Tübingen, Univ., Diss., 2006.

Die Krebserkrankung ist bis zum heutigen Zeitpunkt eine große Belastung in unserer Gesellschaft. Obwohl es stets Fortschritte in der Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten gibt, stellt die Behandlung auch in der modernen Medizin eine enorme Herausforderung dar. Darum besteht bis heute ein hoher Bedarf an neuen und weiterentwickelten Behandlungsmöglichkeiten. Um die Proliferation einer neoplastischen Zelle zu beeinflussen, stellen die Biomasse und die Energie einen grundlegenden Ansatz dar. Hier bieten sich vor allem die Aminosäuren als wesentlicher Baustein der Zellmasse und der Energieträger „Glukose“ an, wodurch sich die beiden Ansätze einer Protein- bzw. Aminosäure-Restriktion und einer Glukose-Restriktion ergeben. Ziel ist es durch eine veränderte Stoffwechsellage einen Low-Energy-Metabolismus (LEM) zu induzieren, welcher die Zelle in einen sich selbst regenerierenden, antiproliferativen Zustand versetzt. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob sich die beiden Ansätze grundsätzlich als Therapieform gegen das Plattenepithelkarzinom (HNSCC) eignen. Zudem sollte ein Modell einer humanen Zelllinie erstellt werden, mit Hilfe dessen sich ein LEM auf metaboler Ebene charakterisieren lässt. Die Ergebnisse zeigen, dass Zellen unter konstanter Glukose-Restriktion teils sensitiver auf Todesliganden reagieren. Außerdem wirken Kalorien-Restriktions-Mimetika antiproliferativ auf HNSCC Zellen. Hinzu kommt, dass eine Methionin-Restriktion Einfluss auf die Genexpression jener Gene hat, die mit der LEM-Signalkaskade in Zusammenhang stehen. Zuletzt lieferte die massenspektrometrische Analyse von mehr als 150 Metaboliten der humanen Zelllinie HeLa ein detailliertes Bild ihres Metabolismus unter Methionin-Restriktion. Durch die Definition eines charakteristischen Fingerabdrucks nach 72 h und eines kleinen Fußabdrucks aus wenigen Metaboliten, konnte ein humanes Modellsystem etabliert werden, dass zukünftig u.a. die schnelle Analyse von Kalorien-Restriktions-Mimetika ermöglicht. / Cancer continues to be a major burden in our society to this day. Although there is always progress in the development of new treatment options, treatment remains an enormous challenge even in modern medicine. That is why there is a high demand for new and advanced treatment options to this day. To influence the proliferation of a neoplastic cell, biomass and energy represent a fundamental approach. In this context, amino acids as an essential building block of the cell mass and the energy carrier "glucose" are particularly suitable, resulting in the two approaches of protein or amino acid restriction and glucose restriction. The aim is to induce a low-energy metabolism (LEM) by changing the metabolic state, which will put the cell into a self-regenerating, anti-proliferative state. In addition, it should be investigated whether the two approaches are suitable in principle as a form of therapy against head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Furthermore, to establish a model of a human cell line that can be used to characterize LEM at the metabolic level. The results show that cells under constant glucose restriction are partly more sensitive to death ligands. Moreover, caloric restriction mimetics have an antiproliferative effect on HNSCC. In addition, methionine restriction has an impact on gene expression of those genes related to the LEM signaling cascade. Most recently, mass spectrometric analysis of more than 150 metabolites from the human cell line HeLa provided a detailed picture of their metabolism under methionine restriction. By defining a characteristic fingerprint after 72 h and a small footprint consisting of a few metabolites, a human model system could be established that will allow, among other things, the rapid analysis of caloric restriction mimetics in the future.

Eine erhöhte Konzentration von Homocystein im Plasma (Hyperhomocysteinämie) gilt als unabhängiger Risikoindikator für neuronale und kardiovaskuläre Erkrankungen. Der Präcursor des Homocysteins, Methionin, ist eine essentielle Aminosäure, die bei Fehlernährung übermäßig verzehrt werden kann. Es wurde untersucht, ob tatsächlich durch langfristigen erhöhten Methioninverzehr via Erhöhung des Homocysteinspiegels im Plasma ein reales Gesundheitsrisiko besteht. Als Modell wurde eine Füttterungsstudie an Ratten gewählt, deren Bedingungen bezüglich Fütterungsdauer und Methioningehalt der Diät (0,4 % Methionin für 4 Wochen) an eine mögliche Fehlernährung des Menschen angepasst waren. Bei diesen Ratten war die Plasmahomocystein-Konzentration ca. 2-fach höher, als bei Ratten, die im gleichen Zeitraum eine "normale" Diät mit einem 3-4 fach niedrigeren Methioningehalt bekamen. Neben der Auswirkung der Diät auf den Homocystein-Stoffwechsel wurde geprüft, welche der in der Literatur dargestellten potentiellen Pathomechanismen für Hyperhomocysteinämie-induzierte Schäden Anwendung in diesem Modell finden. Obwohl die Konzentration von Homocystein im Plasma verändert war, wurde keine Beeinträchtigung der Gefäßfunktion gefunden. Auch die Plasmakonzentration von asymmetrischem Dimethylarginin, einem weiteren Risikoindikator für Herz-Kreislauf-Erkrankungen blieb unverändert, obwohl dieser Parameter bei Hyperhomocysteinämie oftmals erhöht ist. Eine Konzentrationsverdoppelung von Homocystein durch erhöhte alimentäre Methioninzufuhr ohne gleichzeitige Erhöhung von ADMA scheint also keine Verschlechterung der Gefäßfunktion bei Ratten zu bewirken. In diesem Punkt kann man von in anderen Modellen der Hyperhomocysteinämie gefundenen Resultaten keine Rückschlüsse auf die durch alimentäres Methionin verursachte Hyperhomocysteinämie ziehen. Andere Modelle zur Induktion einer Hyperhomocysteinämie ist Homocyst(e)in-Fütterung. In weiteren Rattenstudien wurden Effekte homocystin- und methioninreiche Diät verglichen. In diesen Studien zeigte sich, dass bei ähnlichen applizierten Dosen (tägliche Aufnahme ca. 1,0 bzw. 1,4 g/kg Körpergewicht) methionin- und homocystinreiche Diät bei Ratten zu vergleichbaren Plasma-Homocysteinspiegeln führen (methioninreich: 27,32 ± 2,80 µmol/l; homocystinreich: 40,61 ± 2,22 µmol/l). Als Vergleichsparameter zur Beurteilung pathophysiologischer Veränderungen diente zum einen der Gewebsgehalt an Homocystein, zum anderen wurden die intrazellulären Konzentrationen von S-Adenosyl-Methionin (SAM) und S-Adenosyl-Homocystein (SAH) betrachtet. Es zeigten sich besonders in Leber und Niere signifikante Unterschiede zwischen einer methioninreichen und einer homocystinreichen Diät bei Ratten. Dies ist eine mögliche Erklärung dafür, dass die bei vierwöchiger methioninreicher Diät gefundenen Ergebnisse nicht mit Literaturdaten übereinstimmen. Abschließend wurde der Frage nachgegangen, ob eine homocytinreiche Ernährung, wie in der vorherigen Studie angewandt, überhaupt möglich ist. Da zwar die Gehalte von Methionin in fast allen Lebensmitteln bekannt sind, nicht aber die von Homocystein, wurde untersucht, in welchen Konzentrationen Homocystein in Lebensmitteln enthalten ist. In Schwarzbier (0,03 mg/l), Weißbrot (0,95 mg/kg), Roquefort-Käse (0,50 mg/kg), Thunfisch (0,25 mg/kg) und Schweineleber (0,31 mg/kg) konnte Homocystein bestimmt werden. Da die Homocysteinkonzentrationen in diesen Beispiellebensmitteln mindestens um den Faktor 105 geringer waren als die Methioninkonzentrationen ist ein Einfluss von alimentärem Homocystein auf den Plasmaspiegel sehr unwahrscheinlich. Es wurde weiterhin geprüft, ob durch Darmbakterien ein Teil des alimentär aufgenommenen Methionins bereits im Dünndarm in Homocyt(e)in umgewandelt werden könnte. Dabei wurde eine vermehrte Homocysteinproduktion nach Methionin-Zugabe zu Dünndarmisolaten gefunden. Quantitativ kommt dieser Homocysteinquelle eine untergeordnete Bedeutung zu.

Eine erhöhte Konzentration von Homocystein im Plasma (Hyperhomocysteinämie) gilt als unabhängiger Risikoindikator für neuronale und kardiovaskuläre Erkrankungen. Der Präcursor des Homocysteins, Methionin, ist eine essentielle Aminosäure, die bei Fehlernährung übermäßig verzehrt werden kann. Es wurde untersucht, ob tatsächlich durch langfristigen erhöhten Methioninverzehr via Erhöhung des Homocysteinspiegels im Plasma ein reales Gesundheitsrisiko besteht. Als Modell wurde eine Füttterungsstudie an Ratten gewählt, deren Bedingungen bezüglich Fütterungsdauer und Methioningehalt der Diät (0,4 % Methionin für 4 Wochen) an eine mögliche Fehlernährung des Menschen angepasst waren. Bei diesen Ratten war die Plasmahomocystein-Konzentration ca. 2-fach höher, als bei Ratten, die im gleichen Zeitraum eine "normale" Diät mit einem 3-4 fach niedrigeren Methioningehalt bekamen. Neben der Auswirkung der Diät auf den Homocystein-Stoffwechsel wurde geprüft, welche der in der Literatur dargestellten potentiellen Pathomechanismen für Hyperhomocysteinämie-induzierte Schäden Anwendung in diesem Modell finden. Obwohl die Konzentration von Homocystein im Plasma verändert war, wurde keine Beeinträchtigung der Gefäßfunktion gefunden. Auch die Plasmakonzentration von asymmetrischem Dimethylarginin, einem weiteren Risikoindikator für Herz-Kreislauf-Erkrankungen blieb unverändert, obwohl dieser Parameter bei Hyperhomocysteinämie oftmals erhöht ist. Eine Konzentrationsverdoppelung von Homocystein durch erhöhte alimentäre Methioninzufuhr ohne gleichzeitige Erhöhung von ADMA scheint also keine Verschlechterung der Gefäßfunktion bei Ratten zu bewirken. In diesem Punkt kann man von in anderen Modellen der Hyperhomocysteinämie gefundenen Resultaten keine Rückschlüsse auf die durch alimentäres Methionin verursachte Hyperhomocysteinämie ziehen. Andere Modelle zur Induktion einer Hyperhomocysteinämie ist Homocyst(e)in-Fütterung. In weiteren Rattenstudien wurden Effekte homocystin- und methioninreiche Diät verglichen. In diesen Studien zeigte sich, dass bei ähnlichen applizierten Dosen (tägliche Aufnahme ca. 1,0 bzw. 1,4 g/kg Körpergewicht) methionin- und homocystinreiche Diät bei Ratten zu vergleichbaren Plasma-Homocysteinspiegeln führen (methioninreich: 27,32 ± 2,80 µmol/l; homocystinreich: 40,61 ± 2,22 µmol/l). Als Vergleichsparameter zur Beurteilung pathophysiologischer Veränderungen diente zum einen der Gewebsgehalt an Homocystein, zum anderen wurden die intrazellulären Konzentrationen von S-Adenosyl-Methionin (SAM) und S-Adenosyl-Homocystein (SAH) betrachtet. Es zeigten sich besonders in Leber und Niere signifikante Unterschiede zwischen einer methioninreichen und einer homocystinreichen Diät bei Ratten. Dies ist eine mögliche Erklärung dafür, dass die bei vierwöchiger methioninreicher Diät gefundenen Ergebnisse nicht mit Literaturdaten übereinstimmen. Abschließend wurde der Frage nachgegangen, ob eine homocytinreiche Ernährung, wie in der vorherigen Studie angewandt, überhaupt möglich ist. Da zwar die Gehalte von Methionin in fast allen Lebensmitteln bekannt sind, nicht aber die von Homocystein, wurde untersucht, in welchen Konzentrationen Homocystein in Lebensmitteln enthalten ist. In Schwarzbier (0,03 mg/l), Weißbrot (0,95 mg/kg), Roquefort-Käse (0,50 mg/kg), Thunfisch (0,25 mg/kg) und Schweineleber (0,31 mg/kg) konnte Homocystein bestimmt werden. Da die Homocysteinkonzentrationen in diesen Beispiellebensmitteln mindestens um den Faktor 105 geringer waren als die Methioninkonzentrationen ist ein Einfluss von alimentärem Homocystein auf den Plasmaspiegel sehr unwahrscheinlich. Es wurde weiterhin geprüft, ob durch Darmbakterien ein Teil des alimentär aufgenommenen Methionins bereits im Dünndarm in Homocyt(e)in umgewandelt werden könnte. Dabei wurde eine vermehrte Homocysteinproduktion nach Methionin-Zugabe zu Dünndarmisolaten gefunden. Quantitativ kommt dieser Homocysteinquelle eine untergeordnete Bedeutung zu.

Much attention has been recently devoted to sensorially active substances affecting beer quality in the Czech Republic and worldwide. Among them, the heterocyclic and sulphur containing compounds play an important role, some of them with high sensorial activity even in extremely low concentrations. Trace amounts of these compounds, which can be frequently found in foods, participate in formation of their aroma and this effect can be generally evaluated as favorable However, in malt or beer it is true only to a limited extent and the presence of heterocyclic and sulphur containing compounds are in this respect assessed rather unfavorably. The aim of the present study was to provide a survey about of problems in the field of sulphur containing compounds in barley, malt and beer, to describe metabolic paths leading to their formation and to verify experimentally possibilities of their determination using modern analytical methods. Sulphur-containing amino acids are a natural part of barley, malt and beer and are precursors of the origin of volatile sulphur substances. The most frequently occurring sulphur amino acids, metionine, cysteine and homocysteine, were selected for analytical monitoring. The method of gas chromatography was used to determine sulphur-containing amino acids in barley, malt and beer. Prior to the analysis, sulphur-containing amino acids were derived and volatile N(O,S)-ethoxycarbonyl propyl esters were formed; they were subsequently analyzed using the gas chromatography with mass detector (GC/ MSD) and the gas chromatography with flame photo detector (GC/ FPD). Direct analysis of sulphur volatile substances is possible only rarely as they are found in the analyzed matrices (malt, beer) only in very low concentrations ( g/kg,l - ng/kg,l). Before the analysis, the analytes must be extracted from the matrix and concentrated. The modern analytical methods SPME (Solid Phase Micro Extraction), SPDE (Solid Phase Dynamic Extraction) and TDAS (Thermal Desorption Autosampler) were experimentally compared for the extraction and subsequent concentration of sulphur volatile substances. The method of gas chromatography with flame photo detector was used to determine sulphur volatile substances. Following volatile sulphur substances were monitored: dimethyl sulphide, dimethyl disulphide, dimethyl trisulphide, carbon disulphide, ethyl sulphide, diethyl disulphide, methionol, 3-methylthiophen, ethyl thioacetate, 2-methyl-1-buthanthiol. Only metionine was detected in significant amounts in the barley samples analyzed. Not only content but also dependence on a variety and locality were studied. Further, changes in methionine, cysteine and PDMS content during malting were followed. Results proved a significant decline in these substances content depending on the kilning temperature. Three types of fibers were tested for the analyses of the selected volatile sulphur substances in beer in the SPME method. PEG - a fiber with stationary phase Carbowax, PDMS - a fiber with stationary phase polydimethylsiloxan and a combined fiber CAR/PDMS - Carboxen and polydimethylsiloxan. Carbon disulphide, methionol, dimethyl sulphide, 3-methylthiophen and diethyl disulphide were detected with this method. Content of the other analyzed volatile sulphur substances was below the limit of detection. Further was tested usage the SPDE and TDAS methods. Both methods appear to be the suitable for the determination of volatile sulphur substances in beer.

Die vorliegende Untersuchung diente, nach der grundlegenden Vorgehensweise im Rahmen des exponentiellen N-Verwertungsmodelles (GEBHARDT 1966, Samadi und Liebert 2008), die Aminosäurewirksamkeit beim Masthähnchen unter spezifischer Fokussierung der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin und Cystein zu bewerten und neue Erkenntnisse zum Idealprotein-Konzept beim Mastgeflügel zu erhalten. Dazu wurden Stoffwechsel- und Wachstumsversuche mit männlichen Ross 308 Broilerküken in jeweils zwei Altersperioden (Starter- und Growerperiode) durchgeführt. Die Beantwortung der komplexen Fragestellung erforderte ein Herangehen in drei separaten Versuchskomplexen, die folgende Zielstellungen umfassten: Untersuchungskomplex I: Ermittlung des NMR (N-Erhaltungsbedarf) und NRmaxT (theoretisches maximales N-Retentionsvermögen) Untersuchungskomplex II: vergleichende Bertachtung der Methioninwirksamkeit zweier Methioninquellen (DL-Methionin (DLM) und 2-Hydroxy-4-methylthiobuttersäure (MHA)) und Ermittlung des Methioninbedarfs in Abhängigkeit vom Met:Cys-Verhältnis Untersuchungskomplex III: Ableitung eines idealen Aminosäurenverhältnisses unter Betrachtung der Aminosäuren Lysin, Threonin, Tryptophan, Arginin, Isoleucin und Valin Folgende Resultate wurden erzielt: NMR und NRmaxT Der in einem N-Bilanzversuch ermittelte N-Erhaltungsbedarf (NMR) für Ross 308 Broiler betrug für die Altersperiode 10. - 20. LT 295 mg/LMkg0,67 pro Tag und für die Altersperiode 25. - 35. LT 313 mg/LMkg0,67 pro Tag. Da die Ergebnisse, des in beiden Altersabschnitten analysierten N-Erhaltungsbedarfes sehr ähnlich waren, wurde der Mittelwert dieser beiden Parameter eruiert. Der durchschnittliche, als Arbeitswert für den täglichen N-Erhaltungsbedarf angenommene NMR betrug, für die unter der Studie betrachtete Genetik, somit 304 mg/LMkg0,67 pro Tag. Die Bewertung des theoretischen Potentials für die tägliche N-Retention (NRmaxT) männlicher Broilerküken der genetischen Herkunft Ross 308 entsprach für die Altersperiode 10. - 20. LT 3991mg/LMkg0,67 pro Tag und 3110 mg/LMkg0,67 pro Tag für die Altersperiode 25. - 35. LT. Die Ergebnisse demonstrierten, dass das genetische Potential zur Proteindeposition wachsender Broiler mit zunehmendem Alter sank. Methionin-Wirksamkeit Gegenüber der Negativkontrolle konnte durch die DL-Methionin- / MHA-Zulagen bzw. DL-Methionin- / MHA-Zulagen in Kombination mit Cystein der tägliche Zuwachs und der Futteraufwand signifikant verbessert werden. Beim Vergleich der relativen Wirksamkeit von DLM und MHA in dieser Arbeit zeigt sich eine Überlegenheit des DLM in allen Mischungen, mit Ausnahme der zweiten Met+Cys-Supplementationsstufe in der Growerperiode, bei der eine Wirksamkeit von 100 erzielt wurde. Die MHA-Wirksamkeit variierte in einem Bereich zwischen 62% und 100% in Abhängigkeit vom Met:Cys-Verhältnis und dem Gehalt an Met bzw. Cys in der Diät. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass mit zunehmendem Anteil an Methionin sowie innerhalb des Methioninlevels ein zunehender Anteil an Cystein in der Diät, die Wirksamkeit von MHA relativ zu DLM senkte. Ableitungen zum täglichen Methioninbedarf Die abgeleiteten Werte zum täglichen Methioninbedarf bezogen sich auf einen Rohproteinansatz von 6 - 10g/d (Starter) bzw. 12 - 20g/d (Grower) und lagen in einem Bereich von: 244 - 498 mg/LMkg0,67pro LT bei einer Met-Wirksamkeit von 157 (Starter, 10. 21. LT) 230 - 500 mg/LMkg0,67pro LT bei einer Met-Wirksamkeit von 196 (Grower, 25. 35. LT) Danach benötigte ein Broiler mit einer mittleren Lebendmasse von 500g zur Realisierung eines täglichen Proteinansatzes von 6 - 10 mg/d eine Zufuhr von 154 313 mg Met/d und ein Broiler mit einer mittleren Lebendmasse von 1800g zur Realisierung eines täglichen Proteinansatzes von 12 20 mg/d eine Zufuhr von 341 742 mg Met/d. Bei einer täglichen Futteraufnahme von 50g bzw. 130g ergaben sich notwendige Aminosäurekonzentrationen im Futter von 0,26 - 0,57% Methionin bzw. 0,31 - 0,63% Methionin. Für die Methioninbedarfswerte zeigte sich eine bestehende Abhängigkeit zum Met:Cys-Verhältnis bzw. Cys-Gehalt der Futtermischung. Ableitungen zum idealen Aminosäurenverhältnis N-Bilanz- und Wachstumsversuche zur Ermittlung der idealen Aminosäurenverhältnisse wurden durchgeführt. Aus den drei N-Bilanzversuchen ergab sich ein ideales Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val-Verhältnis von 100:61:17:106:59:69 für Broiler in der Altersperiode 10. - 20. LT sowie ein ideales Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val-Verhältnis von 100:65:17:106:65:82 für Broiler in der Altersperiode 25. - 35. LT. Die Ergebnisse bestätigten die schon für Lys:Thr bekannte Altersabhängigkeit. Neue Aspekte ergaben sich jedoch hinsichtlich Ile und Val, bei denen ebenfalls ein altersbedingter Anstieg relativ zum Lys beobachtet wurde. Unter Mittelwertbildung der beiden Wachstumsversuche ergaben sich folgende Aminosäurenverhältnisse: Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val von 100:62:18:95:68:72 für Broiler in der Altersperiode 0. - 21. LT und Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val von 100:73:15:92:73:82 für Broiler in der Altersperiode 21. - 35. LT.

Beneath glycation, oxidation reactions may take place at cereal proteins during production of malt. The extent of oxidative chemical changes at malt proteins has not yet been studied. In the present short communication, malt protein was characterized by the determination of free thiol groups and degree of methionine oxidation as well as the sites that are reactive to covalent modification by 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH, “protein carbonylation”). Protein carbonylation in pale malts was around 1.5 nmol/mg protein and increased with increasing malt colour. Investigations on the protein pellet isolated for determination of carbonylation revealed that solubility and colour may disturb the quantification of carbonyl sites in roasted malts. Free thiols decreased with increasing malt colour already in pale malts (EBC < 10). The formation of methionine sulfoxide (MetSO) was intensified with increasing malt colour. An amount of 7–20% of methionine was converted to MetSO in pale and dark malt, whereas nearly 60% of methionine was oxidized to MetSO in roasted malts. The formation of methionine sulfone was negligible. This study shows that malt proteins suffer from oxidation during kilning, and future studies will have to show whether this supports the pro- or antioxidant activity of malt.

Peptide-bound methionine may transfer oxidative damage from the thioether side chain to the peptide backbone, catalyzing decomposition in general and α-amidation in particular. In the present study, we focused on the reactivity and reaction pathways of peptides. We synthesized model peptides comprising methionine or not and investigated their overall tendency towards decomposition and formation of specific products under conditions mimicking the cooking process at 100°C in buffered solution (pH 6.0) in the presence of redox-active substances such as transition metal ions and reductones. Peptides containing methionine were more susceptible to α-amidation under all oxidative conditions, and the products of N-terminus-directed α-amidation were quantified. Exemplarily, after incubation in the presence of cupric sulfate, about 2.0 mol-% of the overall decomposition of Z-glycylmethionylglycine accounted for the formation of Z-glycinamide, whereas it was below 0.1 mol-% for Z-glycylalanylglycine. Surprisingly and different from previous observations, C-terminus-directed α-amidation was observed for the first time. From Z-glycylmethionylglycine, the respective products were formed in higher amounts than the N-terminus-directed α-amidation product Z-glycinamide under all applied oxidation conditions. The preference of electron transfer from the amino nitrogen bound in the peptide bond directed to the C-terminus may be ascribed to a sterically less demanding hexagonal 3-electron-2-center intermediate during methionine-catalyzed α-amidation.

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