Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-08-29T16:36:16Z No. of bitstreams: 1 2016_FilipeTavaresCarneiro.pdf: 765407 bytes, checksum: 5fc99eafa298ff677c0b62f4a86654a8 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-01T21:37:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FilipeTavaresCarneiro.pdf: 765407 bytes, checksum: 5fc99eafa298ff677c0b62f4a86654a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T21:37:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FilipeTavaresCarneiro.pdf: 765407 bytes, checksum: 5fc99eafa298ff677c0b62f4a86654a8 (MD5) / Hemoplasmas são bactérias que prendem-se frouxamente à membrana plasmática de eritrócitos, podendo parasitar mamíferos domésticos e selvagens. Felídeos são conhecidamente parasitados por Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis, enquanto canídeos são infectados por pelo menos duas espécies de hemoplasmas: Mycoplasma haemocanis e Candidatus Mycoplasma haematoparvum. As hemoplasmoses são de grande relevância na clínica veterinária, tanto por sua distribuição cosmopolita e severidade de sinais clínicos, a depender da espécie do parasita e imunocompetência do hospedeiro, quanto pelo seu potencial zoonótico e de infecção de animais selvagens ameaçados de extinção. O presente trabalho se propôs a investigar quais espécies de hemoplasmas parasitam as diferentes espécies de carnívoros de cativeiro, a fim de esclarecer a epidemiologia da doença nestas espécies. Além disso, a pesquisa visou caracterizar as alterações hematológicas causadas pela infecção por diferentes espécies de micoplasmas hemotrópicos, a fim de estabelecer sua importância clínica para as espécies selvagens e a capacidade dessas espécies de se tornarem reservatório dos agentes estudados. Foram investigadas as amostras de 33 felídeos e 18 canídeos selvagens e observou-se que a ocorrência da infecção por hemoplasmas nessas espécies é de 45,5% e 83,3%, respectivamente. Fatores como faixa etária, gênero ou presença de anemia não apresentaram correlação com a positividade para a infecção. Sendo assim, conclui-se que a infecção por hemoplasmas em carnívoros selvagens tem alta prevalência, a patogenicidade dos agentes é baixa, ou o estágio crônico é mais frequente, resultando na redução de seu diagnóstico. / Hemoplasmas are bacteria able to adhere themselves loosely to the plasma membrane of erythrocytes and may parasitize several species of mammals. There are three known species of hemoplasmas that parasitize domestic and wild cats: Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum and Candidatus Mycoplasma turicensis. Dogs are infected by at least two species of hemoplasmas: Candidatus Mycoplasma haematoparvum and Mycoplasma haemocanis. The hemoplasmoses are very important in the veterinary clinic, either because of its worldwide distribution and severity of clinical signs, depending on parasite species and host immune competence, or due to its zoonotic potential and capability of infecting endangered species. This study set out to investigate which hemoplasmas species parasitize different species of captive wild carnivores in order to clarify the epidemiology of the disease in these species. Furthermore, the research intended to characterize the hematological changes caused by different species of hemotrophic mycoplasmas infection in order to establish their clinical importance to wild species and the capacity of these species to become a reservoir of studied agents. Samples of 33 wild felids and 18 wild canids were investigated and it was observed that the occurrence of hemoplasma infection in these species is 45.5% and 83.3%, respectively. Factors such as age, gender or anemia are not more frequent in animals positive for the infection. Therefore, it is concluded that infection by hemoplasmas in wild carnivores has high prevalence, and either agent pathogenicity is low, or chronic stage is more frequent, resulting in the reduction of diagnosis.

O Brasil possui cerca de 8,6 milhões de caprinos e mais de 90% estão localizados na região nordeste do país. A caprinocultura, devido sua grande adaptabilidade ao diferentes ecossistemas, possui importância social e econômica na região. Nesse contexto inserem-se os micoplasmas que colonizam os caprinos. As micoplasmoses caprinas são amplamente disseminadas mundialmente e possuem relevância socioeconômica na sua criação. A baixa tecnificação das propriedades, falhas na detecção de Mollicutes e a baixa produção cientifica demonstram um cenário preocupante quanto à sanidade do rebanho dessa região. Visto isso, o presente estudo objetivou a pesquisa de micoplasmas em caprinos, por meio da detecção molecular, na região sudoeste do Estado da Bahia, Brasil. Foram aplicados questionários em 12 propriedades e obtenção de amostras por swab da conjuntiva ocular, nasal e vaginal de 132 caprinos. As metodologias da PCR e qPCR foram aplicadas em swabs para a detecção dos Mollicutes de importância na caprinocultura. Foram realizadas análises estatísticas para a identificação de associações entre a presença dos Mollicutes e o manejo dos animais. Observou-se que 70% das propriedades são de criações para corte, 80% eram propriedades comerciais e 90% utilizavam o sistema intensivo de criação. Nas avaliações clínicas 22,7% (30/132), 13,6% (18/132) e 6,8% (9/132) dos animais respectivamente apresentavam linfonodos pré escapular, iguinal e submandibulares alterados. Mucosa genital e ocular hiperêmica foram observadas em 9,8% (13/132) dos animais. Identificou-se por PCR convencional, 67,4% (89/132), 20,8% (26/125) e 6,8% (9/132) das amostras nasais, genitais e oculares respectivamente, presença do DNA de microrganismos da classe Mollicutes. M. agalactiae foi detectado em 4,5% (6/132) das amostras nasais e M. conjunctivae em 1,5% (2/132) das amostras oculares. Não foi detectado DNA por PCR convencional M. mycoides subsp. capri, M. capricolum subsp. capricolum, assim como por qPCR M. capricolum subsp. capripneumoniae. Constatou-se relação positiva entre animais provenientes de sistema intensivo de criação e a PCR convencional positiva para classe Mollicutes em amostras nasais (OR: 6,417; IC: 1,551 26,546). Relação positiva também foi observada entre animais oriundos de propriedades com exploração leiteira e a PCR convencional positiva para classe Mollicutes em amostras oculares (OR: 6,441; IC: 1,235-33,581). Assim como entre animais provenientes de sistema extensivo de criação e a PCR convencional positiva para classe Mollicutes em amostras genitais (OR: 3,900; IC: 1,028 14,796). Não foi observada associação estatisticamente significante na correlação entre as variáveis de interesse e o resultado das PCR convencionais para M. agalactiae em amostras nasais e para M. conjunctivae em amostras oculares. Conclui-se que os micoplasmas estão presentes nas criações de caprinos da região sudoeste da Bahia. A identificação de M. conjunctivae, descrito uma única vez na literatura nacional, que apesar da baixa ocorrência possui caráter endêmico; reforçam ainda mais a necessidade de estudos mais enfatizados na identificação dos micoplasmas assim como a elaboração de um perfil sanitário desse tipo de criação na região nordeste do Brasil. / Brazil has about 8.6 million goats and more than 90% are located in the northeast region of the country. The goat breeding, due to its great adaptability to the different ecosystems, has social and economic importance in the region. In this context, the mycoplasmas that colonize the goats are inserted. Caprine mycoplasmosis is widely disseminated worldwide and has socioeconomic relevance in its creation. The low technification of the properties, failure to detect Mollicutes and the low scientific production demonstrate a worrying scenario regarding the sanity of the herd of this region. Considering this, the present study aimed at the research of mycoplasmas in goats, through molecular detection, in the southwest region of the State of Bahia, Brazil. Questionnaires were applied on 12 properties and swab samples were obtained from the ocular, nasal and vaginal conjunctiva of 132 goats. The PCR and qPCR methodologies were applied in the swabs for the detection of Mollicutes of importance in goat breeding. Statistical analyzes were performed to identify associations between the presence of Mollicutes and the management of the animals. It was observed that 70% of the properties are meat farms, 80% were commercial properties and 90% used the intensive breed system. In the clinical evaluations, 22.7% (30/132), 13.6% (18/132) and 6.8% (9/132) of the animals respectively presented pre-scapular, equine and altered submandibular lymph nodes. Genital and ocular hyperemic mucosa were observed in 9.8% (13/132) of the animals. From the analised swabs, 67.4% (89/132), 20.8% (26/125) and 6.8% (9/132) of the nasal, genital and ocular samples respectively, were identified by PCR, positive for the presence of DNA from microorganisms of the Mollicutes class. M. agalactiae was detected in 4.5% (6/132) of the nasal samples and M. conjunctivae in 1.5% (2/132) of the ocular samples. No DNA was detected by conventional PCR of M. mycoides subsp. capri, M. capricolum subsp. capricolum, as well as by qPCR of M. capricolum subsp. capripneumoniae. A positive correlation was observed between animals from intensive breeding system and conventional PCR positive for Mollicutes class in nasal samples (OR: 6,417; CI: 1,551 - 26,546). Positive correlation was also observed between animals from dairy farms and conventional PCR positive for Mollicutes class in ocular samples (OR: 6,441; CI: 1,235-33,581). As well as between animals from the extensive breeding system and conventional Mollicutes positive PCR in genital samples (OR: 3,900; CI: 1,028 - 14,796). No statistically significant association was observed in the correlation between the variables of interest and the results of conventional PCR for M. agalactiae in nasal samples and for M. conjunctivae in ocular samples. It is concluded that mycoplasmas are present in goat breeding in the southwestern region of Bahia. The identification of M.conjunctivae, described only once in the national literature, which despite the low occurrence has an endemic character; reinforces the need for more focused studies in the identification of mycoplasmas as well as the elaboration of a health profile of this type of breeding in northeastern Brazil.

Orientador: Marcos Rogério André / Resumo: Micoplasmas hemotrópicos (hemoplasmas) são bactérias Gram-negativas que parasitam a superfície de eritrócitos de uma ampla variedade de mamíferos. Mycoplasma wenyonii e ‘Candidatus Mycoplasma haemobos’ são espécies de hemoplasmas relatadas em bovinos, podendo causar anemia hemolítica e redução na produção de carne e leite e, consequentemente, prejuízos econômicos. O presente estudo teve como objetivo investigar a ocorrência de hemoplasmas em bovinos de corte no Pantanal brasileiro, área endêmica para tripanossomíase bovina na América do Sul. Adicionalmente, objetivou-se caracterizar molecularmente os genótipos de hemoplasmas encontrados. Para tal, amostras de sangue e soro de 400 bovinos de corte foram colhidas em cinco propriedades do município de Corumbá, sub-região da Nhecolândia, estado de Mato Grosso do Sul, centro-oeste brasileiro. As amostras de sangue foram submetidas à extração de DNA e a ensaios de PCR convencional para hemoplasmas baseados no gene 16S rRNA. As sequências obtidas foram submetidas a inferências filogenéticas, análises de distância e de diversidade genotípica. O Ensaio Imunoenzimático Indireto (iELISA) mostrou a presença de anticorpos IgG anti-Trypanosoma vivax em 89,75% dos animais amostrados, confirmando a endemicidade para o referido agente na região sob estudo. Dentre as 400 amostras de sangue de bovinos testadas, 2,25% (9/400) mostraram-se positivas na cPCR para hemoplasmas. A análise filogenética das sequências obtidas confirmou a presença de DN... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Hemotrophic mycoplasmas (haemoplasmas) are Gram-negative bacteria that parasitize the surface of erythrocytes of a wide variety of mammals. Mycoplasma wenyonii and 'Candidatus Mycoplasma haemobos' are hemoplasma species reported in cattle, which can cause hemolytic anemia and reduction in meat and milk production and, consequently, economic losses. The present study aimed to investigate the occurrence of haemoplasmas in beef cattle in the Brazilian Pantanal, an area endemic for bovine trypanosomiasis in South America. In addition, the work aimed to characterize molecularly the genotypes of haemoplasmas found. For this purpose, blood and serum samples of 400 beef cattle were collected from five properties in the municipality of Corumbá, sub-region of Nhecolândia, in the state of Mato Grosso do Sul, central-western Brazil. Blood samples were subjected to DNA extraction and cPCR assays for haemoplasmas based on 16S rRNA gene. The sequences obtained were submitted to phylogenetic inferences, distance analysis and genotype diversity. The Indirect Immunoenzymatic Assay (iELISA) showed the presence of anti-Trypanosoma vivax IgG antibodies in 89.75% of the animals sampled, confirming the endemicity for this agent in the studied region. Among the 400 bovine blood samples tested, 2.25% (9/400) were positive in cPCR for haemoplasmas. Phylogenetic analysis of the sequences obtained confirmed the presence of DNA 'C. M. haemobos' and M. wenyonii in 0.5% (2/400) and 1.75% (7/400) animals, r... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O Brasil possui cerca de 8,6 milhões de caprinos e mais de 90% estão localizados na região nordeste do país. A caprinocultura, devido sua grande adaptabilidade ao diferentes ecossistemas, possui importância social e econômica na região. Nesse contexto inserem-se os micoplasmas que colonizam os caprinos. As micoplasmoses caprinas são amplamente disseminadas mundialmente e possuem relevância socioeconômica na sua criação. A baixa tecnificação das propriedades, falhas na detecção de Mollicutes e a baixa produção cientifica demonstram um cenário preocupante quanto à sanidade do rebanho dessa região. Visto isso, o presente estudo objetivou a pesquisa de micoplasmas em caprinos, por meio da detecção molecular, na região sudoeste do Estado da Bahia, Brasil. Foram aplicados questionários em 12 propriedades e obtenção de amostras por swab da conjuntiva ocular, nasal e vaginal de 132 caprinos. As metodologias da PCR e qPCR foram aplicadas em swabs para a detecção dos Mollicutes de importância na caprinocultura. Foram realizadas análises estatísticas para a identificação de associações entre a presença dos Mollicutes e o manejo dos animais. Observou-se que 70% das propriedades são de criações para corte, 80% eram propriedades comerciais e 90% utilizavam o sistema intensivo de criação. Nas avaliações clínicas 22,7% (30/132), 13,6% (18/132) e 6,8% (9/132) dos animais respectivamente apresentavam linfonodos pré escapular, iguinal e submandibulares alterados. Mucosa genital e ocular hiperêmica foram observadas em 9,8% (13/132) dos animais. Identificou-se por PCR convencional, 67,4% (89/132), 20,8% (26/125) e 6,8% (9/132) das amostras nasais, genitais e oculares respectivamente, presença do DNA de microrganismos da classe Mollicutes. M. agalactiae foi detectado em 4,5% (6/132) das amostras nasais e M. conjunctivae em 1,5% (2/132) das amostras oculares. Não foi detectado DNA por PCR convencional M. mycoides subsp. capri, M. capricolum subsp. capricolum, assim como por qPCR M. capricolum subsp. capripneumoniae. Constatou-se relação positiva entre animais provenientes de sistema intensivo de criação e a PCR convencional positiva para classe Mollicutes em amostras nasais (OR: 6,417; IC: 1,551 26,546). Relação positiva também foi observada entre animais oriundos de propriedades com exploração leiteira e a PCR convencional positiva para classe Mollicutes em amostras oculares (OR: 6,441; IC: 1,235-33,581). Assim como entre animais provenientes de sistema extensivo de criação e a PCR convencional positiva para classe Mollicutes em amostras genitais (OR: 3,900; IC: 1,028 14,796). Não foi observada associação estatisticamente significante na correlação entre as variáveis de interesse e o resultado das PCR convencionais para M. agalactiae em amostras nasais e para M. conjunctivae em amostras oculares. Conclui-se que os micoplasmas estão presentes nas criações de caprinos da região sudoeste da Bahia. A identificação de M. conjunctivae, descrito uma única vez na literatura nacional, que apesar da baixa ocorrência possui caráter endêmico; reforçam ainda mais a necessidade de estudos mais enfatizados na identificação dos micoplasmas assim como a elaboração de um perfil sanitário desse tipo de criação na região nordeste do Brasil. / Brazil has about 8.6 million goats and more than 90% are located in the northeast region of the country. The goat breeding, due to its great adaptability to the different ecosystems, has social and economic importance in the region. In this context, the mycoplasmas that colonize the goats are inserted. Caprine mycoplasmosis is widely disseminated worldwide and has socioeconomic relevance in its creation. The low technification of the properties, failure to detect Mollicutes and the low scientific production demonstrate a worrying scenario regarding the sanity of the herd of this region. Considering this, the present study aimed at the research of mycoplasmas in goats, through molecular detection, in the southwest region of the State of Bahia, Brazil. Questionnaires were applied on 12 properties and swab samples were obtained from the ocular, nasal and vaginal conjunctiva of 132 goats. The PCR and qPCR methodologies were applied in the swabs for the detection of Mollicutes of importance in goat breeding. Statistical analyzes were performed to identify associations between the presence of Mollicutes and the management of the animals. It was observed that 70% of the properties are meat farms, 80% were commercial properties and 90% used the intensive breed system. In the clinical evaluations, 22.7% (30/132), 13.6% (18/132) and 6.8% (9/132) of the animals respectively presented pre-scapular, equine and altered submandibular lymph nodes. Genital and ocular hyperemic mucosa were observed in 9.8% (13/132) of the animals. From the analised swabs, 67.4% (89/132), 20.8% (26/125) and 6.8% (9/132) of the nasal, genital and ocular samples respectively, were identified by PCR, positive for the presence of DNA from microorganisms of the Mollicutes class. M. agalactiae was detected in 4.5% (6/132) of the nasal samples and M. conjunctivae in 1.5% (2/132) of the ocular samples. No DNA was detected by conventional PCR of M. mycoides subsp. capri, M. capricolum subsp. capricolum, as well as by qPCR of M. capricolum subsp. capripneumoniae. A positive correlation was observed between animals from intensive breeding system and conventional PCR positive for Mollicutes class in nasal samples (OR: 6,417; CI: 1,551 - 26,546). Positive correlation was also observed between animals from dairy farms and conventional PCR positive for Mollicutes class in ocular samples (OR: 6,441; CI: 1,235-33,581). As well as between animals from the extensive breeding system and conventional Mollicutes positive PCR in genital samples (OR: 3,900; CI: 1,028 - 14,796). No statistically significant association was observed in the correlation between the variables of interest and the results of conventional PCR for M. agalactiae in nasal samples and for M. conjunctivae in ocular samples. It is concluded that mycoplasmas are present in goat breeding in the southwestern region of Bahia. The identification of M.conjunctivae, described only once in the national literature, which despite the low occurrence has an endemic character; reinforces the need for more focused studies in the identification of mycoplasmas as well as the elaboration of a health profile of this type of breeding in northeastern Brazil.

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Nadia Regina Pereira Almosny / Banca: Natalino Hajime Yoshinari / Banca: Jose Mauricio Barbanti Duarte / Banca: Karin Werther / Resumo: Doenças transmitidas por vetores artrópodes são mundialmente importantes para a saúde humana e animal. Recentemente, diversos estudos têm sido realizados a fim de investigar o possível papel dos animais selvagens na epidemiologia destas enfermidades. A identificação de reservatórios selvagens para estes hemoparasitas ajudaria no entendimento da epi enfermidades por eles causadas, principalmente aquelas de caráter zoonótico. O presente estudo teve como objetivo pesquisar em amostras de sangue de carnívoros selvagens mantidos em cativeiro a presença de infecção ou exposição a agentes Anaplasmataceae (Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. ewingii, Neorickettsia risticii, N. helminthoeca, Anaplasma platys e A. phagocytophilum), Rickettsiaceae (Orientia tsutsugamushi e Rickettsia sp. dos Grupos da Febre Maculosa e do Tifo), Babesia sp., Cytauxzoon sp. (somente para os felídeos), micoplasmas hemotróficos (Mycoplasma haemofelis, Candidatus M. haemominutum, Candidatus M. turicensis, M. haemocanis e Candidatus M. haematoparvum) e Hepatozoon sp., utilizando métodos sorológicos e moleculares. Para tal, foram amostrados 167 felídeos e 100 canídeos selvagens mantidos em cativeiro nos estados de São Paulo, Mato Grosso e Distrito Federal. Doze felídeos (7,2%) e três (3%) canídeos mostraram-se soropositivos frente ao antígeno de E. canis. Apenas um canídeo (1%) mostrou-se soropositivo para A. phagocytophilum. Nenhum animal mostrou-se soropositivo para E. chaffeensis ou N. risticii. A análise filogenética baseada em um fragmento de 350 pb do gene 16S rRNA não foi suficientemente robusta para diferenciar entre as espécies de Ehrlichia spp. Os fragmentos de DNA de Ehrlichia spp. encontrados em quatro felídeos foram posicionados em um ramo distinto daquela de E. canis e E. chaffeensis, com base... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Vector-borne diseases are worldwide important to human and animal health. Recently, several studies have been done aiming to investigate the role of wild animals in the epidemiology of these diseases. The identification of wild reservoirs for these hemoparasites would help in a better understanding of the epidemiology of these diseases, mainly that with zoonotic character. The present work aimed to investigate the presence of infection or exposure to Anaplasmataceae (Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. ewingii, Neorickettsia risticii, N. helminthoeca, Anaplasma platys e A. phagocytophilum) and Rickettsiaceae (Orientia tsutsugamushi and Spotted Fever and Typhus Group Rickettsia sp.), Babesia sp., Cytauxzoon sp., hemotrophic hemoplasmas (Mycoplasma haemofelis, Candidatus M. haemominutum, Candidatus M. turicensis, M. haemocanis e Candidatus M. haematoparvum) and Hepatozoon sp. in captive wild carnivores blood samples by molecular and serological methods. Blood samples were collected from 167 wild felids and 100 wild canids, maintained in captivity in zoos from São Paulo and Mato Grosso states, and Distrito Federal. Twelve felids (7.2%) and three canids (3%) were seropositive to E. canis. Only one canid (1%) was seropositive to A. phagocytophilum. None was seropositive to E. chaffeensis neither N. risticii. The phylogenetic analysis of 350bp of 16S rRNA gene was not sufficiently robust to support the differentiation of Ehrlichia species. The Ehrlichia spp. DNA found in four felids was in a distinct clade from E. chaffeensis and E. canis by omp-1 phylogenetic analysis. The phylogenetic analysis of dsb gene showed the infection by E. canis in one sampled crab-eating fox. Seventeen felids (10%) and ten canids (10%) was positive to Anaplasma spp. PCR, which was in the same clade than A. phagocytophilum and A. platys by... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-05T13:27:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Cecília Da Cunha Camilo.pdf: 1238897 bytes, checksum: e26e3eb86bc9e96ee8e82757d4858f3e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-05T13:28:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Cecília Da Cunha Camilo.pdf: 1238897 bytes, checksum: e26e3eb86bc9e96ee8e82757d4858f3e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-05T13:28:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Cecília Da Cunha Camilo.pdf: 1238897 bytes, checksum: e26e3eb86bc9e96ee8e82757d4858f3e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-05T13:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Cecília Da Cunha Camilo.pdf: 1238897 bytes, checksum: e26e3eb86bc9e96ee8e82757d4858f3e (MD5) Previous issue date: 2012-12-06 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Mycoplasmas are microorganisms lacking cell walls with reduced ability Biosintética, which makes them extremely fastidious growth. The strength of these microorganisms to antimicrobials used in his therapy as tetracyclines, macrolides and quinolones have been reported with increased frequency. The determination of antimicrobial susceptibility is particularly difficult because not shown in broth turbidity which complicates the standardization of the inoculum and are extremely susceptible pH conditions. The method most commonly used for this purpose is based on metabolic inhibition using specific substrates. This study evaluated the susceptibility of isolates of Mycoplasma hominis and Ureaplasma sp. stored in the period from 2011 to 2012. The methodology used for the isolation comprised culture techniques, for storage and freezing of the strains we used selective broth enriched PPLO and BHI, Thawing of isolates was succeeded subculture in broth enriched selective and differential agar A7 for phenotypic characterization. Quantification, identification and antimicrobial susceptibility testing was performed using the the triage system Mycofast Evolution ® Screening (Elitech Group), whose identification is based on bacterial susceptibility by Identibiotiqué system. The susceptibility of the isolates was determined against antimicrobial agents Doxiciclina 8 μg/ml, Roxitromicina 4 μg/ml and Ofloxacina 4 μg/ml, widely used in the empirical treatment of patients with urogenital tract infections. Our study showed high level of resistance of the isolates to doxicycline and ofloxacin. This is the first study involving isolation and susceptibility profile of these agents undertaken in the Amazonia. / Micoplasmas são microrganismos desprovidos de parede celular, com reduzida capacidade Biossintética, o que os torna extremamente fastidiosos ao crescimento. A resistência destes microrganismos aos agentes antimicrobianos utilizados na sua terapia como as tetraciclinas, macrolídeos e quinolonas tem sido relatadas com frequência cada vez maior. A determinação da susceptibilidade a antimicrobianos é particularmente difícil porque não mostram turbidez em caldo o que dificulta a padronização do inóculo e são extremamente susceptíveis as condições de pH. A metodologia utilizada para este fim baseia-se na inibição metabólica utilizando substratos específicos. O presente trabalho avaliou a susceptibilidade de isolados de Mycoplasma hominis e Ureaplasma sp. arrmazenados no período de 2011 a 2012. A metodologia utilizada englobou técnicas de cultura; para a estocagem e congelamento das cepas empregou-se caldo seletivo enriquecido PPLO e BHI, O descongelamento dos isolados foi sucedido de subcultivos em caldos enriquecidos seletivos diferenciais e Agar A7 para caracterização fenotípica. A quantificação, a identificação e o teste de susceptibilidade a antimicrobianos foi realizada através do sistema de triagem Mycofast® Screening Evolution (Elitech Group), cuja identificação se baseia na susceptibilidade bacteriana pelo sistema Identibiotiqué. A susceptibilidade dos isolados foi determinada frente aos antimicrobianos doxiciclina 8 μg/ml, roxitromicina 4 μg/ml e ofloxacina 4 μg/ml, amplamente utilizados no tratamento empírico de pacientes com infecções do trato urogenital. Nosso estudo detectou alto nível de resistência dos isolados armazenados para doxiciclina e ofloxacina. Este é o primeiro estudo envolvendo isolamento e o perfil de susceptibilidade destes agentes realizado na região norte.

Com o objetivo de avaliar a freqüência de infecção por micoplasmas hemotrópicos em gatos com linfoma e seu impacto na ocorrência de anemias nesses animais, foram analisadas amostras sangüíneas de 14 animais com diagnóstico de linfoma, sem qualquer tratamento prévio e 14 amostras de sangue de gatos hígidos, por meio da técnica de PCR-Nested. Utilizaram-se primers que amplificam fragmentos do gene 16S rRNA dos micoplasmas. Eritrograma e bioquímica sérica foram realizados, assim como testes sorológicos imunoenzimáticos (ELISA) para ambos os retrovírus. Anemia foi observada em 28,6% (4/14) dos gatos com linfoma. Em dois a anemia foi classificada como normocítica normocrômica não regenerativa, e em outros dois como macrocitica normocrômica não regenerativa. A freqüência de infecção pelos micoplasmas hemotrópicos felinos nos gatos com linfoma foi de 7,14% (1/14). Após seqüenciamento e posterior prova de identidade no GenBank, o agente foi identificado como M. haemofelis, número de acesso FJ544859. A freqüência de infecção pelos retrovírus foi de 21,42% para o FeLV e 7,14% (3/14) para o FIV. O animal infectado pelo M. haemofelis não apresentou anemia, ainda que apresentasse infecção concomitante pelo FeLV. O grupo controle não apresentou infecção por micoplasmas ou retrovírus. Nas condições em que este estudo foi realizado, concluiu-se que a anemia observada nos gatos com linfoma não foi ocasionada pela infecção por micoplasmas hemotrópicos, mas provavelmente em decorrência das alterações hematológicas promovidas pelo processo neoplásico, associadas ou não à infecção pelo FeLV. Portanto, a infecção pelos micoplasmas não apresentou um impacto direto na ocorrência de anemias em gatos com linfoma. / To evaluate the frequency of infection by hemotropic mycoplasmas in cats with lymphoma and its impact in the development of anaemia in those animals, blood samples from 14 animals diagnosed with Lymphoma and without any previous treatment and 14 blood samples from healthy cats were analyzed by means of the PCR-Nested technique. Primers were utilized and selectively amplified fragments of 16SrRNA gene of mycoplasma. Haematology, serum biochemical profile and FeLV/FIV ELISA were performed in all 28 cats. Anaemia was observed in 28.6% (4/14) of the cats with lymphoma. In two of them, anaemia was classified as normocytic-normochromic nonregenerative and in the other two as macrocytic-normochromic nonregenerative. The frequency of feline haemotropic mycoplasmas infection in cats with lymphoma was 7.14% (1/14). After sequencing and identity proof by the GenBank, the agent was identified as M. haemofelis, access number FJ544859. The frequency of retrovirus infection among all the cats with lymphoma was 21.42% (3/14) for FeLV and 7.14% (1/14) for FIV. The cat infected by M. haemofelis was also infected with FeLV, but was not anaemic. The 14 cats used as control did not exhibited infection by mycoplasmas or retrovirus infections. Under the conditions in which this study was developed, one can conclude that the anaemia observed in cats with lymphoma may not be related to hemotropic microplasmas infection, but to haematologyc alterations promoted by the associated neoplasic process and/or the occurrence or of FeLV infection. Therefore, the infection by the mycoplasmas did not present a direct impact in the occurrence of anaemies in cats with limphoma.

Com o objetivo de avaliar a freqüência de infecção por micoplasmas hemotrópicos em gatos com linfoma e seu impacto na ocorrência de anemias nesses animais, foram analisadas amostras sangüíneas de 14 animais com diagnóstico de linfoma, sem qualquer tratamento prévio e 14 amostras de sangue de gatos hígidos, por meio da técnica de PCR-Nested. Utilizaram-se primers que amplificam fragmentos do gene 16S rRNA dos micoplasmas. Eritrograma e bioquímica sérica foram realizados, assim como testes sorológicos imunoenzimáticos (ELISA) para ambos os retrovírus. Anemia foi observada em 28,6% (4/14) dos gatos com linfoma. Em dois a anemia foi classificada como normocítica normocrômica não regenerativa, e em outros dois como macrocitica normocrômica não regenerativa. A freqüência de infecção pelos micoplasmas hemotrópicos felinos nos gatos com linfoma foi de 7,14% (1/14). Após seqüenciamento e posterior prova de identidade no GenBank, o agente foi identificado como M. haemofelis, número de acesso FJ544859. A freqüência de infecção pelos retrovírus foi de 21,42% para o FeLV e 7,14% (3/14) para o FIV. O animal infectado pelo M. haemofelis não apresentou anemia, ainda que apresentasse infecção concomitante pelo FeLV. O grupo controle não apresentou infecção por micoplasmas ou retrovírus. Nas condições em que este estudo foi realizado, concluiu-se que a anemia observada nos gatos com linfoma não foi ocasionada pela infecção por micoplasmas hemotrópicos, mas provavelmente em decorrência das alterações hematológicas promovidas pelo processo neoplásico, associadas ou não à infecção pelo FeLV. Portanto, a infecção pelos micoplasmas não apresentou um impacto direto na ocorrência de anemias em gatos com linfoma. / To evaluate the frequency of infection by hemotropic mycoplasmas in cats with lymphoma and its impact in the development of anaemia in those animals, blood samples from 14 animals diagnosed with Lymphoma and without any previous treatment and 14 blood samples from healthy cats were analyzed by means of the PCR-Nested technique. Primers were utilized and selectively amplified fragments of 16SrRNA gene of mycoplasma. Haematology, serum biochemical profile and FeLV/FIV ELISA were performed in all 28 cats. Anaemia was observed in 28.6% (4/14) of the cats with lymphoma. In two of them, anaemia was classified as normocytic-normochromic nonregenerative and in the other two as macrocytic-normochromic nonregenerative. The frequency of feline haemotropic mycoplasmas infection in cats with lymphoma was 7.14% (1/14). After sequencing and identity proof by the GenBank, the agent was identified as M. haemofelis, access number FJ544859. The frequency of retrovirus infection among all the cats with lymphoma was 21.42% (3/14) for FeLV and 7.14% (1/14) for FIV. The cat infected by M. haemofelis was also infected with FeLV, but was not anaemic. The 14 cats used as control did not exhibited infection by mycoplasmas or retrovirus infections. Under the conditions in which this study was developed, one can conclude that the anaemia observed in cats with lymphoma may not be related to hemotropic microplasmas infection, but to haematologyc alterations promoted by the associated neoplasic process and/or the occurrence or of FeLV infection. Therefore, the infection by the mycoplasmas did not present a direct impact in the occurrence of anaemies in cats with limphoma.

Orientador: Márcia Guimarães da Silva / Resumo: Introdução: A infecção da cavidade amniótica e inflamação são associadas com o parto pré-termo espontâneo. Em geral, essas infecções são polibacterianas e causadas principalmente pela ascensão bacteriana do trato genital inferior. Dessa forma, a invasão microbiana da cavidade amniótica e o risco do parto pré-termo estão frequentemente relacionados à colonização vaginal por diferentes espécies bacterianas, incluindo aquelas de difícil cultivo, como micoplasmas genitais. Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis são as principais bactérias isoladas no líquido amniótico de gestações complicadas por parto pré-termo com membranas íntegras ou na presença de rotura prematura de membranas pré-termo. Além dos micoplasmas genitais, Gardnerella vaginalis merece destaque por ser a principal bactéria do core patológico da vaginose bacteriana e por estar associada ao risco de parto pré-termo. Dessa forma, considerando que a infecção da cavidade amniótica é de natureza polibacteriana, mimetizar esse cenário em membranas fetais in vitro se torna ferramenta importante para melhor entendimento dos mecanismos envolvidos no parto pré-termo. Objetivo: Avaliar a modulação da resposta imune induzida pela interação entre micoplasmas genitais e G. vaginalis nas membranas corioamnióticas in vitro. Material e Métodos: Para a estimulação da cultura in vitro, foram coletadas 8 membranas corioamnióticas de gestantes que tiveram a resolução da gestação por cesárea eletiva de termo (≥ 37 semanas de gestaç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: The intraamniotic infection and inflammation are associated with spontaneous preterm birth (PTB). In general, such infections are polybacterial and caused mainly by ascending bacteria from the lower genital tract. Thus, the microbial invasion of the amniotic cavity (MIAC) and risk of preterm birth is often cervicovaginal colonizers such as genital mycoplasmas, in which Mycoplasma hominis (MH) and Ureaplasma urealyticum (UU) are the most commonly isolated bacteria in the amniotic fluid in both PTB with intact membranes and in preterm premature rupture of membranes (pPROM). In addition, Gardnerella vaginalis, the main microorganism of the pathological core of bacterial vaginosis is also closely associated with the risk of preterm birth. Thus, considering that the infection of the amniotic cavity is polybacterial, mimic this scenario in fetal membranes in vitro becomes an important tool for a better understanding of the mechanisms that trigger preterm delivery. Objective: To evaluate the modulation of the immune response induced by the interaction between genital mycoplasmas and G. vaginalis in chorioamniotic membranes in vitro. Material and methods: For the in vitro culture stimulation, 8 chorioamniotic membranes of pregnant women in term elective cesarean section (≥ 37 weeks gestation) were collected, in the absence of labor and/or premature rupture of membranes. Chorioamniotic membrane cultures were stimulated with 106 or 103UFC of heat inactivated bacterial sus... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Nathália Mayumi Noda Nicolau (nathaliamnicolau@gmail.com) on 2017-09-13T13:25:01Z No. of bitstreams: 1 Tese completa corrigida 13.09.17.pdf: 3318366 bytes, checksum: f767ed1c0946c7bf469c1036a88b2a8a (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-09-15T13:29:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nicolau_nmn_dr_bot.pdf: 3318366 bytes, checksum: f767ed1c0946c7bf469c1036a88b2a8a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T13:29:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nicolau_nmn_dr_bot.pdf: 3318366 bytes, checksum: f767ed1c0946c7bf469c1036a88b2a8a (MD5) Previous issue date: 2017-08-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Introdução: A infecção da cavidade amniótica e inflamação são associadas com o parto pré-termo espontâneo. Em geral, essas infecções são polibacterianas e causadas principalmente pela ascensão bacteriana do trato genital inferior. Dessa forma, a invasão microbiana da cavidade amniótica e o risco do parto pré-termo estão frequentemente relacionados à colonização vaginal por diferentes espécies bacterianas, incluindo aquelas de difícil cultivo, como micoplasmas genitais. Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis são as principais bactérias isoladas no líquido amniótico de gestações complicadas por parto pré-termo com membranas íntegras ou na presença de rotura prematura de membranas pré-termo. Além dos micoplasmas genitais, Gardnerella vaginalis merece destaque por ser a principal bactéria do core patológico da vaginose bacteriana e por estar associada ao risco de parto pré-termo. Dessa forma, considerando que a infecção da cavidade amniótica é de natureza polibacteriana, mimetizar esse cenário em membranas fetais in vitro se torna ferramenta importante para melhor entendimento dos mecanismos envolvidos no parto pré-termo. Objetivo: Avaliar a modulação da resposta imune induzida pela interação entre micoplasmas genitais e G. vaginalis nas membranas corioamnióticas in vitro. Material e Métodos: Para a estimulação da cultura in vitro, foram coletadas 8 membranas corioamnióticas de gestantes que tiveram a resolução da gestação por cesárea eletiva de termo (≥ 37 semanas de gestação), na ausência de trabalho de parto e/ou rotura prematura de membranas. As culturas das membranas corioamnióticas foram estimuladas com 106 ou 103 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de suspensão bacteriana, inativada pelo calor, diluída em meio de cultura de tecidos com U. urealyticum, M. hominis e G. vaginalis isolados ou em combinação. Amostras de membranas corioamnióticas, apenas com o meio de cultura, sem estímulo bacteriano foram usadas como controle negativo. Como controle positivo foi utilizado o lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli. Os sobrenadantes obtidos das culturas de membranas corioamnióticas, após 24 horas de estimulação bacteriana, foram avaliados pela tecnologia Luminex® xMAPTM utilizando um painel para as seguintes citocinas e receptores: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF, sIL-1R1, sIL-1R2, sIL-6R, sTNF-R1, sTNF-R2. Além disso, pela técnica de ELISA foi avaliado o receptor solúvel sgp130, e por imunohistoquímica, a imunomarcação dos receptores de membrana mIL-6R e gp130 nas células coriônicas e no epitélio amniótico. A análise estatística para os dados de citocinas e receptores solúveis foi feita utilizando modelos de feitos mistos lineares usando a biblioteca Ime4 da linguagem de programação R. Os dados de imunohistoquímica foram avaliadas usando a análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey, em que, o valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significante. O software empregados nessas análises foi o GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Resultados: A estimulação das membranas por micoplasmas genitais não aumentou a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-8, TNF-α, GM-CSF), exceto a estimulação com U. urealyticum que aumentou os níveis de IL-8. No entanto, a estimulação com U. urealyticum e M. hominis aumentaram significativamente os níveis de IL-10 e IL-13. A estimulação das membranas corioamnióticas por G. vaginalis isoladamente ou em combinação com micoplasmas genitais resultou em aumento de citocinas pró e anti-inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF). Quanto a produção de IL-6, todos os grupos aumentaram significativamente com relação ao controle não estimulado, com exceção ao estímulo com M. hominis isolado. Já os níveis de sIL-6R aumentaram significativamente somente com estímulo por U. urealyticum isolado ou em combinação com M. hominis. Além disso, o receptor solúvel sgp130 se apresentou em níveis elevados em todos os tratamentos, com exceção do tratamento com G. vaginalis isolada ou na combinação das três espécies bacterianas em cargas iguais. A análise imunohistoquímica mostrou maior imunorreatividade do receptor de membrana mIL-6R apenas nas células do âmnio na presença de LPS e G. vaginalis em comparação com o controle (p <0,0001), mas não para os grupos de M. hominis, U. urealitycum e estimulações polibacterianas. Além disso, o gp130 aumentou estatisticamente nas células do âmnio e cório estimuladas com LPS, G. vaginalis e todos os tratamento polibacterianos. Conclusões: Membranas corioamnióticas in vitro produzem perfil distinto de citocinas e receptores pró e anti-inflamatórios em resposta à estimulação por micoplasmas genitais e G. vaginalis isolados ou em combinação. G. vaginalis estimula resposta pró-inflamatória nas membranas fetais in vitro, que após 24 horas é regulada pela atividade anti-inflamatória da IL-6 através da via de sinalização clássica. Micoplasmas genitais induzem controle da resposta inflamatória pela produção de IL-13, IL-10 e sTNF-R2 favorecendo sua sobrevivência na cavidade amniótica. Além disso, o aumento de IL-6 por si só pode não ser indicativo de qualquer função, uma vez que a sua atividade é controlada por diferentes receptores de membrana e solúveis, sendo que sua produção pelas membranas fetais não deve ser mediador funcional das vias indutoras de trabalho de parto. A tentativa de correlacionar o risco de desfecho gestacional adverso baseado exclusivamente nos níveis de IL-6 em fluidos biológicos, sem considerar os receptores de IL-6, podem ser ineficazes. / Introduction: The intraamniotic infection and inflammation are associated with spontaneous preterm birth (PTB). In general, such infections are polybacterial and caused mainly by ascending bacteria from the lower genital tract. Thus, the microbial invasion of the amniotic cavity (MIAC) and risk of preterm birth is often cervicovaginal colonizers such as genital mycoplasmas, in which Mycoplasma hominis (MH) and Ureaplasma urealyticum (UU) are the most commonly isolated bacteria in the amniotic fluid in both PTB with intact membranes and in preterm premature rupture of membranes (pPROM). In addition, Gardnerella vaginalis, the main microorganism of the pathological core of bacterial vaginosis is also closely associated with the risk of preterm birth. Thus, considering that the infection of the amniotic cavity is polybacterial, mimic this scenario in fetal membranes in vitro becomes an important tool for a better understanding of the mechanisms that trigger preterm delivery. Objective: To evaluate the modulation of the immune response induced by the interaction between genital mycoplasmas and G. vaginalis in chorioamniotic membranes in vitro. Material and methods: For the in vitro culture stimulation, 8 chorioamniotic membranes of pregnant women in term elective cesarean section (≥ 37 weeks gestation) were collected, in the absence of labor and/or premature rupture of membranes. Chorioamniotic membrane cultures were stimulated with 106 or 103UFC of heat inactivated bacterial suspension diluted in tissue culture medium with U. Urealyticum, M. hominis and G. vaginalis alone or in combination. Unstimulated samples were used as control in which was included only culture media without bacteria, and as positive control was used Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli. The supernatants obtained from the chorioamnionic membrane cultures after 24 hours were evaluated by Luminex xMAP technology using a panel for the following cytokines and receptors: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF, sIL-1R1, sIL-1R2, sIL-6R, sTNF-R1, sTNF-R2. In addition, the soluble receptor sgp130 was evaluated by the ELISA technique, and by immunohistochemistry we identified membrane receptors, mIL-6R and gp130, in the amnion and chorion cells. Statistical analysis for cytokine and soluble receptors data were performed using linear mixed-effects models using the lme4 library of the R statistical language. Immunohistochemistry data were evaluated using one-way (ANOVA) followed by Tukey's test, in which the value of p <0.05 was considered statistically significant and the software used was GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Results: The stimulation of genital mycoplasmas did not increase the proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-8, TNF-α, GM-CSF), except U. urealyticum that increased IL-8 levels. However, U. urealyticum and M. hominis significantly increased IL-10 and IL-13 levels. G. vaginalis alone or in combination with genital mycoplasmas showed an increased pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF). Considering the IL-6 production, all groups increased significantly compared to the control, except M. hominis isolated. Moreover, sIL-6R levels increased significantly only in the presence of U. urealyticum alone or in combination with M. hominis. In addition, the soluble sgp130 receptor was elevated in all treatments, except for the treatment with G. vaginalis alone or in combination of the three bacteria in equal loads. Immunohistochemistry analysis showed greater intensity of mIL-6R only in amnion cells in the presence of LPS and G. vaginalis compared to control (p <0.0001) but not for M. hominis, U. urealitycum and polybacterial treatments. In addition, gp130 increased statistically in amnion cells stimulated with LPS, GV and all polybacterial treatments. Conclusions: Chorioamniotic membranes in vitro produce a distinct cytokine and pro- and anti-inflammatory profile in response to stimulation by genital mycoplasmas and G. vaginalis alone or in combination. G. vaginalis sustain a proinflammatory response in the fetal membranes in vitro, in which after 24 hours is regulated by the anti-inflammatory activity of IL-6 through the classical signaling pathway. While genital mycoplasmas induce a control of the inflammatory response, by the production of anti-inflammatory cytokines (IL-13, IL-10, sTNF-R2), favoring their survival in the amniotic cavity. Furthermore, the increase of IL-6 alone may not be indicative of any function, since its activity is controlled by different membrane and soluble receptors, since its production by fetal membranes could not be a functional mediator of the labor-inducing pathways. In summary, the attempt to correlate the risk of adverse gestational outcome based exclusively on IL-6 levels in biological fluids without considering IL-6 receptors may be ineffective. / CNPq: 140857/2013-3