Introdução: Os cânceres de mama subtipos Luminal A e B (HER2 negativo) podem apresentar prognóstico variável, a depender do índice de proliferação, avaliado pelo Ki67. As células malignas e as células estromais adjacentes (fibroblastos e células de resposta imune ) podem interagir tanto pelo contato célula a célula como por fatores secretados por elas, ambas influenciando no comportamento tumoral. Já foi demonstrado que as células estromais podem aumentar a proliferação das células do câncer da mama. Objetivo: Nosso objetivo foi avaliar o perfil de expressão gênica de células do estroma em câncer de mama luminal A e luminal B e analisar se este se correlaciona com o prognóstico da doença. Pacientes e Métodos/ Resultados: Amostras de tumores de 11 pacientes na pós menopausa foram analisadas, todas elas HER2 negativas. A expressão de Ki67 foi <= 10 % em 5 pacientes (luminal A) e >= 30 % em outras 6 amostras(Luminal B ). Células estromais foram microdissecadas para a extração de RNA, que posteriormente foi hibridizado na plataforma de microarray Agilent G485 -1A GE 8x60K. Após a normalização, 50 % dos genes com a maior variância foram selecionados para análise por SAM duas classes desemparelhado (software TMEV ) e aceitando FDR 14.1%, 35 sequências foram identificadas como diferencialmente expressas, incluindo 16 genes conhecidos, entre as células estromais das amostras de Luminal A versos Luminal B, todos mais expressos nas amostras B. Dentre as funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos encontram-se regulação positiva do sistema imune, incluindo genes como ZAP70 (proteína quinase 70kDa associada a cadeia zeta (TCR)), CD38 (molécula CD38); UBASH3A (ubiquitina associada e SH3 domínio que contém A); PLA2G7 (fosfolipase A2, grupo VII (fator acetil ativador de plaquetas no plasma)); NCR3 (citotoxicidade natural, provocando receptor 3). Nosso próximo passo foi avaliar se a expressão de alguns genes selecionados estava associada com prognóstico de tumores luminais. Para tal selecionamos amostras de outro grupo de 89 pacientes com seguimento de pelo menos 5 anos, cujos tumores eram ER(+), HER2(-), para análise de expressão proteica em Tissue microarray. Caracterizamos os fibroblastos destas amostras com 3 marcadores de fibroblastos: actina de músculo liso (AML), S100A4 e caveolina-1 (CAV1) e analisamos a marcação da proteína ZAP70. Correlacionamos a expressão proteica de todos os marcadores com as características anatomopatológicas da amostra. Observamos que fibroblastos de todas as amostras de tumor de mama expressam AML, S100A4 e CAV1, em diferentes proporções, entretanto não detectamos diferença entre os tumores luminais A e B. Também não obsevamos diferença de expressão de AML, S100A4 e CAV1 em relação a grau histológico, comprometimento linfonodal e estadiamento clínico. Nestas amostras não detectamos expressão proteica de ZAP70 em fibroblastos tumorais. Conclusão: Houve expressão diferencial de 16 genes relacionados a processos imunes, todos eles mais expressos em células estromais de tumores Luminal B em relação a luminal A / Introduction: Luminal breast cancer subtypes A and B (HER2 negative) may present a variable prognosis, depending on tumor proliferation index, evaluated by Ki67 expression. Malignant cells and adjacent stromal cells (fibroblasts and immune response cells) may interact by both cell contact and secreted factors and influence tumor behavior. It was shown that stromal cells may enhance breast cancer cells proliferation. Objective: Our aim was to evaluate stromal cells gene expression profile in luminal A and luminal B tumors and to evaluate whether selected transcripts expressed in stromal cells may be associated with prognosis in breast cancer. Material/ Methods and Results: Hormone receptor positive tumor samples from 11 post menopausal patients were analyzed, all of them Her2 negative. Ki67 expression <= 10% (luminal A) was observed in five and Ki67 >= 30% (luminal B) in six samples. Stromal cells were microdissected for RNA extraction, which was hybridized in Agilent G485-1A GE 8x60K microarray platform. After normalization, 50% of the genes with the highest variance were selected for further analysis by two class unpaired SAM (TMEV software) and accepting FDR 14,1%, 35 sequences, including 16 known genes, were found differentially expressed between stromal cells from luminal A vs luminal B breast cancer samples, all of them more expressed in luminal B. Among biological functions enriched in genes found differentially expressed were positive regulation of immune system process, including genes as: ZAP70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa); CD38 (CD38 molecule); UBASH3A (ubiquitin associated and SH3 domain containing A); PLA2G7 (phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma); NCR3 (natural cytotoxicity triggering receptor 3). Our next step was evaluate whether expression of selected genes was associated with prognosis in another group of patients. Tumor samples from 89 patients with at least 5 years of follow up, all of them estrogen receptor positive and HER2 negative, were selected. Tissue microarray was prepared with stromal tumor compartment from paraffin embedded tumor samples. Fibroblasts were characterized for the expression of 3 fibroblasts markers (alfa-SMA, alpha smooth muscel actin; S100A4 and CAV1, caveolin 1), and ZAP70. Correlation of expression of these markers with prognostic variables was determined. Expression of alfa-SMA, S100A4 and CAV1 was detected in fibroblasts from all tumor samples in different proportions, however no differential expression was observed between luminal A and B tumors. Neither difference was detected on the expression of these proteins in relation with histological grade, lymph node involvement and clinical stage. Conclusion: A differential expression of 16 genes involved in immune process was found, all of them more expressed in fibroblasts from luminal B as compared with luminal A tumors

Introdução: Em câncer de mama, existem evidências de que o microambiente pode influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário, bem como em metástases regionais e a distância. Neste contexto, fibroblastos são importantes células estromais que podem influenciar a proliferação e a migração de células do câncer e podem prover um nicho apropriado para o desenvolvimento tumoral. Objetivos:O principal objetivo deste trabalho é comparar células estromais obtidas do tumor primário (PT), metástase linfonodal (N+) e medula óssea (BM) de pacientes com câncer de mama, através do perfil de expressão gênica. Pacientes e Métodos: Foi analisada a expressão gênica de fibroblastos (cultura primária) de 11 pacientes com câncer de mama. O perfil de expressão foi determinado em PT (n=4), N+(n=3) e BM (n=4) através de uma plataforma de cDNA microarray customizada (contendo 4.800 sequencias imobilizadas, representando cerca de 4600 genes), e os genes diferencialmente expressos foram identificados pelo teste SAM multiclasse, seguido pelo teste SAM de duas classes (TMEV, FDR 0%). A análise funcional foi realizada pelo software DAVID v6.7. Validação técnica foi realizada em 6 amostras previamente analisadas no microarray e a validação biológica em fibroblastos obtidos de outros 16 pacientes utilizando-se de RT-qPCR. Resultados: O perfil de expressão gênica dos fibroblastos obtidos de diferentes sítios mostraram 267 genes diferencialmente expressos, os quais apropriadamente agruparam os fibroblastos de acordo com suas origens (PT vs. N+ vs. BM). Apesar das diferenças entre PT e N+ serem representadas por 20 genes, as diferenças entre PT vs. BM e N+ vs BM foram mais significantes (235 e 245 genes diferencialmente expressos respectivamente). Análise funcional dos genes diferencialmente expressos mostrou enriquecimento de funções relacionadas ao desenvolvimento e morfogênese.A seguir, a expressão de alguns genes selecionados foi analisada em uma série diferente de amostras (validação biológica). Desse modo observamos que NOTCH2 confirmou uma alta expressão em N+ (vs. PT), e ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 e USP16 confirmaram alta expressão em BM (vs PT). Conclusão:Em pacientes com câncer de mama, células estromais obtidas de diferentes origens apresentam um perfil de expressão gênica diferencial, o qual pode influenciar o comportamento do tumor / may influence tumor development in the primary site of breast cancer, as well as in regional and distant metastatic sites. In this context, fibroblasts are important stromal cells which influence proliferation and migration of cancer cells and may also provide an appropriate niche to tumor development. Objectives: The main objective of this work is the comparison of stromal cells from the primary tumor (PT), lymph node metastasis (N+) and bone marrow (BM) obtained from breast cancer patients, through gene expression profile. Patients and Methods: The gene expression profile was analyzed in fibroblasts primary culture from 11 breast cancer patients. The expression profiles of PT cells (n=4), N+ cells (n=3) and BM cells (n=4) were determined through a customized cDNA microarray platform (containing 4800 immobilized sequences which represents 4600 genes approximately). The analysis were performed by SAM multiclass (TMEV; FDR 0%), followed by SAM two classes test (TMEV; FDR 0%). Functional analysis was performed using DAVID v6.7. Technical validation was performed in same 6 samples that were previously analyzed in microarray experiments and biological validation was performed in fibroblasts obtained from other group of 16patients by RT-qPCR Results: The expression profile of fibroblasts obtained from three sites revealed 267 differentially expressed genes, which appropriately clustered fibroblasts in three different branches, in accordance with their origin (PT vs. N+ vs. BM). Although the differences between PT and N+ were represented by 20 genes, differences between PT vs. BM and N+ vs. BM were more significant (235 and 245 differentially expressed genes respectively). Functional analysis revealed enrichment of functions related to development and morphogenesis. Afterwards, the expression of some selected genes were analyzed in a different batch of samples (biological validation).Thereby, NOTCH2 confirmed high expression in N+ (vs. PT), and ADCY2, HECTD1, HNMT, LOX, MACF1 and USP16 confirmed high expression in BM (vs. PT). Conclusion: In breast cancer patients, stromal cells obtained from different origins present a differential gene expression profile, which may influence tumor behavior