O uso de moluscos gastrópodes para estudos neurobiológicos é vantajoso porque seu sistema nervoso e comportamentos são intermediários em complexidade quando comparados a outros animais. Os padrões de atividade derivados do sistema nervoso central (SNC) são modulados por informações periféricas provenientes de vários quimio e mecanorreceptores, os quais desempenham funções importantes na manutenção da homeostase interna. Assim, juntos, elementos centrais e periféricos permitem ao animal modular seu comportamento respiratório de acordo com suas demandas metabólicas. O objetivo deste trabalho originou-se da necessidade da compreensão da atividade respiratória do caracol pulmonado terrestre Megalobulimus abbreviatus, da identificação dos neurônios do sistema nervoso central envolvidos no seu controle, bem como da organização da inervação de uma estrutura-chave envolvida no comportamento respiratório deste animal, o pneumóstoma. Realizou-se a identificação dos neurônios do SNC que controlam o pneumóstoma através de marcação retrógrada pelo nervo parietal posterior direito com cloreto de cobalto e biocitina; a descrição da morfologia e da histologia da região do pneumóstoma, assim como a análise da presença de monoaminas (método do ácido glioxílico), atividade acetilcolinesterásica (AChE, técnica de Karnovsky & Roots) e de imunorreatividade a FMRF-amida (imunoistoquímica) nesta região. Também foi realizada a investigação sobre uma provável relação entre o sistema dopaminérgico, serotoninérgico e peptidérgico (FMRF-amida) com os neurônios identificados por marcação retrógrada nos gânglios nervosos centrais, através da comparação entre os neurônios retrogradamente marcados com neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase (TH), serotonina (5-HT) e FMRF-amida. Neurônios retrogradamente marcados foram encontrados nos gânglios pedais, pleural direito, parietal direito e visceral. Encontrou-se na superfície do tegumento do pneumóstoma um epitélio constituído de uma única camada de células cilíndricas, com microvilosidades ou cílios como terminação apical, envolvido por uma camada muscular bem desenvolvida. Foi possível verificar que a organização da inervação na região do pneumóstoma está constituída de uma rede neural para suprir a camada muscular e ramos neurais mais finos que estão mais densamente distribuídos em um plexo na camada epitelial e subepitelial adjacente, onde corpos celulares neuronais foram identificados (catecolaminérgicos ou com atividade AChE). A análise do padrão de inervação do pneumóstoma, juntamente com os dados da comparação entre neurônios retrogradamente marcados e imunorreativos no SNC, permitiu concluir-se que o neuropeptídeo FMRF-amida parece ter uma grande importância na regulação motora da região do pneumóstoma, assim como a 5-HT, que provavelmente possui uma função motora ou modulatória nesta região, enquanto que a participação da dopamina no controle respiratório deve ser principalmente sensorial, responsável pelas informações provindas do tegumento do pneumóstoma.

O óxido nítrico (NO) é um gás produzido através da ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS), e age como um neurotransmissor no sistema nervoso de moluscos gastrópodos adultos. Não há informações, até o momento, da presença de neurônios contendo NOS em caracóis da espécie Megalobulimus abbreviatus, tanto jovens quanto adultos. Consequentemente, foi utilizada a técnica histoquímica da NADPH-d para mapear a distribuição nitrérgica no sistema nervoso central (SNC) de animais adultos e jovens. A reação foi observada em neurônios e fibras em todos os gânglios (pedais, pleural direito, pleural esquerdo, parietal direito, parietal esquerdo, visceral, cerebral e bucal) do SNC de caracóis jovens e adultos, e foi particularmente forte nos gânglios pedais e cerebral, onde neurônios positivos foram encontrados agrupados simetricamente nos gânglios pareados. Estes resultados fornecem evidência da existência de um sistema nitrérgico em M. abbreviatus jovens e adultos, onde a NOS foi encontrada em regiões específicas do SNC. Para estabelecer um possível envolvimento do NO no circuito nociceptivo neste caracol, usando histoquímica para NADPH-d e análise semiquantitativa de densidade óptica, foram caracterizados os neurônios produtores de NO nos gânglios pedais de M. abbreviatus jovens e adultos, sujeitos a estímulo térmico aversivo. Os animais foram sacrificados em diferentes tempos (3, 6, 12 e 24h) após o estímulo. A atividade enzimática foi detectada em diferentes grupos celulares e processos neuronais. Em todas as sub-regiões dos gânglios pedais estudadas, a densidade óptica de neurônios positivos (p<0,05) e da área neuropilar 1 (p<0,01) foi significativamente diferente em animais tratados quando comparados com os controles. O aumento na atividade nitrérgica induzida por estímulo nociceptivo sugere o envolvimento do NO no circuito nociceptivo de M. abbreviatus, o que foi verificado através do estudo da ação do NO na resposta de latência do caracol M. abbreviatus após estímulo térmico e químico, e na atinocicepção mediada por opióides. Doses do inibidor da NOS NG-nitro-L-arginina-metil ester, L-NAME (1 μg/kg, 10 μg/kg e 25 μg/kg) e do agente liberador de NO S-nitro-Nacetilpenicilamida, SNP (1 μg/kg, 10 μg/kg e 25 μg/kg) foram administradas para determinar o efeito do NO nas respostas de latência. Com a dose mais alta de L-NAME (25 μg/kg), a resposta de latência foi significativamente maior (p<0,001) e com a dose mais alta de SNP (25 μg/kg) a resposta de latência foi significativamente menor (p<0,001) quando comparadas com as outras doses, e com os grupos controle e salina. A dose de 25 μg/kg de L-NAME produziu um efeito analgésico similar ao da morfina. Também foi observado que a antinocicepção induzida por morfina foi significativamente potencializada por L-NAME (p<0,05) e reduzida, mas não bloqueada, por SNP (p<0,05) em animais submetidos aos estímulos térmico e químico, demonstrando que o NO apresenta um efeito pró nociceptivo neste modelo animal. / Nitric oxide (NO) is a gas produced through the action of the enzyme nitric oxide synthase (NOS) and acts as a neurotransmitter in the nervous system of adult gastropod molluscs. There appears to be no information on the presence of NOS-containing neurons in adult and young Megalobulimus abbreviatus. Accordingly, we used NADPH-d histochemistry to map the nitrergic distribution in the central nervous systems (CNS) of young and adult animals. The reaction was observed in neurons and fibers in all CNS ganglia of both young and adult snails (pedal, right pleural, left pleural, right parietal, left parietal, visceral, cerebral and buccal), and was particularly strong in the pedal and cerebral ganglia where positive neurons were found clustered symmetrically in the paired ganglia. These results provide evidence for the existence of a nitrergic signaling system in young and adult M. abbreviatus where NOS was found in specific regions of the CNS. In order to establish a probably involvement of NO in the nociceptive circuit in M. abbreviatus, using NADPH-d histochemistry and semi-quantitative optical densitometry, were characterized the NO-producing neurons in the pedal ganglia of young and adult Megalobulimus abbreviatus, subjected to aversive thermal stimulus. The animals were sacrificed at different times (3, 6, 12 and 24h) following stimulus. The enzymatic activity was detected in different cellular subsets and neuronal processes. In all the studied pedal ganglia subregions, the optical density of positive neurons (p<0.05) and neuropilar area 1 (p<0.01) was significantly different in treated animals when compared to controls. The increase in nitrergic activity induced by nociceptive stimulus suggests the involvement of NO in the nociceptive circuit of M. abbreviatus, which was verified through the study of the action of NO in the latency response of the snail M. abbreviatus after thermal and chemical stimuli, and in the antinociception mediated by opioid. Doses of the NO synthase inhibitor NG-nitro-L-argininemethyl ester, L-NAME (1 μg/kg, 10 μg/kg and 25 μg/kg) and the NO-releasing agent S-nitro-Nacetylpenicillamide, SNP (1 μg/kg, 10 μg/kg and 25 μg/kg) were administered to determine the effect of NO on latency responses. With the highest L-NAME dose (25 μg/kg), the response latency was significantly longer (p<0.001) and with the highest SNP dose (25 μg/kg) the response latency was significantly shorter (p<0.001) when compared with the other doses, control and saline groups. The 25 μg/kg dose of L-NAME produced an analgesic effect similar to that of morphine. We also observed that morphine-induced antinociception was significantly potentiated by L-NAME (p<0.05) and reduced, but not blocked, by SNP (p<0.05) in animals submitted to thermal and chemical stimuli, showing that NO presents a pronociceptive effect in this animal model.

Utilizando as técnicas de imunoistoquímica e densitometria óptica, foi investigada a localização e a expressão da proteína c-Fos no SNC do caracol Megalobulimus abbreviatus. Neurônios imunorreativos foram encontrados nos gânglios cerebrais, pedais, parietal direito e visceral de caracóis submetidos ao estímulo térmico aversivo (50oC), e sacrificados em diferentes tempos (3, 6, 12, 18 e 24 h) após a estimulação. A análise da imunorreatividade à c-Fos através do método de medida da densidade óptica (DO) revelou uma diferença significativa no sentido de apresentar uma maior expressão (p<0,05) na área do lobo pedal do pós-cérebro do gânglio cerebral em relação às outras regiões analisadas no mesmo gânglio (mesocérebro, pró-cérebro e lobo pleural do pós-cérebro). Além disso, também houve expressão significativamente maior (p<0,05) quando comparada a densitometria da região do mesocérebro em relação ao lobo pleural do pós-cérebro nos grupos controle, 3h e 18h. O lobo pleural do pós-cérebro apresentou uma expressão significativamente menor (p<0,05) na imunorreatividade da proteína c-Fos quando comparado ao pró-cérebro em animais sacrificados 12h e 24h após e estímulo aversivo. Em relação ao grupo controle, a DO da proteína c-Fos não variou nos diferentes tempos de sacrifício quando comparada a mesma região do gânglio (cerebral, pedal, parietal direito ou visceral) ao longo do tempo na maioria das regiões. A única diferença estatisticamente significativa (p<0,05) foi encontrada no mesocérebro do gânglio de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, mostrando uma diminuição da imunorreatividade. Nos animais tratados com salina (1ml) ou morfina (20mg/kg) 15 min antes do estímulo térmico aversivo, os mesmos grupos neuronais nos gânglios do SNC de M. abbreviatus mostraram imunomarcação à proteína c-Fos. Em relação ao grupo controle, observou-se uma expressão significativamente menor (p<0,01) na DO da imunorreatividade da proteína c-Fos nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos animais sacrificados 3 h e 6 h após o estímulo térmico aversivo. No momento em que a comparação foi feita entre os grupos salina e morfina de animais sacrificados ao mesmo tempo, na grande maioria dos grupos observou-se uma diminuição na imunorreatividade da proteína c-Fos. Esta diferença, porém, mostrou-se significativa (p<0,01) no mesocérebro de animais do grupo 3h, no lobo pedal do pós cérebro de animais dos grupos 3 h, 6 h e 18 h, nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos grupos 6 h e 12 h, nos neurônios mediais do gânglio pedal do grupo 3 h, nos neurônios posteriores do gânglio pedal do grupo 6 h, nos neurônios da região anterior do gânglio parietal direito no grupo 12 h e nos neurônios do gânglio visceral no grupo experimental 12 h. A diferença na DO da proteína c-Fos apresentou uma diminuição extremamente significativa (p<0,001) nos neurônios mediais do gânglio pedal de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, nos neurônios posteriores do gânglio pedal dos animais sacrificados 12 h após o estímulo e nos neurônios do gânglio visceral dos animais do grupo experimental 6 h. A partir destes dados e da correlação com estudos realizados em M. abbreviatus para detecção de mediadores químicos envolvidos na nocicepção, podemos concluir que as áreas imunorreativas que apresentaram estas variações na densidade óptica da imunorreatividade à proteína c-Fos em diferentes tempos de sacrifício e tratamento com morfina estão envolvidas no processo nociceptivo neste caracol.

O corpo dorsal (CD) é uma glândula endócrina presente junto aos gânglios cerebrais de todos os moluscos pulmonados (sinapomorfia) e, em Megalobulimus abbreviatus, o CD estende-se até o complexo de gânglios subesofageais. Tem sido atribuído o papel de produtor de hormônio gonadotrópico feminino para os pulmonados mais estudados (Helix pomatia, Helix aspersa e Lymnaea stagnalis). Em trabalho anterior foram descritos o aspecto histológico de glândula esteroidogênica e as variações citológicas sazonais do CD de Megalobulimus; o período de maior atividade sintética glandular coincide com o período de maior atividade reprodutiva. Um dos objetivos desse trabalho é identificar ultra-estruturalmente a presença e o tipo de terminações nervosas junto às células do CD, nas diferentes porções desta glândula, parte supraesofageal, junto aos gânglios cerebrais (GC) e subesofageal, junto aos gânglios pleurais (PL). Nesse estudo também pretende-se investigar a imunorreatividade ao neuropeptídeo FMRFamida no CD, supondo que este peptídeo, existente em grande quantidade em numerosos neurônios cerebrais, possa estar envolvido no controle inibitório destes gânglios sobre a atividade sintética glandular. Para o trabalho, diferentes regiões do CD (Fig. 2) foram fixadas em diferentes meses (5 animais/estação) em paraformaldeído 2% e glutaraldeído 1%, diluídos em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 (para imunoistoquímica, a fixação foi em paraformaldeído 4% e glutaraldeído 0,1%); pós-fixados em OsO4 1% diluído em TF; desidratado em álcool e acetona e incluído em resina Durcupan. As secções ultrafinas foram analisadas no Centro de Microscopia Eletrônica da UFRGS (microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM1200ExII). Para a imunoistoquímica, antes da pós-fixação com OsO4, os cortes (vibrátomo, 100 µm) foram processados para imunoistoquímica ao anticorpo anti-FMRFamida (Chemicon, 1:900) pelo procedimento peroxidase-anti-peroxidase. O CD se estende dos GC aos PL, acompanhando os conetivos cérebro-pleurais. Tanto na região subesofageal como supraesofageal, as células do CD de Megalobulimus abbreviatus estão inervadas por terminações axonais que fazem estreito contato com as células secretoras, semelhantes a sinapses “en passant”, contendo grânulos eletrodensos. Na porção dorsal à comissura cerebral são encontrados pequenos feixes de axônios, indicando que a inervação do CD provém da comissura cerebral. As terminações axonais encontradas no CD mostram algumas terminações axonais imunnorreativas a FMRFamida, sugerindo a participação deste neuropeptídeo no controle do CD. As células do CD apresentam características evidentes de tecido esteroidogênico.

O mapeamento da imunorreatividade ao neuropeptídio FMRF-amida no SNC e na musculatura pediosa de Megalobulimus oblongus foi realizado com o objetivo de dar continuidade aos estudos que vem sendo realizados nesta espécie, com o interesse em estabelecê-lo como modelo experimental em estudos neurobiológicos. O neuropeptídio FMRF-amida foi o primeiro peptídio nativo de invertebrados a ser purificado e seqüenciado, a partir do extrato de gânglios cardioativos do molusco Macrocallista nimbosa. Ele atuaria sobre os receptores metabotrópicos, induzindo a abertura dos canais iônicos de K+ tipo S (sensíveis à serotonina (5HT)), hiperpolarizando a membrana celular e assim, aumentando o limiar para o desencadeamento do potencial de ação. A distribuição da imunorreatividade à FMRF-amida em M. oblongus foi investigada empregando-se a técnica imunohistoquímica com anticorpo não-marcado de Sternberger (1979). Todos os gânglios nervosos centrais apresentaram neurônios e fibras FLI (FMRF-amide-like immunoreactivity), assim como suas comissuras, conetivos e a maioria dos nervos emergentes destes gânglios. Nos cortes da musculatura pediosa observou-se também uma intensa imunorreatividade a FMRF-amida. O maior número de neurônios FLI foi encontrado nos gânglios cerebrais com seus tamanhos variando de pequeno a grande. O corpo dorsal apresentou grande quantidade de fibras viii imunomarcadas. No mesocérebro foram detectados alguns agrupamentos FLI junto ao neuropilo e à comissura cerebral e neurônios dispersos na sua porção ântero-medial. O pró-cérebro mostrou-se repleto de neurônios globulosos FLI. Vários agrupamentos foram observados nos lobos pedal, pleural e comissural do pós-cérebro. Nos gânglios pedais houve intensa imunomarcação em agrupamentos neuronais localizados principalmente nas regiões posterior e lateral dos gânglios. Na região anterior foi observado um par de neurônios gigantes FLI. Uma distribuição homogênea de neurônios FLI foi observada por toda a extensão dos gânglios pleurais, com a exceção de apenas um neurônio grande localizado no gânglio pleural esquerdo. A diferença no tamanho dos dois gânglios parietais foi constatada também em M. oblongus. No hemigânglio esquerdo, o menor, foi identificado um neurônio gigante (300 µm). O gânglio direito apresentou um número maior de neurônios FLI, de tamanhos variados. O gânglio visceral foi a estrutura que mais apresentou neurônios grandes e gigantes por toda a sua extensão, com imunorreatividades variáveis. O par de gânglios bucais possuía agrupamentos neuronais FLI médios e grandes. Os neurônios gigantes não se mostraram imunorreativos, ou foram apenas levemente imunomarcados no trofospôngio. Na musculatura pediosa foram observadas fibras nervosas de diferentes calibres nas regiões dorsal, medial e ventral e sobre as células musculares. Identificaram-se gânglios nervosos nos pontos de intersecção dos ramos nervosos e malhas nervosas que formavam plexos nervosos nas regiões ventral e dorsal da musculatura pediosa de M. oblongus.