Zugl.: Tübingen, Univ., Diss., 2008

Univ., Diss., 2009--Marburg.

Regensburg, Univ., Diss., 2010.

Regensburg, Univ., Diss., 2010.

University, Diss., 2006--Würzburg.

Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist weltweit die häufigste Ursache von irreversibler Erblindung des alternden Menschen. Mit der anti-VEGF-Behandlung steht für die deutlich seltenere feuchte AMD eine zugelassene Therapie bereit, die deutlich häufigere trockene AMD entzieht sich aktuell jedoch jeglicher Therapie. Ein zentraler Pathomechanismus der AMD ist der progrediente Untergang des retinalen Pigmentepithels (RPE). Die Rarifizierung und letztendlich Atrophie des RPEs führt zum Untergang der funktionellen Einheit aus RPE, Photorezeptoren und Bruch’scher Membran und somit zum irreversiblen Funktionsverlust. Ein möglicher therapeutischer Ansatz, der progredienten Atrophie des RPEs entgegenzuwirken, ist, das prinzipiell post- mitotischen RPE zur Proliferation anzuregen. Grundlage unserer in vitro Untersuchungen ist das ARPE-19 Zellmodell. Um die Proliferation anzuregen wurden die RPE-Zellen mit E2F2, einem Zellzyklus- regulierendem Transkriptionsfaktor, transfiziert. Zunächst wurde ein nicht-proliferatives RPE-Zellmodell mit spontanem Wachstumsarrest etabliert. Innerhalb von zwei Wochen konnte die Ausbildung von Zonulae occludentes als Zeichen der Integrität des adhärenten Zellmonolayers beobachtet werden. Die chemische Transfektion von E2F2 unter einem CMV-Promoter führte zur Überexpression von E2F2-Protein. Der proliferationssteigernde Effekt von E2F2 konnte durch die Proliferationsmarker Cyclin D1 sowie Ki67, dem Anstieg der BrdU-Aufnahme und der nach Transfektion mit E2F2 zunehmenden Gesamtzellzahl nachgewiesen werden. Der Zellzahlerhöhung standen jedoch potentiell qualitative und funktionelle Einbußen entgegen. So zeigten sich nach Behandlung mit E2F2 die Zellviabilität reduziert und die Apoptoserate sowie die Permeabilität des Epithels erhöht. Diese Einschränkungen waren jedoch nur passager bis 7 Tage nach Transfektion sichtbar und reversibel. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Defizite nicht durch E2F2 selbst, sondern durch das Transfektionsreagenz PEI bedingt waren. Weitere funktionelle Defizite könnten durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) verursacht werden. Hier zeigte sich durch E2F2 keine De-Differenzierung im Sinne einer typischen EMT-Marker- Expression. Die vorliegende Arbeit zeigt in einem in vitro Zellmodell die Grundlagen eines vielversprechenden Ansatzes zur Therapie der trockenen AMD: Durch Überexpression eines den Zellzyklus regulierenden Gens (hier E2F2) wurde die RPE-Regeneration angeregt. Analog zur schon zugelassenen Gentherapie des RPEs bei RPE65-assoziierten Netzhautdystrophien durch den Transfer von funktionstüchtigem RPE65-Gen mittels Adeno-assoziierten Viren könnte mittels E2F2, übertragen mit einem lentiviralen Verktor, eine Stimulation des RPEs zur Proliferation möglich sein. Entscheidend ist der möglichst gute Struktur- und Funktionserhalt des Photorezeptor-Bruch-Membran-RPE Komplexes. Eine Therapie sollte daher in frühen Krankheitsstadien erfolgen, um die Progression zu fortgeschrittenen Erkrankungsstadien mit irreversiblem Funktionsverlust zu verzögern oder zu verhindern. / Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of irreversible blindness in the ageing population worldwide. While for wet AMD an approved therapy is available in form of anti-VEGF treatment, the by far more common dry AMD is currently outside the scope of any therapy. A central pathomechanism of AMD is the progressive degeneration of the retinal pigment epithelium (RPE). Rarefication and finally atrophy of the RPE leads to the collapse of the functional unit consisting of RPE, photoreceptors and Bruch’s membrane, resulting in irreversible loss of function. A possible therapeutic strategy to prevent RPE atrophy is to stimulate the post-mitotic RPE to proliferate. The basis of our in vitro investigations is an ARPE-19 cell culture model. To stimulate proliferation, the RPE cells were transfected with E2F2, a cell cycle regulating transcription factor. First, a non-proliferative RPE cell model with spontaneous growth arrest was established. Within two weeks, the formation of zonulae occludentes was observed as a sign of the integrity of the adherent cell monolayer. Chemical transfection of E2F2 under a CMV promoter led to overexpression of E2F2 protein. The proliferation enhancing effect of E2F2 was demonstrated by proliferation markers cyclin D1 and Ki67, the increase in BrdU uptake, and the increase in total cell number after transfection with E2F2. However, the increase in cell proliferation was potentially offset by qualitative and functional losses. After treatment with E2F2, cell viability was reduced, and apoptosis rate and permeability of the epithelium were increased. These shortcomings were only temporarily detectable up to 7 days after transfection and were reversible. Our results suggest that these deficits were not caused by E2F2 itself, but by the transfection reagent PEI. Further functional deficits could be caused by epithelial-mesenchymal transition (EMT). Here, E2F2 did not show any de-differentiation in the form of typical EMT marker expression. The present study shows the basics of a promising approach for the therapy of dry AMD in an in vitro cell model: RPE regeneration was stimulated by overexpression of a gene regulating the cell cycle (here E2F2). Analogous to approved gene therapy of the RPE for RPE65-associated retinal dystrophies through transfer of functional RPE gene by adeno-associated viruses, a lentiviral vector delivering E2F2 could stimulate the RPE to proliferate. It is essential to preserve the structure and function of the photoreceptor-Bruch's membrane-RPE complex. Therapy therefore needs to take place in early stages of the disease to prevent or slow down progression to advanced stages with irreversible loss of function.

Therapieergebnisse der Patienten, die im Zeitraum von 1. Januar bis 31. Dezember 2006 in der Augenklinik Würzburg mehrere intravitreale Injektionen mit Bevacizumab bei altersabhängiger Makuladegeneration mit subfovealer choroidaler Neovaskularisation erhalten hatten. / Results of the treatment for choroidal neovascular membranes with Bevacizumab in age related macular degeneration.

Morbus Best (OMIM 153700), auch als vitelliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) bezeichnet, ist eine autosomal dominant vererbte Makuladystrophie mit juvenilem Beginn. Die Erkrankung geht einher mit einer Ansammlung von Lipofuscin-ähnlichem Material im sowie unterhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE). Das bei Morbus Best mutierte VMD2- Gen kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein, genannt Bestrophin, und wird vorwiegend im RPE exprimiert. Das Protein hat eine komplexe Membrantopologie mit 4-6 putativen Transmembrandomänen (TMD) und ist vermutlich in den Ca2+-abhängigen Transport von Chloridionen durch die Plasmamembran involviert. Die überwiegende Mehrheit der krankheitsassoziierten Veränderungen bei M. Best Patienten sind Missense-Mutationen, die innerhalb der hochkonservierten N-terminalen Hälfte des Proteins nahe der mutmaßlichen Transmembrandomänen akkumulieren. Der Zusammenhang zwischen Pathologie und identifizierter Mutationen bzw. der Chloridkanal- Funktion von Bestrophin-1 ist noch unklar. Um die biologische Funktion von Bestrohin-1 weiter aufzuklären und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der BMD besser zu verstehen, wurde mit Hilfe des GAL4-basierenden Hefe-Zwei-Hybridsystems (Y2H) nach interagierenden Partnern von Bestrophin-1 gesucht. Ein Screen in einer bovinen RPE cDNABank mit verschiedenen verkürzten Fragmenten von Bestrophin-1 ergab 53 mögliche interagierende Partner. Allerdings schlossen anschließende Verifikationsexperimente die Kandidatengene aus. Somit deuten die Resultate dieser umfangreichen YH2-Studie daraufhin, dass Bestrophin für das herkömmliche Zwei-Hybrid-System nicht geeignet ist. Zum einen könnte dies daran liegen, dass das Protein ein integraler Bestandteil der Membran ist und zum anderen, dass möglicherweise der Transport der gewählten Bestrophin-Fragmente zum Nukleus nicht stattfindet. Dies gilt jedoch als Grundvoraussetzung für eine Proteininteraktion im Hefe-2-Hybridsystem. Bestrophin gehört zu einer großen Familie von integralen Membranproteinen, von der bis heute bereits über 100 Mitglieder bei verschiedenen Organismengruppen wie denSäugern, Insekten und Würmern identifiziert werden konnten. Als auffälligste Besonderheit in der Familie der Bestrophine zeigt sich neben einer nicht-variablen RFP-Domäne (Arginin- Phenylalanin-Prolin) eine evolutionär hochkonservierte N-terminale Region. Um die phylogenetische Beziehung der Bestrophine zu untersuchen sowie den Aufbau und die Funktion von konservierten Motiven innerhalb der Familienmitglieder zu identifizieren, wurde diese konservierte N-terminale Region sowohl bioinformatisch wie auch Chapter Two: Zusammenfassung 4 phylogenetisch weiter untersucht. Die phylogenetische Analyse der Bestrophin Homologen brachte vier evolutionär konservierte Familienmitglieder in Säugern hervor, die jeweils eine starke Homologie zu den Proteinen VMD2, VMD2-L1 bis VMD2-L3 des Menschen zeigen. Die signifikante Ähnlichkeit der Proteinsequenz innerhalb der vier Familienmitglieder lässt die Schlussfolgerungen zu, dass zum einen jedes einzelne Familienmitglied ihre eigene evolutionär konservierte Funktion hat und zum anderen dass die Divergenz des Bestrophins in verschiedene Familienmitglieder zeitlich vor der Divergenz der verschiedenen Säugerspezien erfolgt sein muss. / Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species.

Es wird eine Beschreibung und Klassifikation der verschiedenen AF Muster bei Augen mit einem Frühstadium der AMD vorgestellt. Definierte Phänotypen ermöglichen eine Identifizierung spezifischer Risikoeigenschaften, sodass betroffene Patienten individuell betreut und Therapien geplant werden können. Die Arbeit dient als Grundlage für weitere klinisch-genetische AMD-Studien mit AF-Bildgebung zur Erhebung einer standardisierten Nomenklatur. / This dissertation describes and classifies various autofluorescence patterns in eyes with early stages of age-related macular degeneration. Defined phenotypes allow an identification of specific risk factors, facilitating the individual care and treatment planning of patients with early stages of age-related macular degeneration.

Regensburg, Univ., Diss., 2009.