Nos últimos anos houve um aumento da expectativa de vida de indivíduos com síndrome de Down, com causas de morte que diferem da população em geral. Alguns estudos mostraram que a resposta imunológica difere ao longo da vida com alterações relacionadas ao envelhecimento. O gene RCAN1 (regulador de calcineurina tipo 1), localizado na região q22.12 no cromossomo 21 é descrito como responsável pelo fenótipo da SD. O gene RCAN1 inibe a ação da calcineurina, responsável pela desfosforilação do fator nuclear de células T ativadas (NFAT), uma etapa essencial para a ativação de genes responsáveis pela expressão de citocinas. A consequência é uma possível diminuição da resposta imune efetora. Em adultos com síndrome de Down as respostas imunes humoral e celular têm sido pouco investigadas. Apesar da superexpressão do gene RCAN1 já ter sido descrita em diversos tecidos, sua expressão em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de adultos não foi ainda avaliada. Os objetivos deste estudo foram avaliar aspectos humorais e celulares da resposta imune, avaliar a expressão quantitativa do gene RCAN1 e relacionar os achados com a produção de citocinas. O grupo de estudo foi composto de adultos com síndrome de Down (SD) com cariótipo de trissomia livre (n=24), um grupo controle (CTR) composto de deficientes mentais com outras etiologias (n=21) e um grupo de indivíduos saudáveis (n=8), como parâmetros para alguns experimentos. Os grupos SD e CTR convivem na Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE-SP). Foram realizados hemogramas e sorologias para detecção de hepatite B, citomegalovírus, mononucleose infecciosa, toxoplasmose, rubéola, sarampo, PCR, fração de complemento C3, C4, antiestreptolisina O e dosagem de imunoglobulinas IgG, IgM e IgA. Células mononucleares foram obtidas por gradiente de Ficoll-Hypaque e submetidas à cultura celular, análise quantitativa de expressão gênica de RCAN1 e avaliação imunofenotípica por citometria de fluxo. Os sobrenadantes da cultura foram coletados para dosagem das citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF e INF. Os resultados deste estudo mostraram que a frequência de sorologias positivas para os vários agentes infecciosos e os demais parâmetros imunológicos foram comparáveis nos dois grupos de doentes mentais. A análise imunofenotípica dos indivíduos com SD mostrou aumento de células NK, de linfócitos TCD8+, alteração na relação CD4:CD8 (1:1) e diminuição de linfócitos B (CD19+) quando comparados ao grupo controle (p<0,05). A produção espontânea de INF, TNF e IL-10 foi maior no grupo SD em relação ao grupo CTR (p<0,05). Porém, quanto à expressão do gene RCAN1, não foi observada diferença entre os dois grupos analisados. O estudo do perfil imunológico humoral e celular de adultos com síndrome de Down provenientes da APAE-SP permitiu concluir que não houve diferenças quanto aos aspectos humorais avaliados nos dois grupos (SD e CTR). Quanto aos aspectos celulares, a imunofenotipagem sugere um possível sinal de envelhecimento precoce do sistema imune e a produção de citocinas um predomínio de perfil pró-inflamatório. Contudo, o perfil de citocinas não apresenta relação com o nível de expressão do gene RCAN1. / In recent years there has been an increase in life expectancy of individuals with Down´s syndrome (DS), with death causes differ from the general population. Some studies have shown that the immune response differs throughout life with changes related to aging. The RCAN1 gene (regulator of calcineurin type 1), located in the q22.12 region of chromosome 21 is described as responsible for the phenotype of DS. The gene RCAN1 inhibits the calcineurin activity, responsible for the dephosphorylation of the nuclear factor of activated T cells (NFAT), an essential step for the activation of the genes responsible for cytokines expression. The consequence is a possible reduction of the effector immune response. In adults with DS, the humoral and cellular immune responses have not been throughly investigated. Although the overexpression of the RCAN1 gene has already been described in many tissues, its expression in mononuclear cells of peripheral blood (PBMC) of adults with DS has not been evaluated. The objectives of this study were to evaluate aspects of humoral and cellular immune response, evaluate the quantitative expression of the RCAN1 gene and correlate the findings with the production of cytokines. The study group consisted of adults with Down´s syndrome (DS) with free trisomy karyotype (n = 24), a control group (CTR) composed of the mentally disabled of other etiologies (n = 21) and a group of healthy subjects (n = 8), as parameters for some experiments. The SD and CTR groups are followed in Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE-SP). It was evaluated Hemogram and serology for detection of hepatitis B, cytomegalovirus, infectious mononucleosis, toxoplasmosis, rubella, measles, cRP, complement fraction C3, C4, antistreptolysin O and IgG, IgM and IgA immunoglobulin isotypes. The mononuclear cells were obtained by Ficoll-Hypaque gradient and the cells were cultured without stimuli, analyzed for the quantitative gene expression of RCAN1 and evaluated for immunophenotyping by flow cytometry. The culture supernatants were collected for measurement of cytokines IL-2, IL-4, IL-5, IL- 10, TNF and IFN.The results of this study showed that the frequency of positive tests for various infectious agents and other immunological parameters were comparable in both groups (DS and CTR). Immunophenotyping of individuals with DS showed an increase in NK cells, CD8 + lymphocytes, changes in CD4: CD8 ratio (1:1) and decreased B lymphocytes (CD19 +) when compared to the control group (p <0.05). The DS group had a spontaneous production of IFN, TNF and IL-10 higher than the CTR group (p<0.05). However, there was not any difference in RCAN1 gene expression (mRNA) between the two groups of the mentally disabled. The humoral and cellular immune profile in adults with Down´s syndrome from APAE-SP showed that there was no difference in the humoral aspects assessed in both groups (SD and CTR). For the cellular aspects, the immunophenotyping suggests a possible sign of premature aging of the immune system and the cytokine production show a proinflammatory profile. Nevertheless, this cytokines profile is not associated with level of expression of the RCAN1 gene.

Nos últimos anos houve um aumento da expectativa de vida de indivíduos com síndrome de Down, com causas de morte que diferem da população em geral. Alguns estudos mostraram que a resposta imunológica difere ao longo da vida com alterações relacionadas ao envelhecimento. O gene RCAN1 (regulador de calcineurina tipo 1), localizado na região q22.12 no cromossomo 21 é descrito como responsável pelo fenótipo da SD. O gene RCAN1 inibe a ação da calcineurina, responsável pela desfosforilação do fator nuclear de células T ativadas (NFAT), uma etapa essencial para a ativação de genes responsáveis pela expressão de citocinas. A consequência é uma possível diminuição da resposta imune efetora. Em adultos com síndrome de Down as respostas imunes humoral e celular têm sido pouco investigadas. Apesar da superexpressão do gene RCAN1 já ter sido descrita em diversos tecidos, sua expressão em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de adultos não foi ainda avaliada. Os objetivos deste estudo foram avaliar aspectos humorais e celulares da resposta imune, avaliar a expressão quantitativa do gene RCAN1 e relacionar os achados com a produção de citocinas. O grupo de estudo foi composto de adultos com síndrome de Down (SD) com cariótipo de trissomia livre (n=24), um grupo controle (CTR) composto de deficientes mentais com outras etiologias (n=21) e um grupo de indivíduos saudáveis (n=8), como parâmetros para alguns experimentos. Os grupos SD e CTR convivem na Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE-SP). Foram realizados hemogramas e sorologias para detecção de hepatite B, citomegalovírus, mononucleose infecciosa, toxoplasmose, rubéola, sarampo, PCR, fração de complemento C3, C4, antiestreptolisina O e dosagem de imunoglobulinas IgG, IgM e IgA. Células mononucleares foram obtidas por gradiente de Ficoll-Hypaque e submetidas à cultura celular, análise quantitativa de expressão gênica de RCAN1 e avaliação imunofenotípica por citometria de fluxo. Os sobrenadantes da cultura foram coletados para dosagem das citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF e INF. Os resultados deste estudo mostraram que a frequência de sorologias positivas para os vários agentes infecciosos e os demais parâmetros imunológicos foram comparáveis nos dois grupos de doentes mentais. A análise imunofenotípica dos indivíduos com SD mostrou aumento de células NK, de linfócitos TCD8+, alteração na relação CD4:CD8 (1:1) e diminuição de linfócitos B (CD19+) quando comparados ao grupo controle (p<0,05). A produção espontânea de INF, TNF e IL-10 foi maior no grupo SD em relação ao grupo CTR (p<0,05). Porém, quanto à expressão do gene RCAN1, não foi observada diferença entre os dois grupos analisados. O estudo do perfil imunológico humoral e celular de adultos com síndrome de Down provenientes da APAE-SP permitiu concluir que não houve diferenças quanto aos aspectos humorais avaliados nos dois grupos (SD e CTR). Quanto aos aspectos celulares, a imunofenotipagem sugere um possível sinal de envelhecimento precoce do sistema imune e a produção de citocinas um predomínio de perfil pró-inflamatório. Contudo, o perfil de citocinas não apresenta relação com o nível de expressão do gene RCAN1. / In recent years there has been an increase in life expectancy of individuals with Down´s syndrome (DS), with death causes differ from the general population. Some studies have shown that the immune response differs throughout life with changes related to aging. The RCAN1 gene (regulator of calcineurin type 1), located in the q22.12 region of chromosome 21 is described as responsible for the phenotype of DS. The gene RCAN1 inhibits the calcineurin activity, responsible for the dephosphorylation of the nuclear factor of activated T cells (NFAT), an essential step for the activation of the genes responsible for cytokines expression. The consequence is a possible reduction of the effector immune response. In adults with DS, the humoral and cellular immune responses have not been throughly investigated. Although the overexpression of the RCAN1 gene has already been described in many tissues, its expression in mononuclear cells of peripheral blood (PBMC) of adults with DS has not been evaluated. The objectives of this study were to evaluate aspects of humoral and cellular immune response, evaluate the quantitative expression of the RCAN1 gene and correlate the findings with the production of cytokines. The study group consisted of adults with Down´s syndrome (DS) with free trisomy karyotype (n = 24), a control group (CTR) composed of the mentally disabled of other etiologies (n = 21) and a group of healthy subjects (n = 8), as parameters for some experiments. The SD and CTR groups are followed in Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE-SP). It was evaluated Hemogram and serology for detection of hepatitis B, cytomegalovirus, infectious mononucleosis, toxoplasmosis, rubella, measles, cRP, complement fraction C3, C4, antistreptolysin O and IgG, IgM and IgA immunoglobulin isotypes. The mononuclear cells were obtained by Ficoll-Hypaque gradient and the cells were cultured without stimuli, analyzed for the quantitative gene expression of RCAN1 and evaluated for immunophenotyping by flow cytometry. The culture supernatants were collected for measurement of cytokines IL-2, IL-4, IL-5, IL- 10, TNF and IFN.The results of this study showed that the frequency of positive tests for various infectious agents and other immunological parameters were comparable in both groups (DS and CTR). Immunophenotyping of individuals with DS showed an increase in NK cells, CD8 + lymphocytes, changes in CD4: CD8 ratio (1:1) and decreased B lymphocytes (CD19 +) when compared to the control group (p <0.05). The DS group had a spontaneous production of IFN, TNF and IL-10 higher than the CTR group (p<0.05). However, there was not any difference in RCAN1 gene expression (mRNA) between the two groups of the mentally disabled. The humoral and cellular immune profile in adults with Down´s syndrome from APAE-SP showed that there was no difference in the humoral aspects assessed in both groups (SD and CTR). For the cellular aspects, the immunophenotyping suggests a possible sign of premature aging of the immune system and the cytokine production show a proinflammatory profile. Nevertheless, this cytokines profile is not associated with level of expression of the RCAN1 gene.

Introdução: Os cânceres de mama subtipos Luminal A e B (HER2 negativo) podem apresentar prognóstico variável, a depender do índice de proliferação, avaliado pelo Ki67. As células malignas e as células estromais adjacentes (fibroblastos e células de resposta imune ) podem interagir tanto pelo contato célula a célula como por fatores secretados por elas, ambas influenciando no comportamento tumoral. Já foi demonstrado que as células estromais podem aumentar a proliferação das células do câncer da mama. Objetivo: Nosso objetivo foi avaliar o perfil de expressão gênica de células do estroma em câncer de mama luminal A e luminal B e analisar se este se correlaciona com o prognóstico da doença. Pacientes e Métodos/ Resultados: Amostras de tumores de 11 pacientes na pós menopausa foram analisadas, todas elas HER2 negativas. A expressão de Ki67 foi <= 10 % em 5 pacientes (luminal A) e >= 30 % em outras 6 amostras(Luminal B ). Células estromais foram microdissecadas para a extração de RNA, que posteriormente foi hibridizado na plataforma de microarray Agilent G485 -1A GE 8x60K. Após a normalização, 50 % dos genes com a maior variância foram selecionados para análise por SAM duas classes desemparelhado (software TMEV ) e aceitando FDR 14.1%, 35 sequências foram identificadas como diferencialmente expressas, incluindo 16 genes conhecidos, entre as células estromais das amostras de Luminal A versos Luminal B, todos mais expressos nas amostras B. Dentre as funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos encontram-se regulação positiva do sistema imune, incluindo genes como ZAP70 (proteína quinase 70kDa associada a cadeia zeta (TCR)), CD38 (molécula CD38); UBASH3A (ubiquitina associada e SH3 domínio que contém A); PLA2G7 (fosfolipase A2, grupo VII (fator acetil ativador de plaquetas no plasma)); NCR3 (citotoxicidade natural, provocando receptor 3). Nosso próximo passo foi avaliar se a expressão de alguns genes selecionados estava associada com prognóstico de tumores luminais. Para tal selecionamos amostras de outro grupo de 89 pacientes com seguimento de pelo menos 5 anos, cujos tumores eram ER(+), HER2(-), para análise de expressão proteica em Tissue microarray. Caracterizamos os fibroblastos destas amostras com 3 marcadores de fibroblastos: actina de músculo liso (AML), S100A4 e caveolina-1 (CAV1) e analisamos a marcação da proteína ZAP70. Correlacionamos a expressão proteica de todos os marcadores com as características anatomopatológicas da amostra. Observamos que fibroblastos de todas as amostras de tumor de mama expressam AML, S100A4 e CAV1, em diferentes proporções, entretanto não detectamos diferença entre os tumores luminais A e B. Também não obsevamos diferença de expressão de AML, S100A4 e CAV1 em relação a grau histológico, comprometimento linfonodal e estadiamento clínico. Nestas amostras não detectamos expressão proteica de ZAP70 em fibroblastos tumorais. Conclusão: Houve expressão diferencial de 16 genes relacionados a processos imunes, todos eles mais expressos em células estromais de tumores Luminal B em relação a luminal A / Introduction: Luminal breast cancer subtypes A and B (HER2 negative) may present a variable prognosis, depending on tumor proliferation index, evaluated by Ki67 expression. Malignant cells and adjacent stromal cells (fibroblasts and immune response cells) may interact by both cell contact and secreted factors and influence tumor behavior. It was shown that stromal cells may enhance breast cancer cells proliferation. Objective: Our aim was to evaluate stromal cells gene expression profile in luminal A and luminal B tumors and to evaluate whether selected transcripts expressed in stromal cells may be associated with prognosis in breast cancer. Material/ Methods and Results: Hormone receptor positive tumor samples from 11 post menopausal patients were analyzed, all of them Her2 negative. Ki67 expression <= 10% (luminal A) was observed in five and Ki67 >= 30% (luminal B) in six samples. Stromal cells were microdissected for RNA extraction, which was hybridized in Agilent G485-1A GE 8x60K microarray platform. After normalization, 50% of the genes with the highest variance were selected for further analysis by two class unpaired SAM (TMEV software) and accepting FDR 14,1%, 35 sequences, including 16 known genes, were found differentially expressed between stromal cells from luminal A vs luminal B breast cancer samples, all of them more expressed in luminal B. Among biological functions enriched in genes found differentially expressed were positive regulation of immune system process, including genes as: ZAP70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa); CD38 (CD38 molecule); UBASH3A (ubiquitin associated and SH3 domain containing A); PLA2G7 (phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma); NCR3 (natural cytotoxicity triggering receptor 3). Our next step was evaluate whether expression of selected genes was associated with prognosis in another group of patients. Tumor samples from 89 patients with at least 5 years of follow up, all of them estrogen receptor positive and HER2 negative, were selected. Tissue microarray was prepared with stromal tumor compartment from paraffin embedded tumor samples. Fibroblasts were characterized for the expression of 3 fibroblasts markers (alfa-SMA, alpha smooth muscel actin; S100A4 and CAV1, caveolin 1), and ZAP70. Correlation of expression of these markers with prognostic variables was determined. Expression of alfa-SMA, S100A4 and CAV1 was detected in fibroblasts from all tumor samples in different proportions, however no differential expression was observed between luminal A and B tumors. Neither difference was detected on the expression of these proteins in relation with histological grade, lymph node involvement and clinical stage. Conclusion: A differential expression of 16 genes involved in immune process was found, all of them more expressed in fibroblasts from luminal B as compared with luminal A tumors

Introdução: Os cânceres de mama subtipos Luminal A e B (HER2 negativo) podem apresentar prognóstico variável, a depender do índice de proliferação, avaliado pelo Ki67. As células malignas e as células estromais adjacentes (fibroblastos e células de resposta imune ) podem interagir tanto pelo contato célula a célula como por fatores secretados por elas, ambas influenciando no comportamento tumoral. Já foi demonstrado que as células estromais podem aumentar a proliferação das células do câncer da mama. Objetivo: Nosso objetivo foi avaliar o perfil de expressão gênica de células do estroma em câncer de mama luminal A e luminal B e analisar se este se correlaciona com o prognóstico da doença. Pacientes e Métodos/ Resultados: Amostras de tumores de 11 pacientes na pós menopausa foram analisadas, todas elas HER2 negativas. A expressão de Ki67 foi <= 10 % em 5 pacientes (luminal A) e >= 30 % em outras 6 amostras(Luminal B ). Células estromais foram microdissecadas para a extração de RNA, que posteriormente foi hibridizado na plataforma de microarray Agilent G485 -1A GE 8x60K. Após a normalização, 50 % dos genes com a maior variância foram selecionados para análise por SAM duas classes desemparelhado (software TMEV ) e aceitando FDR 14.1%, 35 sequências foram identificadas como diferencialmente expressas, incluindo 16 genes conhecidos, entre as células estromais das amostras de Luminal A versos Luminal B, todos mais expressos nas amostras B. Dentre as funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos encontram-se regulação positiva do sistema imune, incluindo genes como ZAP70 (proteína quinase 70kDa associada a cadeia zeta (TCR)), CD38 (molécula CD38); UBASH3A (ubiquitina associada e SH3 domínio que contém A); PLA2G7 (fosfolipase A2, grupo VII (fator acetil ativador de plaquetas no plasma)); NCR3 (citotoxicidade natural, provocando receptor 3). Nosso próximo passo foi avaliar se a expressão de alguns genes selecionados estava associada com prognóstico de tumores luminais. Para tal selecionamos amostras de outro grupo de 89 pacientes com seguimento de pelo menos 5 anos, cujos tumores eram ER(+), HER2(-), para análise de expressão proteica em Tissue microarray. Caracterizamos os fibroblastos destas amostras com 3 marcadores de fibroblastos: actina de músculo liso (AML), S100A4 e caveolina-1 (CAV1) e analisamos a marcação da proteína ZAP70. Correlacionamos a expressão proteica de todos os marcadores com as características anatomopatológicas da amostra. Observamos que fibroblastos de todas as amostras de tumor de mama expressam AML, S100A4 e CAV1, em diferentes proporções, entretanto não detectamos diferença entre os tumores luminais A e B. Também não obsevamos diferença de expressão de AML, S100A4 e CAV1 em relação a grau histológico, comprometimento linfonodal e estadiamento clínico. Nestas amostras não detectamos expressão proteica de ZAP70 em fibroblastos tumorais. Conclusão: Houve expressão diferencial de 16 genes relacionados a processos imunes, todos eles mais expressos em células estromais de tumores Luminal B em relação a luminal A / Introduction: Luminal breast cancer subtypes A and B (HER2 negative) may present a variable prognosis, depending on tumor proliferation index, evaluated by Ki67 expression. Malignant cells and adjacent stromal cells (fibroblasts and immune response cells) may interact by both cell contact and secreted factors and influence tumor behavior. It was shown that stromal cells may enhance breast cancer cells proliferation. Objective: Our aim was to evaluate stromal cells gene expression profile in luminal A and luminal B tumors and to evaluate whether selected transcripts expressed in stromal cells may be associated with prognosis in breast cancer. Material/ Methods and Results: Hormone receptor positive tumor samples from 11 post menopausal patients were analyzed, all of them Her2 negative. Ki67 expression <= 10% (luminal A) was observed in five and Ki67 >= 30% (luminal B) in six samples. Stromal cells were microdissected for RNA extraction, which was hybridized in Agilent G485-1A GE 8x60K microarray platform. After normalization, 50% of the genes with the highest variance were selected for further analysis by two class unpaired SAM (TMEV software) and accepting FDR 14,1%, 35 sequences, including 16 known genes, were found differentially expressed between stromal cells from luminal A vs luminal B breast cancer samples, all of them more expressed in luminal B. Among biological functions enriched in genes found differentially expressed were positive regulation of immune system process, including genes as: ZAP70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa); CD38 (CD38 molecule); UBASH3A (ubiquitin associated and SH3 domain containing A); PLA2G7 (phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma); NCR3 (natural cytotoxicity triggering receptor 3). Our next step was evaluate whether expression of selected genes was associated with prognosis in another group of patients. Tumor samples from 89 patients with at least 5 years of follow up, all of them estrogen receptor positive and HER2 negative, were selected. Tissue microarray was prepared with stromal tumor compartment from paraffin embedded tumor samples. Fibroblasts were characterized for the expression of 3 fibroblasts markers (alfa-SMA, alpha smooth muscel actin; S100A4 and CAV1, caveolin 1), and ZAP70. Correlation of expression of these markers with prognostic variables was determined. Expression of alfa-SMA, S100A4 and CAV1 was detected in fibroblasts from all tumor samples in different proportions, however no differential expression was observed between luminal A and B tumors. Neither difference was detected on the expression of these proteins in relation with histological grade, lymph node involvement and clinical stage. Conclusion: A differential expression of 16 genes involved in immune process was found, all of them more expressed in fibroblasts from luminal B as compared with luminal A tumors