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Zweidimensionale Kristallisation und elektronenkristallographische Strukturbestimmung von Membranproteinen der Energieumwandlung

Krug v. Nidda, Tassilo. January 2002 (has links)
Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2002.
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Monomolekulare Lipopolymerschichten zum Aufbau von biomimetischen Lipidmembranmodellen

Förtig, Anton. January 2004 (has links) (PDF)
München, Techn. Universiẗat, Diss., 2004.
13

Untersuchungen zur Faltung und spontanen Aggregation des amyloidogenen Proteins [alpha]-Synuclein [Alpha-Synuclein] sowie zur Interaktion mit Sphingomyelin-Domänen

Mehnert, Thomas. January 2004 (has links) (PDF)
München, Techn. Univ., Diss., 2004.
14

Identifizierung von Faktoren, die funktionell mit dem Sac1p Protein in Saccharomyces cerevisiae interagieren

Then, Angela. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2000--Heidelberg.
15

Ultrazentrifugen-Untersuchungen an integralen Membran-Proteinen neue Techniken zur Dichtekompensation von Detergensmizellen und ihre Anwendung /

Mayer, Gottfried. Unknown Date (has links)
Universiẗat, Diss., 2002--Frankfurt (Main).
16

Analyse der Lokalisation und Protein, Proteininteraktionen der kleinen GTPase rab1b

Köster, Miriam. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2003--Münster (Westfalen).
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Untersuchungen zum Integrations- und Translokationsmodus des Sec-Translokons in Escherichia coli

Deitermann, Sandra. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2004--Freiburg (Breisgau). / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2003.
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Post-translational insertion of a small tail-anchored protein into the membrane of the endoplasmic reticulum

Spasic, Milan. Unknown Date (has links) (PDF)
University, Diss., 2005--Heidelberg.
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Lamina assoziierte Polypeptide 2, Lamin-B-Rezeptor und Lamine : Untersuchungen an Vertebratenmodellen / Lamina associated polypeptides 2, lamin B receptor and lamins: investigations on vertebrates

Prüfert, Kristina January 2004 (has links) (PDF)
Der Zellkern ist ein wichtiges Organell von eukaryotischen Zellen, der durch eine Doppelmembran vom Cytoplasma abgetrennt wird. Mit Hilfe des Zebrafischs als Modellorganismus und kultivierten Zellen verschiedener Vertebraten wurde in mehreren Teilprojekten Untersuchungen an integralen (Lamina assoziiertes Polypeptid 2, Lamin B Rezeptor) und peripheren Membranproteinen (Lamine) der in inneren Kernmembran durchgeführt. Eines der am besten untersuchten integralen Membranproteine der inneren Kernmembran ist das Lamina assoziierte Polypeptid 2 (LAP2). Durch alternatives Splicen entstehen aus einem einzigen Gen eine Reihe verschiedener Isoformen die entwicklungs- und gewebespezifisch exprimiert werden. In Säuger sind 6 verschiedene Isoformen (LAP2α, β, δ, ε, γ, ζ) bekannt, von denen alle mit Ausnahmen von LAP2α und ζ, in die innere Kernmembran integriert sind. Das LAP2α ist ausschließlich im Nukleoplasma lokalisiert und wurde bis jetzt nur bei Säugern beschrieben. Durch die Identifikation eines genomischen Klons ICRFc 7101293Q5 (RZPD) sowie vergleichende Datenbankanalysen konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LAP2-Gens ermittelt werden. Das Gen kodiert innerhalb von 19 kb (ohne regulatorische Sequenzen) 15 Exons aus denen durch alternatives Splicen 3 verschieden Isoformen hervorgehen (zLAP2 β, γ, ω). Mit Hilfe des “Radiation Hybrid mappings“ wurde das LAP2 Gen auf der “Linkage group“ 4 des Zebrafischs, zwischen den EST-Markern fc01g04 (213,97) und fb49f01 (215,69cR) lokalisiert. Aufgrund der zusätzlichen Identifikation der genomischen Sequenz des Hühner LAP2-Gens konnten die genomischen Sequenzen der LAP2 Gene von niederen Vertebraten (Zebrafisch), über die Vögel (Huhn), bis zum Säuger (Mensch) miteinander verglichen werden. Dabei zeigte sich einerseits, dass die ω Isoform des Zebrafischs nicht im Genom von Huhn und Säugern vorhanden ist: Andererseits ist die α Isoform der Säuger ebenfalls in keinem der anderen Spezies (Huhn, Zebrafisch) zu finden ist. Weiterhin konnte bei zusätzliche Proteinanalysen mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, gegen die konservierte aminoterminale Domäne der LAP2 Proteine, in 10 Tage alten Hühner Embryonen nur ein Protein mit einem vergleichbaren Molekulargewicht zum LAP2β anderer Spezies eindeutig detektiert werden. Aufgrund dieser Befunde und der Tatsache, dass die kodierenden Exonsequenzen zwischen Mensch und Huhn eine größere Ähnlichkeit zeigen als zwischen Mensch und Zebrafisch, liegt die Vermutung nahe, dass die α-Isoform eine Neuheit der Säugern darstellt. Ein weiteres integrales Membranprotein, dass erstmals beim Zebrafisch untersucht wurde, ist der Lamin B Rezeptor (zLBR). Mit Hilfe von radioaktiv markierten Sonden, konnte zwei Klone identifiziert werden die sowohl die gesamte cDNA-Sequenz (MPMGp567K10194Q3 (RZPD) als auch die gesamte genomische Sequenz (ICRFc71M10137Q5 (RZPD) beinhalten. Anhand von vergleichenden Datenbankanalysen, konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LBR-Gens ermittelt werden. Dieses kodiert innerhalb von 12 kb (ohne regulatorische Sequenzen) mit 13 Exons für ein 616 Aminosäure großes Protein. Vergleichbar mit dem LBR anderer Spezies besitzt der Zebrafisch LBR ebenfalls 8 Transmembrandomänen in seiner carboxyterminalen Domäne mit denen er in der inneren Kernmembran verankert ist. Der Aminosäurenvergleich mit anderen Spezies zeigte, dass die Aminosäurensequenz sowohl des aminoterminalen Bereichs als auch im Bereich der Transmembrandomänen hoch konserviert ist. Weiterhin wurden polyklonalen Antikörpern gegen die ersten 210 Aminosäuren des zLBRs hergestellt, die für zukünftige immunologische Analysen verwendet werden können. Ebenso wie die integralen Membranproteine spielen auch die Lamine eine wichtige Rolle bei nukleären Prozessen. Die B-Typ Lamine zeichnen sich alle durch ein konserviertes CxxMMotiv am Carboxyterminus aus. Das CxxM-Motiv wird nach posttranslational modifiziert, wodurch es lipophile Eigenschaften erlangt und somit für die anfängliche Verankerung der Lamine in der inneren Kernmembran verantwortlich ist. Bei A-Typ Laminen ist dieses Motiv nicht in der Primärsequenz enthalten oder es wird nach dem Einbau in die Kernlamina proteolytisch abgespalten. Eine Besonderheit stellt das meiotische Lamin C2 dar, welches ein Spliceprodukt des Lamin A Gens der Säuger ist. Das Lamin C2 besitzt zwar kein CxxMMotiv an seinem Aminoterminus, dafür aber ein Hexapeptid (GNAEGR) nach dem Startmethionin. Die posttranslationale Modifikation dieser Sequenz verleiht dem Protein lipoplile Eigenschaften. Anhand von funktionellen Analysen konnte durch die Überexpression GFP-Fusionsproteinen verschiedener wildtypischer Lamine und Lamin Mutanten gezeigt werden, dass die Interaktion der Lamine über das CxxM-Motiv oder das GNAEGR-Motiv mit der inneren Kernmembran, das Wachstum der Kernhülle induziert. In einem letzten Projekt konnte mit Hilfe spezifischer “antisense-“ Oligonukleotide, die als "Morpholinos" bezeichnet werden, die Expression von LAP2, LBR und den B-Typ Laminen B1 und B2 in Zebrafisch Embryonen reprimiert werden. Die Blockade der mRNA-Translation der entsprechenden Gene erfolgte in allen Fällen innerhalb der ersten 24 Stunden vollständig. Obwohl die Anzahl der beobachteten Embryonen relativ gering war, so zeigte sich bei allen Embryonen eine deutliche Entwicklungsverzögerung und unterschiedlich starke Entwicklungsstörungen. Die morphologischen Auswirkungen waren bei der Reduktion des LAP2 oder der Lamine geringer als bei der Reduktion des LBR, da in beiden Fällen maternale Proteine, wie das LA2ω oder das B-Typ Lamin LIII, nicht reduziert werden konnten. / The nucleus is an essential organelle of eucaryotic cells and separated by a double membrane, the nuclear envelope, from the cytoplasm. Using the zebrafish as one model organism and also cultured cells of various vertebrates, analysis of integral (lamina associated polypeptide 2, lamin B receptor) and peripheral membrane proteins (lamins) of the inner nuclear membrane were performed. One of the best investigated protein of the inner nuclear membrane is the lamina associated polypeptide 2. By alternative splicing the LAP2 gene encodes a number of isoforms that are expressed in a developmental and tissue specific manner. In mammals 6 different isoforms (LAP2α, β, δ, ε, γ, ζ) are known, and all of them except for LAP2α and LAP2ζ get integrated into the inner nuclear membrane. LAP2α is predominantly found in the nucleoplasm and has so far only been described in mammals. Due to the identification of the genomic clone ICRFc 7101293Q5 (RZPD) and an additional contig-sequence published by a database of the Sanger Institute, I was able to analyse the genomic structure of the zebrafish lamina associated polypeptide 2 (zLAP2) gene. It spans approximately 19 kb (with no regulatory sequences) and contains 15 exons. By alternative splicing the 15 exons encode 3 isoforms (zLAP2 β, γ, ω). Using the method of “radiation hybrid mapping” the zLAP2 gene could be localised onto the linkage group 4 between the EST-markers fc01g04 (213,97) and fb49f01 (215,69cR). The additional identification of the genomic LAP2 sequence of chicken, made it possible to compare the genomic sequences of lower vertebrate LAP2 (zebrafish), avian LAP2 (chicken) and mammal LAP2 (human). This comparison revealed that the zebrafish LAP2ω was not found in the chicken and the mammalian genome. On the other hand sequences encoding a LAP2α isoform were not detected in the chicken and zebrafish genome. The analysis of total proteins of 10 day old chicken embryos and fibroblasts using monoclonal and polyclonal antibodies raised against the evolutionary conserved aminoterminal domain confirmed the abundance of a LAP2α isoform. The predominant isoform detected was comparable to LAP2β of other species. These results suggest, in addition to the fact that the exons of human LAP2 show a higher identity to the exons of the chicken LAP2 than to the exons of the zebrafish LAP2, that the α Isoform is a novelty of mammals. A second integral membrane protein, which I focused on, is the lamin B receptor of zebrafish(zLBR). By using radioactive labelled probes of a previously identified LBR fragment, I was able to identify to clones that were coding for the cDNA- (MPMGp567K10194Q3 (RZPD) and the genomic sequence (ICRFc71M10137Q5 (RZPD). By further computer analysis a genomic sequence was determined and revealed that the LBR gene spans over 12 kb nucleotides (no regulatory sequences included). The gene contains 13 exons and encodes a protein of 616 amino acids. Comparable to other species the zLBR contains 8 transmembrane domains in its carboxyterminal domain. Comparison of LBRs of different species on the amino acid level demonstrated that the aminoterminal region and the carboxyterminal domain are highly conserved. Especially the carboxyterminal domain coding for the membrane spanning domains exhibited a high conservation. Furthermore polyclonal antibodies, specific for the amino acids 1-210 were raised and can be used for immulological analysis in the future. Comparable to integral membrane proteins of the inner nuclear membrane lamins are also essential for nuclear processes. A main feature of B type lamins is the carboxyterminal CxxM-motif. This motif undergoes a posttranslational isoprenylation and is responsible for the correct targeting and initial association of the lamins to the inner nuclear membrane. A type lamins on the other and do not possess a CxxM-motif in the primary sequence (mammalian lamin C, C2). In the lamin A isoform the CxxM-motif is encoded in the primary structure but gets proteolytically removed after the protein was targeted to the lamina. The lamin C2, a meiotic splice variant of lamin A, demonstrates a peculiarity. It does not encode a CxxM-motif but possesses the hexapeptide GNAEGR at its aminoterminal end. The GNEAGR-sequence also undergoes a posttranslational modification and becomes myristoylated. Functional studies using overexpressed GFP-fusion proteins of different wildtype lamins and lamin mutants demonstrated that both the CxxM motif and the GNAEGR motif promote nuclear membrane proliferation. With the help of specific antisense oligonucleotides, known as "Morpholinos", I was able to block the expression of LAP2, LBR and B-type lamins B1 and B2 in zebrafish embryos. The mRNA translation of each gene was block completely for at least 24 hours after fertilisation. Although only few embryos were investigated I realised an obvious delay in development and developmental defects in different degrees in all analysed embryos. The degree of morphological deformations was more obvious in knock downs of LBR, than after the reduction of LAP2 or the B type lamins, where maternal proteins, like LAP2ω and the B Type lamin LIII could not get reduced.
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Structural and functional analysis of bestrophin

Milenkovic, Vladimir M. January 2006 (has links) (PDF)
Morbus Best (OMIM 153700), auch als vitelliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) bezeichnet, ist eine autosomal dominant vererbte Makuladystrophie mit juvenilem Beginn. Die Erkrankung geht einher mit einer Ansammlung von Lipofuscin-ähnlichem Material im sowie unterhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE). Das bei Morbus Best mutierte VMD2- Gen kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein, genannt Bestrophin, und wird vorwiegend im RPE exprimiert. Das Protein hat eine komplexe Membrantopologie mit 4-6 putativen Transmembrandomänen (TMD) und ist vermutlich in den Ca2+-abhängigen Transport von Chloridionen durch die Plasmamembran involviert. Die überwiegende Mehrheit der krankheitsassoziierten Veränderungen bei M. Best Patienten sind Missense-Mutationen, die innerhalb der hochkonservierten N-terminalen Hälfte des Proteins nahe der mutmaßlichen Transmembrandomänen akkumulieren. Der Zusammenhang zwischen Pathologie und identifizierter Mutationen bzw. der Chloridkanal- Funktion von Bestrophin-1 ist noch unklar. Um die biologische Funktion von Bestrohin-1 weiter aufzuklären und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der BMD besser zu verstehen, wurde mit Hilfe des GAL4-basierenden Hefe-Zwei-Hybridsystems (Y2H) nach interagierenden Partnern von Bestrophin-1 gesucht. Ein Screen in einer bovinen RPE cDNABank mit verschiedenen verkürzten Fragmenten von Bestrophin-1 ergab 53 mögliche interagierende Partner. Allerdings schlossen anschließende Verifikationsexperimente die Kandidatengene aus. Somit deuten die Resultate dieser umfangreichen YH2-Studie daraufhin, dass Bestrophin für das herkömmliche Zwei-Hybrid-System nicht geeignet ist. Zum einen könnte dies daran liegen, dass das Protein ein integraler Bestandteil der Membran ist und zum anderen, dass möglicherweise der Transport der gewählten Bestrophin-Fragmente zum Nukleus nicht stattfindet. Dies gilt jedoch als Grundvoraussetzung für eine Proteininteraktion im Hefe-2-Hybridsystem. Bestrophin gehört zu einer großen Familie von integralen Membranproteinen, von der bis heute bereits über 100 Mitglieder bei verschiedenen Organismengruppen wie denSäugern, Insekten und Würmern identifiziert werden konnten. Als auffälligste Besonderheit in der Familie der Bestrophine zeigt sich neben einer nicht-variablen RFP-Domäne (Arginin- Phenylalanin-Prolin) eine evolutionär hochkonservierte N-terminale Region. Um die phylogenetische Beziehung der Bestrophine zu untersuchen sowie den Aufbau und die Funktion von konservierten Motiven innerhalb der Familienmitglieder zu identifizieren, wurde diese konservierte N-terminale Region sowohl bioinformatisch wie auch Chapter Two: Zusammenfassung 4 phylogenetisch weiter untersucht. Die phylogenetische Analyse der Bestrophin Homologen brachte vier evolutionär konservierte Familienmitglieder in Säugern hervor, die jeweils eine starke Homologie zu den Proteinen VMD2, VMD2-L1 bis VMD2-L3 des Menschen zeigen. Die signifikante Ähnlichkeit der Proteinsequenz innerhalb der vier Familienmitglieder lässt die Schlussfolgerungen zu, dass zum einen jedes einzelne Familienmitglied ihre eigene evolutionär konservierte Funktion hat und zum anderen dass die Divergenz des Bestrophins in verschiedene Familienmitglieder zeitlich vor der Divergenz der verschiedenen Säugerspezien erfolgt sein muss. / Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species.

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