Le microbiote intestinal humain a été fortement corrélé avec la santé humaine et les maladies et a montré un potentiel dans les développements thérapeutiques. La métagénomique a déjà montré qu'elle était capable de générer beaucoup de données, dont certaines sont dénuées de sens et constituaient la "matière noire". Alors culturomics a été développée pour compléter la métagénomique en ciblant des espèces bactériennes précédemment non cultivées. En utilisant la culturomics, nous avons décrit le microbiote intestinal humain des Pygmées et réussi à isoler un nombre significatif d'espèces bactériennes parmi lesquelles 38 étaient de nouvelles espèces. En comparant les résultats métagénomiques aux données culturomics, on constate que seulement 26% des espèces isolées ont été récupérées par métagénomique et que jusqu'à 59% des Operational taxonomic units détectées correspondaient à de nouvelles espèces bactériennes isolées par culturomique dans cette étude ou dans les précédentes. / The human gut microbiota has been correlated in general health and diseases. Thus its description became mandatory to better understand its role and therapeutic potential. However, metagenomics has previously showed to be able to generate a lot of data, of which some are meaningless and constituted the “Dark matter”. Thus, culturomics was developed to complement metagenomics by targeting previously uncultured bacterial species. Using culturomics, we described the human gut microbiota of Pygmy people and succeeded in isolating a significant number of bacterial species out of which 38 were new species. Comparing metagenomics results to culturomics data, we see that only 26% of the isolated species were recovered by metagenomics and that up to 59% of the Operational taxonomic units detected corresponded to new bacterial species isolated by culturomics either in this study or in previous ones.

Depuis la fin des années 1980, de nombreuses études épidémiologiques ont montré une association positive et indépendante entre les maladies cardiovasculaires et les maladies parodontales. Les maladies parodontales, responsables de bactériémies transitoires et répétées, ont la capacité d’initier ou d’aggraver les lésions d’athérosclérose. Deux mécanismes pathogéniques majeurs sont aujourd’hui avancés. L’un est indirect par augmentation des médiateurs de l’inflammation induite par les parodontites et l’autre est direct lié au microbiote oral. Cette hypothèse majeure repose sur deux mécanismes non exclusifs, la translocation des bactéries parodontales au sein des plaques d’athérosclérose par la circulation générale et sur la modification du microbiote intestinal. L’objectif de la thèse était d'explorer l'association entre l’exposition systémique aux bactéries parodontales et leur présence au sein des plaques d’athérosclérose sur les complications cardio- et neuro-vasculaires chez l’homme. Les résultats obtenus montrent que les bactéries parodontales sont associées à un phénotype vulnérable des plaques d’athérosclérose coronariennes et carotidiennes. Les lésions d’athérosclérose compliquées par des hémorragies intraplaques sont le siège d’une activation plus intense des neutrophiles. Les effets délétères des leucocytes sur les tissus vasculaires sont potentiellement augmentés et entretenus par les bactéries majorant la vulnérabilité à la rupture des plaques d’athérosclérose. La confirmation clinique de la relation biologique entre le microbiote parodontal et les complications cardio- et neuro-vasculaires de l’athérosclérose est une perspective importante de cette thèse. / Since the late 1980s, many epidemiological studies have shown a positive and independent association between cardiovascular disease and periodontal disease. Periodontal disease inducing transient bacteraemia, can initiate or worsen atherosclerotic lesions. Two major pathophysiologic mechanisms are supported by evidence. One is by indirect increase in inflammatory systemic periodontitis-induced mediators and the other is directly related to the oral microbiota. This major hypothesis is based on two non-exclusive mechanisms, the translocation of periodontal bacteria in atherosclerotic plaques by the general circulation and the impact on the gut microbiota.The aim of the thesis was to explore the association between systemic exposure to periodontal bacteria and their presence in atherosclerotic plaques on the cardiovascular and neurovascular complications in human.The results obtained show that periodontal bacteria are associated to a vulnerable phenotype of coronary and carotid atherosclerotic plaques. Atherosclerotic lesions complicated by intraplaque haemorrhage are the trigger of a super activation of neutrophils. The deleterious effects of leukocytes to the vascular tissues are potentially increased and maintained by the bacteria which increase the atherosclerotic plaques vulnerability to rupture.The clinical confirmation of the biological relationship between periodontal microbiota and cardio- and neurovascular complications of atherosclerosis is an important perspective of this thesis.

Les microorganismes colonisent et modulent l'ensemble des niches écologiques disponibles sur terre, incluant celles d'hôtes métazoaires. Les contributions des microorganismes dans les systèmes hôte-microbiote sont un aspect essentiel pour comprendre l'ontogénèse et l'évolution de ces systèmes. L'interconnectivité de l'hôte et de son microbiote est soulignée par le concept d'holobionte, qui présente les organismes et leur microbiote comme une unité évolutive et fonctionnelle. Diverses études menées sur des Insectes présentant des régimes alimentaires spécifiques, tels que les phytophages et les hématophages, ont clairement établi la contribution cruciale des symbiotes à la régulation du métabolisme et à l'adaptation de l'hôte à sa niche écologique spécifique. Cependant, chez les Insectes polyphages, comme la Mouche soldat noire (*Hermetia illucens*), qui doivent faire face à une grande diversité de substrats alimentaires présentant chacun ses propres défis nutritionnels, les rôles fonctionnels des communautés du microbiote sont moins clairement établis. La Mouche soldat noire est un Insecte économiquement important à cause de son usage industriel pour faire le surcyclage de résidus organiques et la production de protéines animales de qualités. Il existe donc un fort intérêt pour comprendre le rôle du microbiote dans la bioconversion et l'ontogénie de la Mouche soldat noire, dans un but d'optimisation des productions. De plus, le modèle de la Mouche soldat noire présente un intérêt fondamental pour remettre en perspective la théorie de l'holobionte chez un organisme qui présente de fortes variations du microbiote. L'objectif global de ce projet de thèse était de comprendre le rôle du microbiote dans l'ontogénèse de la Mouche soldat noire et détailler les facteurs modulant son assemblage. Dans un premier temps, l'étude du différentiel d'expression du transcriptome entre des larves avec ou sans microbiote (i.e. axéniques) a permis de démontrer des profils d'expression de gènes microbiote-dépendant pour l'hôte. Le microbiote régule positivement la transcription de gènes dans les voies métaboliques du métabolisme des glucides, le système endocrinien, le métabolisme des lipides, le système nerveux, le système sensoriel, le système immunitaire, la transduction des signaux, le transport et catabolisme et le métabolisme et biodégradation des xénobiotiques, démontrant l'influence généralisée du microbiote sur l'hôte. L'élevage de larves axéniques a aussi démontré que le microbiote ne semble pas être obligatoire à la survie des larves. Dans un deuxième temps, la dynamique du microbiote au cours de l'ontogénèse de la Mouche soldat noire a été investiguée par une approche métataxonomique utilisant des gènes marqueurs. Nos résultats ont montré l'importance relative du stade de vie, du substrat d'élevage et des régions de l'intestin comme facteurs influençant la composition du microbiote bactérien et microeucaryote. La contribution de la transformation holométabole dans la plasticité métagénomique de la Mouche soldat noire a été mise en lumière, ainsi que l'implication du mécanisme de dysbiose adaptative dans la modification de son microbiote. Finalement, afin de mieux caractériser le rôle du microbiote dans le développement des larves, nous avons développé deux microbiotes synthétiques (i.e. SynComs), des assemblages de six bactéries d'origine endogène. L'administration de ces SynComs a révélé l'importance de microbiotes complexes dans la croissance des larves, et suggère que l'adaptation fonctionnelle du microbiote au substrat d'élevage joue un rôle important dans la compétence de bioconversion de l'hôte. Cette thèse permet de clarifier le rôle du microbiote dans l'ontogénèse de la Mouche soldat noire, en démontrant son impact sur le métabolisme de l'hôte. L'ensemble des résultats de ce projet semble indiquer que la plasticité métagénomique de la Mouche soldat noire est une composante importante de la capacité d'adaptation et d'exploitation de la larve à des niches écologiques hétérogènes. Ces résultats présentent un aspect opposé du rôle des microorganismes dans la biologie des hôtes comparativement aux associations spécialisées des symbiotes, qui permettent à leurs hôtes d'exploiter des niches écologiques spécifiques (e.g. les phytophages). Ces deux aspects opposés représentent des stratégies distinctes de survie et d'adaptation par les systèmes holobiontes. La forte plasticité métagénomique de la Mouche soldat noire présente un potentiel pour optimiser la bioconversion, et potentiellement d'autres caractéristiques, à travers l'ingénierie du microbiote, une perspective prometteuse pour l'exploitation industrielle. / Microorganisms colonize and modulate all available ecological niches on Earth, including metazoan hosts. The contributions of microorganisms in host-microbiota systems vary depending on the interacting species and the environment, but they are an essential aspect for understanding the ontogeny and evolution of these systems. The importance of host-microbiota interactions has been highlighted by the holobiont theory, proposing that organisms and their entire microbiota form a single evolutionary unit. Several studies in insects with specific diets, such as phytophages and haematophages, have demonstrated the essential role of symbionts in host metabolism and adaptation to the host's ecological niche, providing strong evidence supporting the holobiont theory. However, in polyphagous insects like the black soldier fly (Hermetia illucens), the functional roles of microbiota communities are less clearly established. The black soldier fly is an economically important insect due to its industrial use in organic waste upcycling and high-quality animal protein production. Consequently, there is a strong interest in understanding the role of microbiota in the bioconversion and ontogeny of the black soldier fly for the purpose of production optimization. Furthermore, the black soldier fly model presents a fundamental interest in reevaluating the holobiont theory in an organism that exhibits significant variations in its microbiota. The overall objective of this thesis project was to understand the role of microbiota in the ontogeny of the black soldier fly and to detail the factors that modulate its assembly. To this end, we developed an axenic rearing model for the black soldier fly and employed a three-fold approach to: (1) assess the influence of microbiota on the host's functional gene expression, (2) investigate the composition and factors influencing the microbiota during the ontogeny of the black soldier fly, and (3) develop and test the administration of synthetic microbiota on larval growth. First, the study of differential transcriptome expression between larvae with or without microbiota (i.e., axenic) demonstrated microbiota-dependent gene expression profiles for the host, including various metabolic pathways. The microbiota positively regulates the transcription of genes in a range of pathways, including carbohydrate metabolism, the endocrine system, lipid metabolism, the nervous system, the sensory system, the immune system, signal transduction, transport and catabolism, and xenobiotic metabolism, demonstrating the widespread influence of microbiota on the host. Rearing axenic larvae also demonstrated that microbiota does not appear to be obligatory for larval survival. Second, the dynamics of the microbiota during the ontogeny of the black soldier fly were investigated using a metataxonomic approach with marker genes. Our results showed the relative importance of life stage, rearing substrate, and intestinal regions as factors influencing the composition of the bacterial and microeukaryotic microbiota. Our findings highlighted the contribution of holometabolous transformation in the metagenomic plasticity of the black soldier fly, as well as the involvement of the adaptive dysbiosis mechanism in modifying the larva-associated microbiota. Finally, to better characterize the role of microbiota in larval development, we developed two synthetic microbiota (SynComs), assemblies of six endogenous bacteria. The administration of these SynComs revealed the importance of complex microbiota in larval growth and suggested that the functional adaptation of the microbiota to the rearing substrate plays a significant role in the host's bioconversion competence. The entirety of this thesis serves to elucidate the role of microbiota in the ontogeny of the black soldier fly, demonstrating its impact on host metabolism. The results of this project appear to indicate that the metagenomic plasticity of the black soldier fly is an important component of the larva's ability to adapt to and exploit a wide range of ecological niches. These findings provide an interesting contrast to the specialization of obligate symbionts that enable their hosts to exploit restricted niches such as phytophages. The strong metagenomic plasticity of the black soldier fly holds potential for optimizing bioconversion and potentially other characteristics through microbiota engineering, a promising prospect for industrial exploitation.

La production porcine occupe une place importante dans l'industrie agroalimentaire vue l'appréciation de la viande porcine par le consommateur. Ainsi, l'étude de l'écologie microbienne de la chaîne de valeur du porc est importante pour développer de nouvelles stratégies visant à améliorer la qualité microbiologique des produits. L'objectif de cette étude consistait à caractériser le microbiote porcin sur l'ensemble de la chaine de valeur lorsque les animaux sont nourris avec ou sans un probiotique commercial (BioPlus 2B, Chr Hansen, Hoersholm, Denmmark ; *Bacillus licheniformis* et *subtilis*) pendant toute la période d'engraissement. Pour se faire, deux cohortes de porcs consécutives et constituées de 1000 animaux par groupes expérimentaux, avec et sans supplémentation de probiotique, pour un total de 4000 animaux ont été suivies dans des conditions commerciales pendant toute la période d'engraissement. Des analyses métataxonomiques par séquençage d'amplicons du gène de l'ADNr 16S ont été effectuées sur les échantillons prélevés en ferme (salive, fèces, air, moulée et eau), en usine (convoyeurs, drains et dalot), sur les carcasses, ainsi que sur des longes gauches emballées sous vide et réfrigérées (0, 27, 48, 62 et 76 jours). L'ajout du probiotique a eu un effet significatif sur les niveaux de *Bacillus* présents dans la moulée du groupe traitement confirmant leur présence accrue comparativement au groupe témoin (*p*<0,05). Le séquençage de l'amplicon du gène ribosomal 16S a permis de caractériser le microbiote à la ferme et de démontrer que *Firmicutes*, *Bacteroidota*, *Proteobacteria* et *Actinobacteriota* sont les phylums dominants. L'analyse LEfSe a révélé que *Clostridium sensu stricto 1* et *Prevotella* constituent des biomarqueurs à la ferme associés au groupe traitement. Les indices de diversité alpha étaient significativement plus élevés dans les échantillons de fèces et de salive du groupe supplémenté en probiotique (*p* < 0.01). Cette diversité accrue est plus marquée dans les prélèvements issus de la deuxième cohorte. De plus, l'analyse avec le logiciel SourceTracker a permis d'inférer que le microbiome de la ferme représente 3,9 % de l'origine écologique des variants de séquence d'amplicons présents sur les longes. À l'abattoir, les analyses métataxonomiques ont révélé des niveaux d'abondance relative faibles pour les *Enterobacteriaceae* et ce pour les deux groupes expérimentaux. L'analyse métataxonomique a montré également une prévalence plus élevée de bactéries lactiques par rapport aux *Enterobacteriaceae* sur les longes de porc. Notamment, *Carnobacterium* a été identifié comme le genre prédominant dans les deux groupes expérimentaux, en particulier pour la deuxième cohorte, représentant 99,5 % de la population microbienne. Ces résultats ont contribué à une meilleure compréhension du microbiote tout au long de la chaîne de production porcine à la suite de l'utilisation de probiotiques. L'effet du probiotique sur le microbiote de la chaîne de valeur porcine nécessitera une étude à plus grande échelle afin de mieux comprendre ses mécanismes d'actions sur l'hôte. / Pig production occupies an important place in the agri-food industry, given the consumer's appreciation of pork meat. The study of the microbial ecology throughout the pork value chain is important for developing new strategies to enhance the microbiological quality of products. The objective of this study was to characterize the porcine microbiota throughout the value chain when animals are fed with or without a commercial probiotic (BioPlus 2B, Chr Hansen, Hoersholm, Denmark; *Bacillus licheniformis* and *subtilis*) during the entire fattening period. To achieve this, two consecutive cohorts of pigs, each consisting of 1000 animals per experimental group, with and without probiotic supplementation, for a total of 4000 animals, were followed under commercial conditions throughout the fattening period. Metataxonomic analyses by sequencing of the 16S rDNA gene amplicons were performed on samples collected on the farm (saliva, feces, air, feed, and water), in the slaughterhouse (conveyors, drains, and drains), on carcasses, as well as on vacuum-packed and refrigerated loins (0, 27, 48, 62, and 76 days). The addition of the probiotic had a significant effect on the levels of *Bacillus* present in the feed of the treatment group, confirming their increased presence compared to the control group (*p* <0.05). The 16S rDNA gene amplicon sequencing allowed the characterization of the microbiota on the farm and showed that *Firmicutes*, *Bacteroidota*, *Proteobacteria*, and *Actinobacteriota* were the dominant phyla. LEfSe analysis revealed *Clostridium sensu stricto 1* and *Prevotella* as farm biomarkers associated with the treatment group. Alpha diversity indices were significantly higher in fecal and saliva samples from the probiotic-supplemented group (*p* < 0.01). This diversity was more pronounced during the second cohort. Furthermore, the SourceTracker software analysis inferred that the farm microbiome represented only 3.9% of the ecological origin of the amplicon sequence variants present on the loins. At the slaughterhouse, metataxonomic analyses revealed low relative abundance levels of *Enterobacteriaceae* for both experimental groups. Metataxonomic analysis showed a higher prevalence of lactic acid bacteria compared to *Enterobacteriaceae* on pork loins. Specifically, *Carnobacterium* identified as the predominant genus in both experimental groups, especially in the second cohort, representing 99.5% of the microbial population. These results have contributed to a better understanding of the microbiota throughout the pig production chain following the use of probiotics. The effect of probiotics on the porcine value chain microbiota requires further large-scale study to better understand the mechanism of action on the host.

Ce projet s'inscrit dans le programme UVILUQ, le terme inuktitut pour « moule », dont l'objectif est de développer l'utilisation des biopsies liquides chez la moule associée à la bancarisation sur cartes FTA pour le suivi de l'état de santé des écosystèmes côtiers. Cette nouvelle plateforme d'échantillonnage idéale pour les études en milieux éloignés donne accès à une panoplie d'informations sous la forme d'acides nucléiques, dont des biomarqueurs potentiels pour le suivi de l'état de santé des moules. Ce projet s'intéresse à l'un de ces derniers, soit le microbiote bactérien de l'hémolymphe. L'étude du microbiote bactérien chez les espèces sentinelles telles que la moule bleue est un domaine de recherche en expansion. Toutefois, pour pouvoir l'utiliser comme biomarqueur, il est essentiel d'avoir une compréhension étayée de sa variabilité spatiale naturelle à petite échelle afin d'établir des comparaisons de sites valides. Ce mémoire se penche sur la variabilité spatiale à petite échelle de la communauté bactérienne de l'hémolymphe des moules bleues (Mytilus spp.) ainsi que sur les processus biogéographiques sous-jacents. Le premier et seul chapitre présente une étude réalisée dans la moulière de Pointe-Mitis, retrouvée sur la rive sud de l'estuaire du Saint-Laurent, au Canada. Le microbiote de l'hémolymphe de moules provenant de plusieurs aires de la moulière présentant des caractéristiques d'habitat contrastées y a été caractérisé par métataxonomie basée sur l'ARNr 16S, permettant de définir les échelles spatiales de variation et d'avoir un aperçu de l'origine de ces différences. La conclusion générale de ce mémoire revient sur les résultats de cette étude ainsi que sur leur portée quant à l'utilisation potentielle du microbiote bactérien de l'hémolymphe comme biomarqueur. Les perspectives de recherche révélées par cette étude sont également abordées à travers la brève présentation de la deuxième partie de ce projet non incluse dans ce mémoire. Ce projet constitue ainsi un pas de plus vers l'utilisation du microbiote bactérien de l'hémolymphe comme biomarqueur accessible par biopsie liquide pour suivre l'état de santé des écosystèmes côtiers. / This project is part of the UVILUQ program, which mean "mussel" in Inuktitut, aiming to develop the use of liquid biopsy combined with FTA cards to monitor the functional integrity of coastal marine ecosystems. This new sampling method, ideal for remote regions studies, grants access to a large array of potential nucleic acids-based biomarkers to assess how stress factors or xenobiotics impact mussels' health. This project focus on hemolymph bacterial microbiota as one of these potential biomarkers. Studying bacterial microbiota in sentinel species such as blue mussels (Mytilus spp.) is an emerging field of research. However, to use it as a biomarker to evaluate the impact of stress factors, it is essential to have a good understanding of the natural variability at small spatial scales in order to establish valid spatial comparisons. Thus, this thesis is about the small-scale spatial variability of the blue mussels' hemolymph bacterial community and the underlying biogeographical processes. The first and only chapter is a study of the spatial heterogeneity of mussels' microbiota conducted in a local mussel bed in the Canadian St. Lawrence estuary. The hemolymph bacterial community of mussels from different areas presenting contrasting habitat characteristics has been characterized through 16S rRNA gene meta-taxonomy, allowing to identify significant scales of variation and to have a better understanding of the processes behind this variability. The general conclusion of the thesis discusses the results of this study and their implications for the potential use of the hemolymph bacterial microbiota as a biomarker. The research perspectives revealed by this project are also discussed through the brief presentation of the second part of the project that is not included in this thesis. This thesis is another step toward the use of the hemolymph bacterial microbiota through liquid biopsy to monitor the marine coastal ecosystems' integrity.

La peau l’un des plus grands organes du corps humain avec une superficie moyenne de 1,5m2 à 2m2 est à l’interface avec le monde extérieur et régule les échanges entre les deux milieux. Avec ses nombreuses invaginations et des apports nutritifs constants cet écosystème favorise la colonisation par des microorganismes. Les études taxonomiques basées sur le séquençage du gène rrs après amplification PCR à partir de l’ADN extrait ont permis de découvrir la diversité des différentes populations microbiennes qui colonisent la peau humaine dont peu sont cultivables in vitro. A côté des espèces communes à tous les individus une certaine spécificité individuelle a été trouvée de même qu’il a été montré que la surface du corps humain se différencie en régions avec des spécificités physico-chimiques propres pour lesquelles des correspondances taxonomiques du microbiote ont été détectées. Ce travail de thèse, réalisé dans le cadre d’un contrat CIFRE avec la société LibraGen a eu pour but d’aborder le volet fonctionnel du microbiote cutané grâce à l’application de l’approche séquençage haut débit de l’ADN metagénomique bactérien extrait de la peau humaine. Cet objectif a nécessité le développement d’une méthode de prélèvement‐extraction de l’ADN afin de remédier aux contraintes spécifiques de l’écosystème étudié, une faible densité microbienne et la putative présence de contamination par l’ADN humain. Les données de séquence obtenues nous ont permis de caractériser le potentiel fonctionnel du microbiote cutané des différents sites cutanés et, par comparaisons inter-environnementales de déterminer les fonctions spécifiquement rencontrées dans ce microbiote lié à l’homme. Les applications de ces travaux sont importantes comme par exemple la démonstration d’un effet sur le microbiote d’une application quotidienne d’onctions qui modifie tant la diversité taxonomique que le potentiel fonctionnel du microbiote cutané. / Skin is one of the largest human organs, with an average surface of 1.8 m2. At the interface between the human body and its external environment, skin is continually exposed to chemical and biological aggression and provides efficient protection of the human body. Its appearance is a good indicator of internal health, as skin reacts very rapidly to any change. Historically, skin microbiology was limited to the study of microorganisms isolated from skin pathologies, including those that provoke the pathological state and those that result from the pathology. However, the presence of skin microorganisms extends far beyond these pathological aspects, as non-pathological bacteria are detected everywhere on the skin, with up to 107 bacterial cells by cm2 in some areas. Skin is not a sterile human organ, but acts as an ecological niche for commensal microor- ganisms whose presence participates in protection against pathogens by preventing their colonization. Skin microbiology had been studied long before consid- ering the commensal skin bacteria, the majority of which could not be cultivated in vitro and the role of which was neglected until these new approaches, based on amplification and sequencing of DNA directly extracted from skin, were applied. Metagenomics revolutionized the study of microbiology in numerous environments where most bacteria are difficult to isolate. The first result of this approach was a more accurate estimation of microbial diversity, which had been underestimated by traditional approaches. However, interest in metagenomics exceeds a simple inventory of bacteria by providing information on their activity, function and interrelationship with other organisms.Our objective in this work realized in a CIFRE collaboration with Libragen company, was to study the functional profiles of the human skin microbiome with the application of metagenomic tools. This approach required first developing a method for the sampling and the dna extraction in order to overcome the constraints specific to this microbiome. Then, the sequencing data allowed characterizing the functional potential of the skin microorganisms in comparison to other environmental metagenome, and to find specificities of their local adaptations among three different skin sites. Applications of this work can be very important and one application tried in this thesis was the demonstration of the effect of several cutaneous cosmetic applications that modified the microflora at the taxonomic level and at the functional potential level.

D'étiologie inconnue, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, semblent résulter d'une réaction immunitaire inappropriée vis-à-vis de la flore commensale chez des individus génétiquement prédisposés. De ce fait, la modulation du microbiote par des probiotiques, majoritairement des bactéries lactiques commensales (lactobacilles et bifidobactéries), représente une alternative thérapeutique intéressante et a déjà conduit à un certain nombre d'essais cliniques concluants. Cependant, les effets thérapeutiques des bactéries probiotiques se sont avérés spécifiques de la souche utilisée et les mécanismes d'action de ces micro-organismes restent encore méconnus. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés au rôle du peptidoglycane et de la voie de signalisation NOD2 dans les capacités anti-inflammatoires de certains lactobacilles probiotiques. Dans un modèle murin de colite expérimentale mimant la pathologie humaine, nous avons tout d'abord montré que les capacités protectrices de la souche anti-inflammatoire Lactobacillus salivarius Ls33 nécessitent la présence du récepteur NOD2. Ce récepteur reconnaissant les produits de dégradation du peptidoglycane, nous avons préparé du peptidoglycane hautement purifié de la souche Ls33 et montré que l'administration de ce composant, par voie intrapéritonéale ou orale, protège les souris de la colite expérimentale. Nous avons également mis en évidence que l'effet protecteur du peptidoglycane de Ls33 implique la production d'IL-10, la voie immunosuppressive de l'indoleamine 2,3-dioxygénase et le développement, au sein des ganglions mésentériques, de cellules dendritiques régulatrices CD103+ et de cellules T régulatrices CD4+FoxP3+. Nous avons montré que le peptidoglycane de Ls33 favorise, in vitro, la différentiation de cellules dendritiques naïves en cellules dendritiques productrices d'IL-10, capables de protéger, après transfert adoptif, les souris de la colite de façon NOD2-dépendante. Les capacités protectrices n'ayant pas été obtenues avec le peptidoglycane de la souche non anti-inflammatoire L. acidophilus NCFM, nous avons ensuite réalisé une analyse structurale des deux peptidoglycanes. Alors que les deux souches arborent le muropeptide M-tri-Lys-D-Asn, nous avons identifié un muropeptide additionnel libéré uniquement par Ls33, le M-tri-Lys. Bien que les deux muropeptides synthétiques activent NOD2 in vitro, seule l'administration systémique du M-tri-Lys protège les souris de la colite. Cette protection est dépendante du récepteur NOD2 mais ne nécessite pas la présence de l'adaptateur principal des récepteurs de type Toll ou TLR, MyD88. En conclusion, nos résultats indiquent que le peptidoglycane et certains de ses dérivés sont des composants actifs dans la fonctionnalité des lactobacilles probiotiques et représentent une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.

Bien que longtemps considérés stériles, il est maintenant confirmé que les poumons sont peuplés d’une communauté microbienne diversifiée. De plus, il a récemment été observé que les microorganismes peuplant le corps humain peuvent influencer le développement du cancer et son traitement dans l’intestin et le pancréas. Cependant, peu d’études ont tenté de caractériser le microbiote pulmonaire et son impact sur le cancer du poumon. Davantage d’efforts se doivent d’y être consacrés. L’absence de standardisation méthodologique et de considération pour les contraintes de l’environnement pulmonaire diminuent par contre la validité des résultats obtenus et des conclusions qui peuvent être faites actuellement. Le présent projet propose donc le développement d’une démarche expérimentale appropriée à la caractérisation du microbiote tumoral pulmonaire. Nous avons mis sur pied une marche à suivre complète, allant du recrutement de patients au traitement des données bioinformatiques. Nous avons minimisé l’incorporation de microorganismes contaminants et avons établi des points de contrôle afin de les détecter et de les retirer des échantillons. La combinaison de méthodes d’homogénéisation enzymatiques et mécaniques et d’une trousse d’extraction d’ADN commerciale a permis une détection rapide et fiable du microbiote. L’utilisation des communautés microbiennes de composition connue, autant de cellules entières («whole») que de génomes, a permis de confirmer que notre capacité de récupération bactérienne est adéquate et que l’abondance d’ADN humain dans les extraits pulmonaires n’a pas d’influence significative sur notre capacité de détection. La signature bactérienne des tissus cancéreux et sains de cinq patients a pu être différenciée de celles des contrôles méthodologiques. Nos travaux approfondissent les connaissances nécessaires à l’étude d’environnements microbiens faiblement peuplés. Ils sont un point de départ vers la standardisation méthodologique et l’implémentation de précautions d’échantillonnage appropriées pour l’étude du microbiote pulmonaire. / Although historically considered sterile, the lung is now known to harbor a diverse microbial community. It has also been recently observed that microorganisms that populate the human body can influence the development of cancer and its treatment in the intestine and pancreas. However, very few studies have attempted to characterize the composition of the pulmonary microbiota to correlate it to lung cancer, a deeper look into this possible interaction seems mandatory. To this day, the absence of methodological standardization and considerations for the constraint of the pulmonary environment reduces the validity of the results collected and the conclusions drawn. This project aims at developing an appropriate experimental approach for the characterization of the pulmonary microbiota. We developed a complete pipeline from patient enrollment to bioinformatics analyses. We minimized the incorporation of contaminating microorganisms and established controls to detect and account for them in lung samples. A combination of enzymatic and mechanical homogenization technic with adapted commercially available DNA extraction kit allowed for a fast and reliable extraction of bacterial DNA. The use of bacterial communities of known composition, whole cells or genomic, allowed us the confirm our ability to recover bacterial DNA adequately and that the abundance of human DNA in sample does not influence our detection efficiency. The bacterial signature of the cancerous and healthy lung tissue of five patients could also be distinguished from methodological controls. Our work expands our understanding on the analysis of low microbial burden environments. It is to be a starting point in the standardization of methods used in pulmonary microbiota study and the implementation of appropriates sampling considerations.

La dermatite atopique (DA) est une maladie inflammatoire et prurigineuse de la peau, très fréquente chez les enfants et dont la prévalence augmente dans les pays industrialisés. La physiopathologie complexe de cette maladie met en jeu un défaut de la barrière cutanée et/ou des défauts génétiques résultant en une hypersensibilité aux allergènes de l'environnement tels que ceux issus d'acariens. Récemment, des études sur les interactions entre le système immunitaire et les bactéries commensales et pathogènes de la peau ont révélé leur importance dans cette maladie. Pour étudier le rôle du microbiote cutané dans la réponse T CD4+, des cohortes de jeunes enfants, atteints de DA et sensibilisés aux allergènes d'acariens (Der p) ou non DA (population contrôle), ont été recrutées. L'analyse du microbiote (MALDI-TOF) et du profil transcriptomique cutanés, ainsi que la quantification des T CD4+ anti-Derp (ELISpot) ont montré que la présence de S. aureus sur la peau inflammatoire des sujets AD était associée à des taux élevés d'IgE, des transcrits caractéristiques d'une orientation Th2/Th22 et à une réponse périphérique Th2. Des cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDC) de donneurs sains produisent respectivement de l'IFN-gamma et de l'IL-10 en présence de sécrétomes issus de souches de S. aureus et S. epidermidis provenant de patients. La prolifération de lymphocytes T CD4+ stimulés avec des moDC allogéniques traitées avec le sécrétome de S. aureus est atténuée par le traitement simultané des moDC avec le sécrétome de S. epidermidis. Les sécrétomes de S. aureus sont capables d'inhiber directement l'activité suppressive de lymphocytes T régulateurs en l'absence de cellule présentatrice d'antigène. L'ensemble de nos résultats nous permet de penser que S. aureus est un facteur pro-inflammatoire de la DA en exacerbant la prolifération de lymphocytes Th2 résidents et en inhibant la fonction des lymphocytes T régulateurs. Favoriser les effets anti-inflammatoires des bactéries commensales telles que S. epidermidis liés à l'induction d'une sécrétion d'IL-10 par les cellules dendritiques de la peau pourrait bénéficier aux patients atteints de DA. / Atopic dermatitis (AD) is an inflammatory and pruritic skin disease frequently affecting children. Its prevalence is increasing in industrialized countries. Its complex pathophysiology involves a skin barrier dysfunction and/or genetic abnormalities leading to sensitivity to environmental allergens such as house dust mites. Interactions between the immune system and skin bacteria, pathogens and commensals, appeared to be important in the disease. To study the influence of skin microbiota in the CD4+ T cell response, we designed a cohort of young AD children sensitized to house dust mite allergens (Der p) and their counterparts (controls). Analysis of skin microbiota (MALDI-TOF), transcripts profiling and quantification of anti-Der p CD4+ T cells showed that the presence of S. aureus on inflamed skin of AD subjects was associated with high IgE levels, Th2/Th22 transcripts and peripheral Th2 anti-Der p response. Monocyte-derived dendritic cells (moDC) were exposed to secretomes produced by S. aureus and S. epidermidis strains isolated from patients and released IFN-gamma and IL-10 respectively. Proliferation of CD4+ T cells induced by allogeneic moDC exposed to S. aureus secretome was blunted by concurrent exposure of moDC to S. epidermidis secretome. Regulatory T cells (Treg) lost their activity against conventional CD4+ T cells under the direct effect of S. aureus secretome. Overall, these results allow us to think that S. aureus is an important factor of the AD inflammation by inducing Th2 activation and silencing resident Treg. Commensals such as S. epidermidis could be used to counteract these effects by inducing IL-10 production by skin DC.

Les anticorps bloquant les rétrocontrôles inhibiteurs du système immunitaire (ICB) ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de certains cancers. Les ICB bloquent l’axe cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) ou programmed cell death protein 1/PD-L1-PD-L2 et permettent une réactivation des cellules T stimulant l’immunité anti-tumorale. Toutefois, malgré cette avancée plus de 70 % des patients finiront par progresser et ces traitements peuvent entrainer des toxicités de type auto-immunes sévères. Il est donc fondamental d’identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse clinique et ainsi développer une nouvelle stratégie thérapeutique efficace pour augmenter l’index thérapeutique des ICB. Plusieurs groupes ont participé à décrire le lien étroit entre le microbiote intestinal et la réponse à la chimiothérapie (cyclophosphamide), à la greffe allogénique ainsi qu’aux les thérapies immunomodulatrices (anti-CTLA4 and PD1 Abs). Mon travail de thèse vient à la suite de ces travaux princeps et a permis de montrer que la composition du microbiote intestinal est en partie responsable de l’activité anti-tumorale des ICB dans plusieurs cancers. L’analyse de 249 patients atteints d’un cancer métastatique du poumon, du rein et cancer urothelial traités par l’anti-PD-1 ou l’anti-PD-L1 les antibiotiques (ATB) diminuaient la survie sans progression (PFS) de 3.5 vs 4.1 mois (p=0.017) et la survie globale de 11.5 vs 20.6 mois (p<0.001) par rapport aux patients n’ayant pas pris d’ATB avant de débuter les ICB. Nous avons par la suite analysé par métagénomique les selles de 153 patients atteints d’un cancer du poumon et du rein traités par l’anti-PD-1. Les résultats ont montré que Akkermmansia muciniphila est plus abondante chez les patients ayant une meilleure réponse clinique et une meilleure PFS. De plus, nous avons démontré que la présence d’une réponse mémoire spécifique des cellules CD4+ ou CD8+ envers A. muciniphila est associée à une plus longue PFS. Par la suite, des transplantations de microbiote fécal (FMT) avec les selles de ces patients chez des souris axéniques ou traitées par ATB montrent que les selles des répondeurs à l’anti-PD-1 entrainent une forte réponse immunitaire anti-tumorale post anti-PD-1 comparé aux selles de non-répondeurs. De plus, un gavage oral avec A. muciniphila après la FMT avec des selles de non-répondeurs restaure une forte réponse immunitaire post anti-PD-1 via la production d’IL-12 par les cellules dendritiques entrainant l’augmentation du recrutement des cellules T CD4+CXCR3+CCR9+ du ganglion mésentérique vers le site tumoral et une augmentation du ratio CD4/Treg. L’ensemble de ces résultats suggèrent que la découverte de bactérie immunogène capable de prédire le bénéfice clinique des ICB permettra de développer une stratégie thérapeutique efficace afin d’augmenter la survie des patients atteints de cancer.Mots clés : ICB, anti-PD-1, anti-PDL-1, cancer du poumon, cancer du rein, microbiote intestinal / In oncology, a novel therapeutic era based on immune checkpoint blockades (ICB) targeting cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) or programmed cell death protein 1 (PD-1) inhibitory T-cell receptors has come of age. Targeting CTLA-4 or PD-1/PDL-1/PDL-2 unleashes T cells and restores antitumor immunity. However, 70% of patients will eventually progress and drug-induced autoimmune toxicities are frequent. Therefore, predictors of clinical benefit and strategies to safely enhance ICB efficacy are urgently needed. Multiple lines of evidence have shown that conventional chemotherapy, allogeneic transplantation and immune-based therapies (IL-10R blockade, anti-CTLA4 and PD1 Abs) rely upon the composition of the gut microbiota to exert their bioactivity. During my PhD, I showed in a cohort of 249 patients with advanced NSCLC, RCC and urothelial cancer treated with anti-PD-1/PDL-1 mAb that antibiotic (ATB) prescription before ICB decreased PFS from 3.5 months vs 4.1 months (p=0.017) and OS from 11.5 months vs 20.6 months (p<0.001) compared to patients without ATB. Next, using quantitative metagenomics by shotgun sequencing, we explored the microbiota composition of 153 patients with advanced NSCLC and RCC amenable to anti-PD-1 mAb. Akkermansia muciniphila was found to be strongly associated with favorable objective response rate and longer PFS. To validate the relevance of these clinical findings, we brought up two major lines of evidence. First, we demonstrated that in NSCLC patient, the presence of specific IFNγ+ memory CD4+ and CD8+ T cells toward A. muciniphila predicted a longer PFS. Secondly, fecal microbiota transplantation (FMT) was performed using patient feces to recolonize germ-free or ATB-treated mice in two tumor models. Feces from patients with clinical response conveyed a stronger immune response against the tumor compared to feces from non-responders. Subsequently, oral supplementation with A. muciniphila post-FMT with non-responder feces restored the efficacy of PD-1 blockade. In this setting, dendritic cells secreted more IL-12, increasing the recruitment of CCR9+CXCR3+CD4+ T lymphocytes from the mesenteric lymph nodes into tumor beds as well as an increase of CD4+/Treg ratio within the tumor bed of mice co-treated with anti-PD1 mAb and A. muciniphila. The discovery of immunogenic bacteria capable of predicting and increasing clinical benefit of ICB will help for the development of novel biomarker tools and a future therapeutic concept, whereby treatment of cancer can be improved by the modulation of gut microbiota. Keywords: NSCLC, RCC, Immune checkpoint blockades (ICB), immunotherapies, Programmed Cell Death Protein-1 (PD-1), Microbiota.