With ageing, the loss of bone mass correlates with the expansion of adipose tissue in human bone marrow thus facilitating bone-related diseases like osteopenia and osteoporosis. The molecular mechanisms underlying these events are still largely unknown. Reduced osteogenesis and concurrently enhanced adipogenesis might not only occur due to the impairment of conventional osteogenic differentiation originating from mesenchymal stem cells (MSCs). Additionally, transdifferentiation of (pre-)osteoblasts into adipocytes could contribute to the fatty conversion. Therefore, the aim of the present study was to prove the existence of transdifferentiation between the adipogenic and osteogenic lineage and to elucidate molecular mechanisms underlying this phenomenon. At first, a cell culture system of primary human MSCs was established that allowed for differentiation into the adipogenic and osteogenic lineage and proved that the MSC-derived adipocytes and pre-osteoblasts were capable of transdifferentiation (reprogramming) from one into the other lineage. Thereby, lineage-specific markers were completely reversed after reprogramming of pre-osteoblasts into adipocytes. The osteogenic transdifferentiation of adipocytes was slightly less efficient since osteogenic markers were present but the adipogenic ones partly persisted. Hence, plasticity also reached into the differentiation pathways of both lineages and the better performance of adipogenic reprogramming further supported the assumption of its occurrence in vivo. The subsequent examination of gene expression changes by microarray analyses that compared transdifferentiated cells with conventionally differentiated ones revealed high numbers of reproducibly regulated genes shortly after initiation of adipogenic and osteogenic reprogramming. Thereof, many genes were correlated with metabolism, transcription, and signal transduction as FGF, IGF, and Wnt signalling, but only few of the established adipogenesis- and none of the osteogenesis-associated marker genes were detected within 24 h after initiation of transdifferentiation. To find possible key control factors of transdifferentiation amongst the huge amount of regulated genes, a novel bioinformatic scoring scheme was developed that ranked genes due to their potential relevance for reprogramming. Besides the reproducibility and level of their regulation, also the possible reciprocity between the adipogenic and osteogenic transdifferentiation pathway was taken into account. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) that ranked as one of the leading candidates to govern reprogramming was proven to inhibit adipogenic differentiation as well as adipogenic transdifferentiation in our cell culture system. Further examination of the FGF signalling pathway and other highly ranked genes could help to better understand the age-related fatty degeneration at the molecular level and therefore provide target molecules for therapeutic modulation of the plasticity of both lineages in order to inhibit adipogenic degeneration and to enhance osteogenesis. / Der Verlust an Knochenmasse im Alter ist mit der Ausbreitung von Fettgewebe im menschlichen Knochenmark assoziiert und fördert daher auch knochenspezifische Erkrankungen wie Osteopenie und Osteoporose. Die diesen Ereignissen zu Grunde liegenden Mechanismen sind immer noch weitgehend unbekannt. Die abnehmende Osteogenese und die gleichzeitig zunehmende Adipogenese treten wahrscheinlich nicht nur wegen der Beeinträchtigung der konventionellen osteogenen Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen (MSZ) auf. Zusätzlich könnte auch die Transdifferenzierung (Reprogrammierung) von Osteoblasten(vorläufern) zu Adipozyten zur fettigen Umwandlung beitragen. Das Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Existenz der Transdifferenzierung zwischen dem adipogenen und osteogenen Differenzierungsweg nachzuweisen und die molekularen Mechanismen aufzuklären, die diesem Phänomen zu Grunde liegen. Zunächst wurde ein Zellkultursystem primärer mesenchymaler Stammzellen etabliert, in dem eine Differenzierung zu Adipozyten und Osteoblasten durchgeführt werden konnte, und nachgewiesen, dass aus MSZ erhaltene Adipozyten und Osteoblastenvorläufer von einer zur anderen Zelllinie transdifferenziert (reprogrammiert) werden können. Dabei wurden die zelllinienspezifischen Marker nach der Reprogrammierung von Osteoblastenvorläufern zu Adipozyten vollständig umgekehrt. Die osteogene Transdifferenzierung von Adipozyten war etwas weniger effizient, da die osteogenen Marker zwar vorhanden waren, aber auch die adipogenen Marker weiterhin auftraten. Die Plastizität erstreckte sich also auch auf die Differenzierungswege der beiden Zellpopulationen, wobei das bessere Ergebnis bezüglich der adipogenen Reprogrammierung die Annahme ihres Auftretens in vivo weiter unterstützte. Die nachfolgende Untersuchung von Genexpressionsänderungen mittels Mikroarray-Analysen, die transdifferenzierte mit konventionell differenzierten Zellen verglichen, führte kurz nach Initiation der adipogenen und osteogenen Transdifferenzierung zum Auffinden zahlreicher, reproduzierbar regulierter Gene. Viele dieser Gene standen mit Metabolismus, Transkription und Signaltransduktion wie dem FGF-, IGF- und Wnt-Signalweg in Zusammenhang, es wurden allerdings nur einige Adipogenese- und keinerlei Osteogenese-assoziierte Markergene innerhalb 24 h nach Initiation der Transdifferenzierung detektiert. Um unter der großen Zahl an regulierten Genen mögliche Schlüsselkontrollfaktoren der Transdifferenzierung zu finden, wurde ein neuartiges, bioinformatisches Punktesystem entwickelt, das Gene entsprechend ihrer potenziellen Relevanz für die Reprogrammierung auflistete. Dabei wurde neben der Reproduzierbarkeit und dem Ausmaß ihrer Regulation auch eine mögliche Reziprozität der Regulation zwischen dem adipogenen und osteogenen Transdifferenzierungsweg berücksichtigt. Es konnte nachgewiesen werden, dass der Fibroblastenwachstumsfaktor 1 (FGF1), der als einer der Hauptkandidaten für die Steuerung der Reprogrammierung eingeordnet worden war, in unserem Zellkultursystem sowohl die adipogene Differenzierung als auch die adipogene Transdifferenzierung hemmt. Die weitere Untersuchung des FGF-Signalwegs und anderer, hoch gelisteter Gene könnte zum besseren Verständnis der altersbezogenen fettigen Degeneration auf molekularer Ebene beitragen und daher Zielmoleküle liefern, die eine therapeutische Beeinflussung der Plastizität zwischen beiden Zelllinien zur Verhinderung der fettigen Degeneration und zur Förderung der Osteogenese erlauben.

Würzburg, University, Diss., 2007.

Ulm, Univ. Diss., 2006.

Tumorgewebe besteht nicht nur aus malignen Zellen, sondern setzt sich auch aus nicht-malignen Zellen des Tumorstromas zusammen. Dieses Stroma spielt eine entscheidende Rolle für das Tumorwachstum und das metastatische Verhalten. Zu den Zellen des Tumorstromas gehören unter anderem die tumorassoziierten Fibroblasten (TAF), welche aktuell Gegenstand intensiver Forschung sind, da TAF ein interessanter Ansatz für die Krebstherapie sein könnten. Dies ist insbesondere für Kopf-Hals-Tumore von Interesse, da die Prognose für diese Tumorentität in den letzten Jahren kaum verbessert werden konnte. Die Prozesse der TAF-Bildung sind allerdings noch nicht hinreichend geklärt, da sowohl die zelluläre Herkunft als auch die Faktoren, die die Entwicklung von TAF beeinflussen, heterogen sind. Dies erschwert eine genaue Charakterisierung dieser Zellpopulation. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob Wundsekret (WS) eine Transformation von humanen mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks (MSC) zu TAF induzieren kann, was zu einer Verstärkung des lokalen protumorigenen Milieus nach chirurgischer Resektion führen könnte. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob die Transdifferenzierung von MSC zu TAF durch tumor-konditioniertes Medium (CM) und Co- Kultur mit Tumorzellen, welche für andere Tumorentitäten bereits gezeigt wurde, mit einer Kopf- Hals-Tumorzelllinie reproduziert werden kann. Dazu wurden MSC von zehn Spendern isoliert und kultiviert. Durch Multidifferenzierung und Durchflusszytometrie wurden sie anhand der Minimalkriterien für MSC charakterisiert. Anschließend wurde der Einfluss von WS, CM und Co-Kultur mit Tumorzellen auf die MSC untersucht. Die potenzielle Transdifferenzierung der MSC zu TAF wurde anhand von morphologischen Veränderungen, RNA-Expression und Proteinexpression der TAF-assoziierten Marker Fibroblastenaktivierungsprotein (FAP), α-Smooth Muscle Actin (α-SMA), Thrombospondin-1 (THBS1) und Tenascin-C (TNC) analysiert. Dazu wurde nach 24 und 48 h eine Real-Time PCR und nach 48 h eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt. Im Dot Blot Assay wurden die Zytokinmuster der Inkubationsmedien untersucht. Die MSC zeigten lichtmikroskopisch insbesondere nach Inkubation mit WS morphologische Veränderungen. In der Real-Time PCR zeigte sich, dass die Gen-Expression TAF-typischer Marker nach unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen im Vergleich zur Kontrolle nur geringfügig verändert war. Der Einfluss der Inkubationsmedien auf die Expression von FAP und α-SMA war stärker als auf THBS1 und TNC. Die Expression von FAP und α-SMA war nach Inkubation mit WS signifikant verringert und im Vergleich zu CM und Co-Kultur geringer. Die Expressionsmuster zeigten insgesamt eine große Variabilität. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte ebenfalls heterogene Ergebnisse, sodass auf Proteinebene keine V eränderungen der Expressionsmuster von FAP und α-SMA gezeigt werden konnten. Im Dot Blot Assay konnten Faktoren nachgewiesen wurden, welche laut Literatur einen wichtigen Einfluss auf die TAF- Transdifferenzierung haben. Die erhobenen Daten zeigen Veränderungen von Phänotyp und von TAF-typischen Markern auf molekularer Ebene durch die Inkubation von MSC mit verschiedenen Kulturmedien. Allerdings war eine genaue phänotypische und molekulare Charakterisierung der TAF nicht möglich, was unter anderem durch die individuelle Heterogenität der primären Zellen bedingt war. Die beobachteten geringfügigen Veränderungen könnten verschiedene Ursachen haben, wobei insbesondere eine zu kurze Inkubationszeit und das Fehlen entscheidender Induktionsfaktoren für die Umwandlung von MSC in TAF in den verwendeten Inkubationsmedien zu nennen sind. Insgesamt ist festzuhalten, dass verschiedene Kulturbedingungen MSC auf unterschiedliche Weise beeinflussen. Allerdings konnte die in der Literatur beschriebene TAF-Bildung durch CM und Co-Kultur nicht eindeutig reproduziert werden und auch die Aussage, dass WS die TAF- Bildung induziert, kann nicht uneingeschränkt getroffen werden. Die Heterogenität der Ergebnisse zeigt die Komplexität der Interaktionen von Tumorzellen und Zellen der Mikroumgebung. / Tumor tissue consists not only of malignant cells, but is also composed of non-malignant cells of the tumor stroma. This stroma plays a decisive role in tumor growth and metastatic behavior. The cells of the tumor stroma include tumor-associated fibroblasts (TAF), which are currently the subject of intensive research, as TAF could be an interesting approach for cancer therapy. This is of particular interest for head and neck tumors, as the prognosis for this tumor entity has hardly improved in recent years. However, the processes of TAF formation have not yet been sufficiently clarified, as both the cellular origin and the factors that influence the development of TAF are heterogeneous. This makes a precise characterization of this cell population difficult. The aim of this study was to investigate whether wound secretion (WS) can induce a transformation of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) to TAF, which could lead to an enhancement of the local protumorigenic milieu after surgical resection. Furthermore, it should be investigated whether the transdifferentiation of MSC to TAF by tumor-conditioned medium (CM) and co-culture with tumor cells, which has already been shown for other tumor entities, can be reproduced with a head and neck tumor cell line. For this purpose, MSC from ten donors were isolated and cultured. They were characterized by multidifferentiation and flow cytometry according to the minimal criteria for MSC. Subsequently, the influence of WS, CM and co-culture with tumor cells on the MSC was investigated. The potential transdifferentiation of MSC to TAF was analyzed by morphological changes, RNA expression and protein expression of the TAF-associated markers fibroblast activation protein (FAP), α-smooth muscle actin (α-SMA), thrombospondin-1 (THBS1) and tenascin-C (TNC). Real-time PCR was performed after 24 and 48 h and immunofluorescence staining was performed after 48 h. The cytokine patterns of the incubation media were analyzed in the dot blot assay. The MSC showed morphological changes under the light microscope, especially after incubation with WS. Real-time PCR showed that the gene expression of TAF-typical markers was only slightly changed after different cultivation conditions compared to the control. The influence of the incubation media on the expression of FAP and α-SMA was stronger than on THBS1 and TNC. The expression of FAP and α-SMA was significantly decreased after incubation with WS and lower compared to CM and co-culture. Overall, the expression patterns showed great variability. Fluorescence microscopy also showed heterogeneous results, so that no changes in the expression patterns of FAP and α-SMA could be shown at the protein level. The dot blot assay was able to detect factors which, according to the literature, have an important influence on TAF transdifferentiation. The data collected show changes in phenotype and TAF-typical markers at the molecular level due to the incubation of MSC with different culture media. However, a precise phenotypic and molecular characterization of TAF was not possible, partly due to the individual heterogeneity of the primary cells. The observed minor changes could have various causes, in particular a too short incubation time and the lack of decisive induction factors for the conversion of MSC into TAF in the incubation media used. Overall, it should be noted that different culture conditions affect MSC in different ways. However, the TAF formation by CM and co-culture described in the literature could not be clearly reproduced and the statement that WS induces TAF formation cannot be made without reservation. The heterogeneity of the results shows the complexity of the interactions between tumor cells and cells of the microenvironment.

La métaplasie épithéliale est un phénomène d'adaptation tissulaire apparaissant à la suite d'une agression chronique. Caractérisées par le remplacement d'un épithélium par un autre, ces transformations métaplasiques peuvent apparaître dans différentes régions anatomiques (bronches, sophage, col de l'utérus, estomac et vessie). Bien que mieux adapté à résister à un agent irritatif, l'épithélium métaplasique présente cependant une susceptibilité accrue au développement cancéreux. Ainsi, la grande majorité (87%) des lésions (pré)néoplasiques cervicales se développe au sein du microenvironnement métaplasique de la zone de transformation du col utérin. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont contribué à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la métaplasie épidermoïde cervicale et ont démontré, pour la première fois, une implication du TGF-β1 et de la PGE2 dans limmunodéficience locale observée dans les foyers de métaplasie mature et immature. Ainsi, en réduisant lexpression de E-cadhérine, le TGF-β1 altère indirectement la rétention épithéliale des cellules présentatrices dantigène en empêchant leurs interactions avec les cellules épithéliales. Quant à la PGE2, elle affecte la migration et le phénotype de ces cellules immunitaires, les rendant tolérogènes et, par conséquent, incapables dactiver les lymphocytes T naïfs. Par ailleurs, il est possible que la réduction de ΔNp63 par les facteurs de transcription Snail et Slug participe à la mise en place des épithélia métaplasiques ainsi quà leur transformation maligne.