalweg vielfältige Zelldifferenzierungsvorgänge wie die laterale Inhibierung, Zelllinien-Entscheidungen und die Bildung von Grenzen. In Vertebraten aktivieren die transmembranen Liganden delta-like 1, 3 oder 4, bzw. jagged 1 oder 2 einen notch-Rezeptor (notch1, 2, 3 oder 4). Dessen intrazelluläre Domäne bildet im Zellkern mit rbp-j und weiteren Proteinen einen Aktivator-Komplex, der an den Promotor der notch-Zielgene bindet. Neben drei hes-Genen zählen dazu die Gene hey1, hey2 und heyL, die alle eng verwandt sind mit hairy und den Genen des Enhancer of Split-Komplexes (E(spl)) bei Drosophila melanogaster. Die hey-Gene sind in der Maus unter anderem während der Entwicklung von Niere, Arterien, Herz, Nervensystem, Thymus und Somiten spezifisch exprimiert. Um die Bedeutung des heyL-Gens für die Bildung dieser Organe zu untersuchen, wurden heyL-Knockoutmäuse generiert, bei denen jedoch keine morphologischen Veränderungen oder Erkrankungen erkennbar waren. Die durch entsprechende Verpaarung erhaltenen heyL/1-Doppelknockoutmäuse wiesen in der F9-Rückkreuzungsgeneration einen Ventrikel-Septum-Defekt (VSD) auf und verstarben größtenteils ein bis zwei Tage nach der Geburt. Ähnliche Krankheitssymptome zeigen die mit anderen Komponenten des delta-notch-Signalweges in Verbindung gebrachten Erbkrankheiten „Fallot´sche Tetralogie“ (ToF) und das Alagille Syndrom (AGS). Vergleichbare VSDs treten auch bei hey2-Knockoutmäusen auf. Es stellte sich daher die Frage, welche Zielgene des hey2-Transkriptionsfaktors an der Herzbildung beteiligt sind. Literaturbekannte HEY2-Zielgen-Kandidaten sind beim Menschen Follistatin (FST), Keratin 2-7 (KRT2-7) und das epitheliale V-ähnliche Antigen (EVA1). Durch antisense RNA in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutmausschnitten konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster entdeckt werden. Eigene Microarray-Analysen mit RNA aus hey2-überexprimierenden, humanen 293-Zelllinien identifizierten das Neurofilamentgen NEFL als HEY2-Zielgenkandidat. Bei der in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutmäusen mit einer Probe für das nefl-Gen konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster erkannt werden, so dass nefl in vivo vermutlich komplexer reguliert wird. Neben den Ventrikel-Septum-Defekten zeigen die heyL/1-Doppelknockoutmäuse einen zweiten abnormalen Phänotyp. Die embryonalen Thymi dieser Tiere sind kleiner als die der wildtypischen Mäuse. Die detaillierte Analyse der Thymozyten-Subpopulationen erbrachte, dass die niedrigere Zellzahl vor allem zu Lasten der doppelt positiven Thymozyten geht. Grund hierfür könnte eine teilweise Blockierung der Entwicklung zwischen der zweiten und dritten Phase des zuvor durchlaufenen doppelt negativen Stadiums sein, denn die absolute Zahl der DN3-Thymozyten ist um über 90 Prozent verringert. Die Blockierung des delta-notch-Signalweges durch Zugabe eines -Sekretase-Inhibitors führte ebenfalls zu einer Verringerung der DN3-Zellen in der gleichen Größenordnung, jedoch im Gegensatz zu den heyL/hey1-Doppelknockout-Thymi gleichzeitig zur Verdreifachung der absoluten Zahl der DN2-Zellen. Diese Unterschiede unterstreichen die Bedeutung weiterer notch-Zielgene wie beispielsweise hes1. Ob die beobachteten Veränderungen in der Entwicklung der Thymozyten Folgen für die Immunabwehr haben, wurde im Rahmen von Immunisierungen mit Trinitrophenyl (TNP)-Ovalbumin untersucht. Hierbei zeigte sich eine Erhöhung der IgG2a und IgG2b Werte und eine Reduktion der IgG1 Produktion bei den heyL/hey1-Doppelknockoutmäusen, während die IgM-Werte zwischen den verschiedenen Mausgenotypen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen. Die IgG-Veränderungen deuten darauf hin, dass die T-Zellen vermehrt in die TH1-Zelldifferenzierungsrichtung getrieben werden und die TH2-Cytokinproduktion verringert ist. Bei den hey-Knockoutmäusen waren aufgrund des Expressionsprofils der hey-Gene nicht nur Veränderungen in der Herzentwicklung und im Thymus erwartet worden, sondern auch in der Somitogenese. Dies gilt im Besonderen für die bereits zuvor generierten hey2-Knockoutmäuse, denn hey2 ist im präsomitischen Mesoderm zyklisch exprimiert. Im Gegensatz zu den Knockoutmäusen des verwandten und ebenfalls zyklisch exprimierten hes1-Gens, litten jedoch weder die heyL/hey1-Doppelknockoutmäuse, noch die hey2-Knockoutmäuse an Defekten in der Somitogenese. Während die Bedeutung der Genexpression der hey-Gene in der Somitogenese weiterhin unklar sind, konnten Erkenntnisse über die Funktionen von heyL und hey1 in der Herzentwicklung und bei der Ausreifung der Thymozyten gewonnen werden. Die Identifizierung von hey-Zielgenen in diesen Entwicklungsprozessen kann das Verständnis des delta-notch-Signalweges erweitern, die Ursachen von Erbkrankheiten aufklären helfen und möglicherweise Therapiestrategien aufzeigen. / The delta-notch signaling pathway regulates numerous cell differentiation processes like lateral inhibition, cell lineage decisions and the formation of borders in the embryonic development of insects, nematodes and vertebrates. In vertebrates the transmembrane ligands delta-like 1, 3 or 4 and jagged 1 or 2 activate a notch-receptor (notch 1 – 4). In the nucleus its intracellular domain forms an activator-complex together with rbp-j and other proteins that binds to the promoter of notch target genes. Besides three hes genes these include the genes hey1, hey2 and heyL, all of which are closely related to hairy and Enhancer of Split-complex (E(spl)) genes of Drosophila melanogaster. In the mouse hey-genes are specifically expressed during the development of the kidney, arteries, heart, nervous system, thymus, and somites. In order to elucidate the significance of the heyL gene for the formation of these organs, heyL knockout mice were generated. However, these mice did not exhibited morphological changes or diseases. HeyL/1 double knockout mice, that were obtained by appropriate mating, showed ventricle septum defects (VSD) in the F9 backcross generation and most of them died within one or two days after birth. Similar symptoms are seen in the human congenital diseases Tetralogy of Fallot (ToF) and the Alagille Syndrome (AGS), which are associated with other components of the delta-notch signaling pathway. Similar ventricle septum defects also occur in hey2 knockout mice. This raises the question, which of the target genes of the hey2 transcription factor are involved in the formation of the heart? Published human HEY2-candidate target genes are Follistatin (FST), Keratin 7 (KRT2-7) and the Epithelial V-like Antigen (EVA1). Yet, antisense RNA in situ hybridisation of wildtype and hey2 knockout mouse sections did not reveal any differential expression patterns. Own micro array analysis with RNA from hey2 overexpressing human 293 cell lines identified the neurofilament gene NEFL as a HEY2-target gene candidate. However, in situ hybridisation of wildtype and heyL/1-double knockout mice with a probe for the nefl gene did not reveal differential expression patterns. Thus, the regulation of the nefl expression in vivo is presumably more complex. In addition to the VSD, heyL/1 double knockout mice show a second abnormal phenotype. The embryonic thymus of these animals was smaller than that of the wildtype mice. Detailed analysis of the thymocyte subpopulations revealed, that the low cell number is mainly due to the douple positive thymocytes. The reason for this could be a partial block of the development between the second and third phase of the previous double negative stage since the absolute number of DN3 thymocytes is reduced by over 90 percent. Blocking of the delta-notch signaling pathway by the addition of a -secretase inhibitor also led to a reduction of the DN3 cells to the same extent. Yet in contrast to the heyL/hey1 double knockout thymi, a tripling of the absolute number of DN2 cells is observed. These differences underscore the importance of other notch target genes like for example hes1. To investigate if the observed changes in the development of the thymocytes have any consequences for the immune defence, immunisations with trinitrophenyl (TNP)-ovalbumine were performed. In these experiments an elevation of the IgG2a and IgG2b values and a reduction of the IgG1 production in heyL/hey1 double knockout mice was detected. IgM values did not vary significantly between the different mouse genotypes. The IgG changes indicate that the T-cells are increasingly driven towards the TH1 cell differentiation and that TH2-cytokine production is reduced. Based on the expression profiles of hey genes, developmental changes were expected for hey-knockout mice not only during development of the heart and thymus, but also during somitogenesis. This particularly applies to the previously generated hey2 knockout mice because hey2 is expressed in the presomitic mesoderm in an oscillating manner. Yet, in contrast to the knockout mice of the related and also cyclically expressed hes1 gene, neither the heyL/hey1 double knockout mice nor the hey2 knockout mice suffered from defects during somitogenesis. While the relevance of hey gene expression during somitogenesis remains unclear, new insights in the function of heyL and hey1 during heart development and during the maturation of thymocytes were gained. The indentification of hey target genes in these developmental processes can enhance the understanding of the delta-notch signaling pathway. It may also help to explain the causes of inherited diseases and potentially point out therapeutic strategies.

Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte. / Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice.

Human cytomegalovirus (HCMV) infection causes clinical symptoms in immunocompromised individuals such as transplantant recipients and AIDS patients. The virus is also responsible for severe complications in unborn children and young infants. The species specificity of HCMV prevents the direct study of mechanisms controlling the infection in animal models. Instead, the murine cytomegalovirus (MCMV) is used as a model system. Human and murine CMVs have large double-stranded DNA genomes, encoding nearly 170 genes. About 30% of the genes are committed to essential tasks of the virus. The remaining genes are involved in virus pathogenesis or host interaction and are dispensable for virus replication. The CMV genes are classified in gene families, based on sequence homology. In the present work, the function of two genes of the US22 gene family was analyzed. The MCMV genes m142 and m143 are the only members of this family that are essential for virus replication. These genes also differ from the remaining ten US22 gene family members in that they lack 1 of 4 conserved sequence motifs that are characteristic of this family. The same conserved motif is missing in the HCMV US22 family members TRS1 and IRS1, suggesting a possible functional homology. To demonstrate an essential role of m142 and m143, the genes were deleted from the MCMV genome, and the mutants were reconstituted on complementing cells. Infection of non-complementing cells with the deletion mutants did not result in virus replication. Virus growth was rescued by reinsertion of the corresponding genes. Cells infected with the viral deletion mutants synthesized reduced amounts of viral DNA, and viral late genes were not expressed. However, RNA analyses showed that late transcripts were present, excluding a role of m142 and m143 in regulation of gene transcription. Metabolic labelling experiments showed that total protein synthesis at late times postinfection was impaired in cells infected with deletion mutants. Moreover, the dsRNA-dependent protein kinase R (PKR) and its target protein, the translation initiation factor 2α (eIF2α) were phosphorylated in these cells. This suggested that the m142 and m143 are required for blocking the PKR-mediated shut-down of protein synthesis. Expression of the HCMV gene TRS1, a known inhibitor of PKR activation, rescued the replication of the deletion mutants, supporting the observation that m142 and m143 are required to inhibit this innate immune response of the host cell. / Die Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) kann bei immunsupprimierten Personen wie Transplantatempfängern oder AIDS Patienten, aber auch bei Neugeborenen klinische Symptome hervorrufen. Die Spezies-Spezifität des humanen CMV lässt keine Untersuchung viraler Mechanismen im Tiermodell zu, jedoch steht mit dem murinen CMV (MCMV) ein geeignetes und verbreitetes Modell zur Verfügung. Beide CMVs besitzen große doppelsträngige DNA Genome, die ca. 170 Gene beinhalten. Hiervon sind ca. 30% essentiell für die virale Replikation. Die anderen Gene sind für die Pathogenesse und Interaktion mit den Wirtszellen von Bedeutung. Die Gene des CMV werden auf Grund von Sequenzhomologien in Familien gruppiert. In der vorliegenden Arbeit wird die Funktion der Gene m142 und m143 des MCMV analysiert. Beide Gene sind die einzigen für die Virusreplikation essentiellen Mitglieder der US22 Genfamilie. Darüber hinaus unterscheiden sie sich von den anderen 10 US22 Mitgliedern darin, daß ihnen eine von vier konservierten Sequenzmotiven fehlt. Dieses fehlende Motiv kommt auch bei den HCMV US22 Mitgliedern TRS1 und IRS1 nicht vor, was einen möglichen Hinweis auf eine funktionelle Homologie gibt. Um die essentielle Rolle der m142 und m143 Gene zu belegen, wurden letztere aus dem MCMV Genom entfernt und die Virusmutanten auf komplimentierenden Zellen rekonstituiert. Die Infektion nicht komplimentierender Zellen mit den Virusmutanten erzeugte keine Infektion, konnte jedoch mit der Reinsertion der Gene wieder hergestellt werden. Infizierte Zellen, die mit den Virusmutanten infiziert wurden, produzierten geringere Mengen viraler DNA. Obwohl die Expression später viraler Gene nicht stattfand, konnten späte virale Transkripte nachgewiesen und somit eine Rolle von m142 und m143 bei der Regulation der viralen Transkription ausgeschlossen werden. In Experimenten, in denen Zellen metabolisch markiert wurden, wurde gezeigt, daß die Gesamtproteinsynthese zu späten Zeitpunkten nach Infektion mit den Virusmutanten gehemmt war. Des weiteren wurde eine Phosphorylierung der dsRNA-abhängigen Proteinkinase R (PKR) sowie des Zielproteins, des Translations Initiationsfaktors 2α (eIF2α), nachgewiesen. Dies läßt vermuten, daß m142 und m143 die PKR-vermittelte Stillegung der Proteinsynthese verhindern. Durch Expression des HCMV TRS1 Gens, einem bekannten Inhibitor der PKR-Aktivierung, konnte die Replikation der Virusmutanten wieder hergestellt werden. Dies unterstützt die Ansicht, daß m142 und m143 für die Inhibition der Angeborenen Immunanwort der infizierten Wirtszelle erforderlich sind.

Made available in DSpace on 2019-03-29T23:43:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-10-26 / Violence and abuse against children and adolescents emerge as a problem that permeates all levels of society. Given the importance to the subject, drew up the research that is needed is about how health professionals in the conduct of cases in family health team defendants. Thus, the study aimed to analyze the process of notification of maltreatment in children and adolescents from the practice of doctors, nurses and dentists of the Family Health Strategy (FHS) in five health regions of Ceará, and to identify sociodemographic characteristics of vocational training; verify the correlation between the variables of professional instrumentation with the act of notify and pointing the difficult and easy notification of maltreatment. We used a cross-sectional study with a sample of 218 professionals of 26 counties belonging to the Health Regions of Canindé, Tauá, Quixadá, Icó and Iguatu, distributed as follow: medical (32), nurses (156) and dentists (30). A structured questionnaire on social demographic variables, vocational training, work time at FHS, professional instrumentation was applied from February to July 2012. For analysis, we used the Pearson correlation test (p < 0.05). Findings revealed the predominance of young people (57.3 %), female (72 %) with at least five years after graduation (57.3%) and at the same time working at FHS (62.4 %) and residence or graduate degree in public health (41.3 %). As for the instrumentation, 75.7 % said they had never participated in training to deal with violence, 80.3 % knew the ECA, 54.1% plug notification, but 16.1% said they did not know of its existence in unity health. They claimed not to read about the thematic 65.6% and 56.9 % reported not discuss the matter in their work environment. However, 92.2 % expressed interest in participating in trainings on the subject and 89.4 % think the advantage institute notification form the unit. Of the respondents, 36.2 % met with abuse in their practice and of these, 51.9% did not report the case. The statistical significance between the independent variables and the fact notify maltreatment, gave up the profession (p = 0.016), participate in training (p = 0.013), knowing the ECA (p = 0.038), the plug of notification, have the same in unit (p < 0.001), trust protection agencies (p = 0.07) and know where to refer cases (p = 0.002). The study concluded that the process of notification of maltreatment in children and adolescents, from the professionals' practice FHS is under the responsibility of a young professional with less than five years of graduation / service time, without instrumentation on theme, however wish appropriating this knowledge and recognize the primary care setting as conducive to this demand (advantage). Vocational training and differential knowledge about the subject and its ramifications are variables that must be considered in planning and operation of training courses on violence and its impact on individual health and collective social harmony. / A violência e maus-tratos praticados contra crianças e adolescentes despontam como um agravo que perpassa em todas as camadas sociais. Dada à importância ao assunto, elaborou-se essa pesquisa que versa sobre como se comportam os profissionais de saúde na condução dos casos demandados na atenção básica. Desta forma, o estudo teve como objetivo analisar o processo de notificação de maus-tratos em crianças e adolescentes a partir da prática de médicos, enfermeiros e cirurgiões-dentistas da Estratégia Saúde da Família (ESF), em cinco Regiões de Saúde do Ceará, bem como identificar as características sociodemográficas de formação profissional; verificar a correlação entre as variáveis de instrumentalização profissional com o ato de notificar e apontar as dificuldades e facilidades da notificação de maus-tratos. Utilizou-se um estudo de corte transversal, com uma amostra de 218 profissionais da ESF de 26 municípios pertencentes às Regiões de Saúde de Canindé, Tauá, Quixadá, Icó e Iguatu, distribuídos da seguinte forma: médicos (32), enfermeiros (156) e cirurgiões-dentistas (30). Um questionário estruturado com variáveis sociodemográficas, formação profissional, tempo de trabalho na ESF, instrumentalização profissional foi aplicado no período de fevereiro a julho de 2012. Para análise, empregou-se o teste de correlação de Pearson (p<0,05). Os achados revelaram a predominância de adultos jovens (57,3%), sexo feminino (72%) com menos cinco anos de formado (57,3%) e com o mesmo tempo de trabalho na ESF (62,4%) e com residência ou pós-graduação em saúde coletiva (41,3%). Quanto à instrumentalização, 75,7% afirmaram nunca terem participado de treinamentos para enfrentamento da violência, 80,3 % conheciam o ECA, 54,1% a ficha de notificação, mas 16,1% disseram não saber da existência na unidade de saúde. Alegaram não ler sobre a temática 65,6% e 56,9% relataram não discutir o assunto em seu ambiente de trabalho. No entanto, 92,2% manifestaram interesse em participar de treinamentos sobre o tema e 89,4% acham vantagem instituir a ficha de notificação na unidade. Dos respondentes, 36,2% depararam com maus-tratos em sua prática e destes, 51,9% não notificaram o caso. A significância estatística entre as variáveis independentes e o fato de notificar maus-tratos, deu-se com a profissão (p=0,016), participar de treinamento (p=0,013), conhecer o ECA (p=0,038), a ficha de notificação, dispô-la na unidade (p<0,001), confiar nos órgãos de proteção (p=0,07) e saber para onde encaminhar os casos (p=0,002). O estudo concluiu que o processo de notificação de maus-tratos em crianças e adolescentes, a partir da prática dos profissionais da ESF está sob a responsabilidade de um profissional jovem, com menos de cinco anos de formado/tempo de serviço, sem instrumentalização sobre o tema, contudo ensejam apropriar-se desse conhecimento e reconhecem a atenção básica como cenário propício para esta demanda (vantagem). A formação profissional e o diferencial no conhecimento sobre o tema e os seus desdobramentos são variáveis que devem ser consideradas no planejamento e operacionalização dos cursos de capacitação sobre violências e suas repercussões na saúde individual, coletiva e harmonia social.

In cultured motoneurons of a mouse model for the motoneuron disease spinal muscular atrophy (SMA), reduced levels of the protein SMN (survival of motoneurons) cause defects in axonal growth. This correlates with reduced β-actin mRNA and protein in growth cones, indicating that anterograde transport and local translation of β-actin mRNA are crucial for motoneuron function. However, direct evidence that indeed local translation is a physiological phenomenon in growth cones of motoneurons was missing. Here, a lentiviral GFP-based reporter construct was established to monitor local protein synthesis of β-actin mRNA. Time-lapse imaging of fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in living motoneurons revealed that β-actin is locally translated in the growth cones of embryonic motoneurons. Interestingly, local translation of the β-actin reporter construct was differentially regulated by different laminin isoforms, indicating that laminins provide extracellular cues for the regulation of local translation in growth cones. Notably, local translation of β-actin mRNA was deregulated when motoneurons of a mouse model for type I SMA (Smn-/-; SMN2) were analyzed. In situ hybridization revealed reduced levels of β-actin mRNA in the axons of Smn-/-; SMN2 motoneurons. The distribution of the β-actin mRNA was not modified by different laminin isoforms as revealed by in situ hybridization against the mRNA of the eGFP encoding element of the β-actin reporter. In case of the mRNA of α-actin and γ-actin isoforms, the endogenous mRNA did not localize to the axons and the localization pattern was not affected by the SMN levels expressed in the cell. Taken together our findings suggest that regulation of local translation of β-actin in growth cones of motoneurons critically depends on laminin signaling and the amount of SMN protein. Embryonic stem cell (ESC)-derived motoneurons are an excellent in vitro system to sort out biochemical and cellular pathways which are defective in neurodegenerative diseases like SMA. Here, a protocol for the differentiation and antibody-mediated enrichment of ESC-derived motoneurons is presented, which was optimized during the course of this study. Notably, this study contributes the production and purification of highly active recombinant sonic hedgehog (Shh), which was needed for the efficient differentiation of mouse ESCs to motoneurons. ESC-derived motoneurons will now offer high amounts of cellular material to allow the biochemical identification of disease-relevant molecular components involved in regulated local protein synthesis in axons and growth cones of motoneurons. / In kultivierten Motoneuronen eines Maus-Models für die Motoneuronen-Erkrankung Spinale Muskelatrophie (SMA) verursachen verminderte Mengen des Proteins SMN (survival of motoneurons) Schäden im axonalen Wachstum. Dies korreliert mit einer verminderten Menge an β-Aktin kodierender mRNA und β-Aktin Protein. Dies impliziert, dass anterograder Transport und lokale Translation von β-Aktin mRNA für die Motoneuronfunktion notwendig ist. Bislang gab es jedoch keinen direkten Nachweiß funktioneller lokaler Translation in Wachstumskegeln von Motoneuronen. In dieser Arbeit wurde ein lentivirales GFP-basierendes Reporterkonstrukt etabliert, welches lokale Proteinsynthese von β-Aktin mRNA nachweißt. Zeitraffermikroskopie von GFP-vermittelter Fluoerszenzregeneration nach Fotobleichung (fluorescence recovery after photobleaching; FRAP) in lebenden Motoneuronen zeigte, dass β-Aktin in Wachstumskegeln embryonaler Motoneuronen lokal translatiert wird. Interessanterweise wurde die lokale Translation des β-Aktin Reporterkonstrukts differentiell durch verschiedene Laminin-Isoformen reguliert. Dies gibt einen Hinweis, dass Laminin als extrazelluläres Signalmolekül die Regulation der lokalen Translation in Wachstumskegeln reguliert. Die lokale Translation von β-Aktin mRNA war dereguliert wenn Motoneurone eines Mausmodels für die Typ I SMA (Smn-/-;SMN2) analysiert wurden. In situ Hybridisierung bestätigte eine Reduktion von β-Aktin mRNA in den Axonen von Smn-/-;SMN2 Motoneuronen. Die Verteilung der β-Aktin mRNA wurde von verschiedenen Laminin-Isoformen nicht beeinflusst, wie durch in situ Hybridisierung gegen eGFP kodierende Elemente des β-Aktin Reporters bestätigt werden konnte. Im Fall der mRNA für α-Aktin und γ-Aktin Isoformen wurde keine axonale Lokalisierung der endogenen mRNAs festgestellt und das Lokalisierungsmuster dieser mRNAs war durch reduzierte zelluläre SMN Mengen nicht beeinflusst. Zusammenfassend deuten diese Befunde darauf hin, dass die lokale Translation von β-Aktin in Wachstumskegeln von Motoneuronen von Laminin-Signalgebung und von der Menge an SMN Protein abhängt. Motoneurone aus embryonalen Stammzellen sind ein etabliertes in vitro System um biochemische und zelluläre Signalwege zu identifizieren, die in neurodegenerativen Erkrankungen wie SMA betroffen sind. Hier wird ein Protokoll zur Differenzierung und Antikörper-gestützten Anreicherung von Motoneuron aus embryonalen Stammzellen präsentiert, welches im Rahmen dieser Arbeit optimiert wurde. Im Besonderen wird die Herstellung und Reinigung von hochaktivem Sonic Hedgehog (Shh) vorgestellt, welches für die effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus notwendig war. Motoneurone aus embryonalen Stammzellen werden in zukünftigen Studien nun große Mengen an zellulärem Material liefern, und somit auf biochemischer Ebene die Identifizierung von krankheitsrelevanten molekularen Komponenten ermöglichen, die in der Regulation der lokalen Proteinsynthese in Axonen und Wachstumskegeln von Motoneuronen involviert sind.