Thèse ou mémoire avec insertion d’articles. / Les maladies cardiométaboliques affectent de nombreuses populations à l'échelle mondiale, notamment les populations autochtones qui résident dans le nord du Canada. Des travaux scientifiques récents suggèrent que ces maladies peuvent avoir été causées en partie par des perturbations du microbiote intestinal. Le profilage métabolique d'acides biliaires (AB) est un moyen reconnu pour analyser le microbiote. Cependant, ces analyses sont principalement effectuées a posteriori sur des échantillons fécaux et ne fournissent aucune information spatiale ou temporelle sur les variations métaboliques au sein du tractus gastro-intestinal. Le présent projet vise à développer une méthode de détection sélective aux AB basée sur la spectroscopie Raman exaltée en surface (SERS), une technique d'identification moléculaire. Les capteurs développés à partir de cette méthode permettront une étude en temps réel du microbiote avec une résolution spatiale et temporelle inégalée. La spectroscopie Raman est une technique d'identification moléculaire non invasive et non destructive qui produit un spectre hautement spécifique avec diverses bandes corrélées à la structure moléculaire de l'échantillon. Il est possible d'améliorer sa sensibilité de détection en utilisant une surface métallique nanostructurée amplificatrice de signal, ce qui permet de mesurer différentes espèces moléculaires dans des concentrations réduites et un temps de mesure relativement court. La combinaison du SERS avec des méthodes d'apprentissage machine permet dans certains cas d'augmenter davantage les capacités de détection et de classification. Afin de détecter les AB, un microscope confocal Raman à balayage laser a été construit en laboratoire. Des substrats actifs en SERS et sélectifs aux AB ont par la suite été développés en immobilisant des nanoétoiles d'or sur des lamelles de verre. Afin de réaliser une analyse approfondie avec des algorithmes d'apprentissage machine, une base de données spectrales a été conçue en mesurant plusieurs spectres SERS provenant d'AB individuelles ou de mélanges d'AB, et ce dans diverses matrices moléculaires. Un modèle du type « réseau de neurones convolutif » a été entraîné et jumelé à plusieurs techniques de traitement spectral et d'augmentation des données afin d'effectuer la classification de différentes espèces d'AB à partir de leur spectre. Le modèle résultant a été appliqué avec succès sur cinq espèces d'AB et validé à différentes concentrations. / Cardiometabolic diseases are affecting many populations worldwide, including indigenous populations residing in northern Canada. Recent scientific evidence suggests that these diseases may be caused in part by disorders of the gut microbiota. Bile acid (BA) metabolic profiling is a recognized method for analyzing the gut microbiota. However, these analyses are mostly performed on fecal samples and do not provide any spatial or temporal information on metabolic variations in the gastrointestinal tract. The present project aims to develop an AB-selective sensing method based on Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS), a molecular identification technique. The resulting sensors will allow a real time study of the microbiota with an unmatched spatial and temporal resolution. Raman spectroscopy is a non-invasive and non-destructive molecular identification technique that produces a highly specific spectrum with various bands correlated to the molecular structure of the sample. Its detection sensitivity can be improved using a signal enhancing nanostructured metal surface, which allows the measurement of various chemical species at lower concentrations and/or shorter measurement times. Combining SERS with machine learning methods can, in some cases, increase even further detection and classification capabilities. In order to detect ABs, a confocal laser scanning Raman microscope was built in the laboratory. AB-selective SERS active substrates were developed by immobilizing gold nanostars on glass coverslips. In order to perform an extensive analysis with machine learning algorithms, a database of spectra was developed by measuring several SERS spectra from individual ABs or mixtures of ABs in various molecular matrices. A convolutional neural network model was trained and combined with several spectral processing and data augmentation techniques to perform classification of different BA species based on their spectra. The resulting model was successfully applied to five species of BA and validated at different concentrations.

Chez les Mammifères, le recrutement du microbiote débute in utero, ce qui restait à démontrer chez d'autres classes de Vertébrés. L'objectif général du projet était de tester si un tel recrutement se produit chez un Vertébré non Mammifère. Nous avons testé, chez le Poisson vivipare Brachyistius frenatus, l'hypothèse selon laquelle la poche utérine est colonisée par un microbiote transmissible aux alevins, conférant à leur propre microbiote une ontogenèse semblable à celle des Mammifères. Le projet visait l'atteinte des objectifs suivant: i) caractériser le mode de transmission du microbiote, ii) établir la composition, la diversité et les relations des communautés bactériennes du microbiote des femelles, des juvéniles et de leur environnement et iii) déterminer l'ontogenèse du microbiote chez B. frenatus. Ce projet a permis de caractériser le mode de transmission du microbiote, sa séquence de recrutement, ainsi que la contribution respective de différentes communautés sources en caractérisant la diversité bactérienne du microbiote des femelles, des juvéniles et de leur environnement avec une approche métagénomique de type code barre. La région V4 du gène de l'ARNr 16S a été ciblée comme marqueur taxonomique bactérien pour identifier les taxons des différents échantillons. Cette étude nous a permis d'identifier le premier cas d'une transmission verticale du microbiote in utero chez un vivipare non Mammifère et les résultats sous-entendent que B. frenatus est peut-être un tout nouveau modèle d'ontogenèse du microbiote. Cette étude a permis l'acquisition des connaissances sur la transmission du microbiote et, dans le contexte de convergence évolutive de la viviparité, elle ouvre à de nouvelles perspectives quant aux avantages évolutifs d'une telle transmission de symbiotes microbiens. / In Mammals microbial recruitment starts in utero, something that had not been shown in any other Vertebrate class. The main goal of this project was to test whether this type of recruitment happens in a non-mammalian Vertebrate. We tested in the viviparous fish Brachyistius frenatus the hypothesis under which the uterine pouch is colonized by a microbiome transmissible to the juveniles, conferring them an ontogeny similar to Mammals. This project also aimed to i) characterize the mode of transmission of the microbiota, ii) establish the composition, diversity and relationships between the microbial communities of pregnant females, juveniles and their environment and iii) determine the ontogeny of the microbiota in B. frenatus. We characterized the mode of transmission of the microbiome, explored its recruitment and the contribution of different source communities with a metagenomic approach (bar coding). We targeted the hyper variable region V4 of the small subunit (16S) rRNA gene to determine the presence of a vertical transmission of the microbiome In this study, we confirmed the presence of a vertically transmissible microbiome in the viviparous fish B. frenatus. We documented for the first time an in utero transmission of the microbiota in a non-mammalian viviparous species. Our results also hint that B. frenatus might be a new model of microbiota ontogeny. This study contributes to the acquisition of knowledge on microbiome transmission and, in the context of evolutionary convergence of viviparity, allows the formulation of hypotheses concerning the evolutionary advantages of in utero microbiome transmission.

Titre de l'écran-titre (visionné le 23 mai 2023) / La découverte de la co-dépendance entre les communautés de microorganismes symbiotiques et leurs hôtes eucaryotes a redéfini l'unité biologique soumise à l'action des forces évolutives, à « l'ensemble de l'hôte et son microbiote symbiotique », appelé holobionte. Les holobiontes aquatiques sont retrouvés dans une multitude d'environnements extrêmes sur Terre, allant des sources d'eau chaude, aux profondeurs océaniques, aux calottes polaires, jusqu'aux cours d'eau contaminés par les métaux lourds. De plus en plus d'études montrent que l'établissement d'associations symbiotiques avec des microbes a permis à la diversité animale de se développer dans ces environnements hostiles. Les Poissons, retrouvés dans une étonnante diversité d'environnements contrastés, constituent d'excellents modèles pour comprendre la nature des symbioses hôte-microbiote, tant en termes de composition des communautés impliquées, que d'identification des facteurs environnementaux et génétiques qui modulent leurs interactions avec l'organisme hôte. Au contraire des microbiotes humains, nos connaissances sur le microbiote des Poissons en sont à leurs tous débuts. De manière générale, le projet de thèse visait à mieux comprendre l'influence des facteurs modulant les communautés bactériennes chez les Poissons, ainsi qu'à détailler la nature de l'interaction symbiotique existant entre ces communautés et leurs hôtes. Pour y parvenir, nous avons utilisé une approche holistique qui s'intéressait aux différentes composantes modulant les interactions hôte-microbiote chez différentes espèces de poissons amazoniens. Premièrement, nous avons caractérisé la composition et les facteurs environnementaux qui altèrent le bactérioplancton amazonien, ce dernier représentant la source principale de bactéries recrutées par les poissons. Un échantillonnage de bactérioplancton au sein d'un gradient physicochimique de 15 sites naturels a montré que les communautés bactériennes environnementales varient en composition et en activité selon le type d'environnement échantillonné, les Betaprotéobactéries dégradant le carbone humique étant particulièrement abondantes en eau noire, un milieu acide et pauvre en ions. Deuxièmement, nous avons tenté d'évaluer l'effet du génotype de l'hôte sur le recrutement du microbiote chez les poissons amazoniens, afin de déterminer s'il s'agit d'un facteur significatif pouvant moduler le microbiote des Poissons. Suite à la caractérisation du génotype et du microbiote bactérien de quatre espèces de piranha génétiquement proches, nous avons montré l'existence de corrélations significatives entre le génotype de l'hôte et la structure de son microbiote cutané, ce qui n'était pas le cas pour le microbiote intestinal. Par la suite, nous avons profité des particularités d'un système d'étude unique en Amazonie, où on observe un découplage génotype X environnement, afin de quantifier les contributions respectives du génotype du poisson-hôte, des paramètres physicochimiques environnementaux et de la composition du bactérioplancton à la composition du microbiote branchial, représentant une des communautés microbiennes icthyienne la plus exposée à l'environnement. Pour se faire, nous avons mené une étude comparative sur plusieurs populations génétiques de poissons échantillonnées dans des types d'eau ayant des profils physicochimiques contrastés, et avons montré que le recrutement des souches bactériennes environnementales dépend davantage de la composition de l'assemblage bactérien planctonique, que du génotype du poisson-hôte. Finalement, nous avons étudié la nature des interactions poisson-microbiote en milieu extrême, en tentant de comprendre si des fonctions bactériennes des symbiotes branchiaux sont essentielles à la survie des poissons en eau noire, un milieu acide et pauvre en ions imposant d'importants défis physiologiques pour les poissons résidents. La caractérisation simultanée du transcriptome de l'organisme hôte et de sa communauté microbienne chez quatre espèces de Poissons, collectées le long d'un gradient physicochimique comprenant plusieurs sites d'eau noire, suggère que les bactéries branchiales jouent des rôles essentiels dans la régulation des processus d'ionorégulation de l'hôte. Par exemple, l'expression de plusieurs systèmes de transport transmembranaire d'ions n'était observée qu'en cas de surexpression de certaines Betaprotéobactéries connues pour moduler la perméabilité membranaire eucaryote. La contribution du bactérioplancton dans cette interaction a été étudiée davantage par l'implantation d'un modèle de poissons axéniques (stériles) exposés à ce même gradient physico-chimique amazonien, mais dans différents environnements stériles/non stériles en laboratoire. Les résultats de cette dernière expérience ont révélé que les bactéries autochtones/endémiques de l'eau noire d'Amazonie jouent un rôle crucial dans la survie des poissons dans ce type d'eau, puisque l'absence de celles-ci provoque une mort rapide. En conclusion, ce projet de thèse contribue à démontrer l'importance de considérer le microbiote de l'hôte, tout comme le microbiote environnemental, dans les études concernant l'évolution et l'écologie des Poissons. / The discovery of the codependency between communities of symbiotic microorganisms and their eukaryotic hosts has redefined the biological unit subject to the action of evolutionary pressures, from the hosts only, to the hosts and their symbiotic microbiota, known as "holobionts". Aquatic holobionts are found in a multitude of extreme environments on Earth, including hot springs, deep oceans, icy waters of Antarctica, and streams contaminated with heavy metals. More and more studies show that in these hostile environments, it is through the establishment of symbiotic associations with microbes that animal diversity has been able to develop. Fish, which are found in an astonishing diversity of contrasting environments, constitute excellent models for understanding the nature of host-microbiota symbiosis, the composition of the communities involved, as well as the environmental and genetic factors that modulate their interactions with their host organisms. Unlike human microbiota, our knowledge of the fish microbiota is still in its infancy. In general, this thesis project aimed to better understand the influence of factors modulating fish bacterial communities, as well as to detail the nature of the symbiotic interaction existing between these communities and their hosts. To achieve this, we used a holistic approach that focused on the many components modulating host-microbiota interactions in different Amazonian fish species. Firstly, we characterized the composition and the environmental factors that alter Amazonian bacterioplankton, the latter representing the main source of bacteria recruited by fish. A sampling of bacterioplankton within a physicochemical gradient of 15 natural sites showed that environmental bacterial communities vary in composition and activity depending on the type of environment sampled, with humic-carbon-degrading Betaproteobacteria being particularly abundant in black water, an acidic and ion-poor environment. Secondly, we attempted to assess the effect of the host genotype on microbiota recruitment in Amazonian fish, to determine if it is a significant factor that can modulate fish microbiota. Following the characterization of the genotype and bacterial microbiota of four genetically similar piranha species, we evidenced the existence of significant correlations between the host genotype and the structure of fish skin microbiota, which was not the case for the gut microbiota. Subsequently, we took advantage of a unique study system in Amazonia, where fish genotype X environment decoupling is observed, in order to quantify the respective contributions of the fish host genotype, physicochemical parameters and bacterioplankton community composition in shaping the composition of the gill microbiota, one of the most environmentally-exposed community on fish hosts. To do this, we conducted a comparative study on several genetic populations of fish sampled in water types with contrasting physicochemical profiles, and showed that the recruitment of environmental bacterial strains depends more on the composition of the planktonic bacterial assembly, than on the genotype of the host fish. Finally, we studied the nature of fish-microbiota interactions in extreme environments, trying to understand whether there are bacterial functions expressed by symbiotic gill bacteria, that are essential for fish survival in black water, an acidic and ion-poor environment imposing significant physiological challenges for resident fish. The simultaneous characterization of the host gill and microbiota transcriptome of four fish species, collected along a physicochemical gradient including multiple blackwater sites, suggests that gill bacteria play essential roles in regulating host ionoregulatory processes. For example, the host expression of several transmembrane ion transport systems was only observed concurrently with the overexpression of specific Betaproteobacteria known to modulate eukaryotic membrane permeability. The contribution of bacterioplankton in this interaction was further studied by implementing an axenic (sterile) fish model exposed to this same Amazonian physico-chemical gradient, but in different sterile/non-sterile environments in the laboratory. The results of this latest experiment revealed that autochthonous/endemic Amazonian blackwater bacteria play key roles in the survival of fish in this water type, such that when hosts are devoid of bacteria, they do not survive in such an environment. In conclusion, this thesis project contributes to highlight the importance of considering the host microbiota, as well as the environmental microbiota, in studies concerning fish evolution and ecology.

L’étude du microbiote digestif est un enjeu important de recherche en microbiologie. La première partie de cette thèse porte sur la recherche au sein du microbiote digestif de nouveaux antibactériens, qui apparait comme une des pistes clés dans la lutte contre la résistance aux antibiotiques. Les trois quarts des antibiotiques sont des produits naturels, ou dérivés, sécrétés par des microorganismes de l’environnement. Comme lui, le microbiote digestif représente un écosystème complexe où règne une grande compétition. Nous avons recherché des antagonismes de culture dans le microbiote digestif contre les bactéries les plus pathogènes pour l’homme. Nous avons trouvé une inhibition de S. aureus par P. avidum, de E. cloacae par B. fragilis, E. dispar, L. delbruckii, P. acidipropionici, S. equinus, S. gallolyticus, et enfin de E. aerogenes par B. vulgatus et E. dispar. Nous avons également trouvé des clusters de gène de métabolites secondaires dans le génome de ces bactéries. Ce travail préliminaire confirme que le microbiote digestif est une source potentielle de nouveau antibactériens. En dépit de l’explosion du nombre d’espèces isolées dans le microbiote digestif grâce à la culturomics, certaines restent fastidieuses à cultiver. Nous avons analysé par métagénomique et culturomics une selle avant et après incubation anaérobie en présence de 5% de rumen et 5% de sang de mouton. Ce travail montre une dynamique de croissance des bactéries très hétérogène. Le milieu d’enrichissement utilisé était efficace et permettait la culture d’un plus grand nombre d’espèces bactériennes. Ce travail apporte des éléments nouveaux permettant l’optimisation de cette étape de culturomics. / Gut microbiota is a major health concern for microbiologists. Its alterations were previously related to diseases. In the first step of this thesis, we have searched for new antimicrobials within the gut microbiota. Indeed, antibiotic resistance is a global health concern and research for new antibiotics is a cornerstone for fight against it, according to the WHO. Three quarter of all current antibiotics are natural products, or derived from them, synthesised by bacteria and fungi from soil. Gut microbiota is another complex ecosystem with strong competition. We have searched for antagonism in the gut microbiota species against most human pathogenic species. We found an inhibition of growth of S. aureus by P. avidum, of E.cloacae by B. fragilis, E. dispar, L. delbruckii, P. acidipropionici, S. equinus, S. gallolyticus,and an inhibition of E. aerogenes by B. vulgatus and E. dispar. We also found BGCs for all these species. This preliminary work confirm that gut microbiota is a potential source for new antibiotics. Despite the explosion of bacterial species isolated from gut, some fastidious species remains difficult to grow. We performed a metagenomic and culturomics analysis of a fresh stool sample before and after incubation into an anaerobic blood bottle supplemented with sheep blood and rumen fluid. This medium used in culturomics for enrichment was effective, allowing the isolation of higher number of species. This work show that the dynamic growth of bacteria is very variable. This work brings some precisions in the dynamic of bacterial growth that could improve the culturomics process.

Les infections digestives à Clostridium difficile nécessitent une première étape de colonisation de l’écosystème intestinal. Avant l’âge de deux ans, la colonisation par C. difficile est fréquente mais paradoxalement le plus souvent asymptomatique. Nous avons montré que plus d’un tiers des enfants de 0-3 ans, et plus de 70% de ceux de 7 à 9 mois (15% pour les souches toxinogènes), étaient porteurs sains de C. difficile à l’hôpital et dans la communauté. Deux périodes d’acquisition de C. difficile ont été identifiées : néonatale ou 3-6 mois. Les souches infantiles de C. difficile étaient identiques aux souches isolées chez l’adulte, faisant du jeune enfant un réservoir potentiel de souches infectieuses. Nous avons également montré par méthode moléculaire que des changements en espèces dominantes du microbiote étaient associés à la colonisation par C. difficile. Bifidobacterium longum caractérisait le microbiote des enfants non colonisés, et pourrait participer à la résistance à la colonisation par C. difficile. / Gastrointestinal infections with Clostridium difficile require a first step of colonization of the intestinal ecosystem. Under the age of two years, C. difficile colonization is frequent but paradoxically most often asymptomatic. We have shown that more than a third of children 0-3 years and more than 70% of those from 7 to 9 months (15% for toxigenic strains) were healthy carriers of C. difficile in the hospital and in the community. Two C. difficile-acquisition periods were identified: neonatal or 3-6 months. The C. difficile strains from infants were identical to strains isolated from adults, making infants a potential reservoir of infectious strains. We also showed by molecular method that changes in dominant species of the microbiota were associated with colonization by C. difficile. Bifidobacterium longum characterized the microbiota of children not colonized by C. difficile, and could be involved in the colonization resistance process.

L’infection broncho-pulmonaire représente le problème majeur des malades atteints de la mucoviscidose. Plusieurs bactéries sont connues depuis des dizaines années comme les principaux agents responsables de ces infections (par exemple Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans…). Récemment, certains genres fongiques notamment les champignons filamenteux (comme Aspergillus, Scedosporium…) ont été identifiés comme des pathogènes émergeants ou ré-émergeants pouvant être responsables d’infection invasive. Ainsi, la détection des microorganismes impliqués dans ces colonisations et/ou infections respiratoires demeure importante sur le plan physiopathologique et clinique.Si la culture microbiologique reste la méthode la plus utilisée à ce jour pour le diagnostic des infections microbiennes, elle ne permet pas d’identifier les microbes non-cultivables ou difficiles à cultiver. Depuis quelques années, grâce au développement de la technique moléculaire de séquençage à haut-débit (next generation sequencing ou NGS), plusieurs études ont montré que l’écologie microbienne du poumon des patients atteints de la mucoviscidose est très complexe et correspond à une flore poly-microbienne, appelée le microbiote pulmonaire, comprenant non seulement des bactéries mais également des micromycètes (levures et/ou champignons filamenteux) et des virus et phages. Une dysbiose (modification en abondance et diversité) de cette flore pourrait influencer la fonction respiratoire et l’état clinique du patient.Alors que le microbiome bactérien et son rôle en pathogenèse sont largement étudiés, peu d’études ont porté sur la composante fongique (mycobiote/mycobiome) du microbiote pulmonaire. Notre travail de thèse s’inscrit dans les différents projets développés au sein de l’axe de recherche « Microbiote pro- et eucaryote pulmonaire » coordonné par le Pr Laurence Delhaes dans l’équipe Biologie et Diversité des Pathogènes Eucaryotes Emergeants (BDPEE) dirigée par le Dr Eric Viscogliosi. Il se focalise sur l’analyse NGS du microbiote pro- et eucaryotique respiratoire chez les patients atteints de la mucoviscidose et notamment la comparaison de différentes approches méthodologiques en vue d’une optimisation et standardisation de la méthode.Dans un premier temps, nous présenterons une synthèse des connaissances actuelles d’une part des phénomènes de colonisations/infections fongiques chez les patients atteints de mucoviscidose et d’autre part dans le domaine du microbiote pulmonaire et surtout du mycobiote pulmonaire autour duquel notre équipe se focalise.2Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à mieux adapter l’approche NGS aux études du microbiote pulmonaire dans la mucoviscidose. En effet, le séquençage à haut-débit est une technique puissante mais pour laquelle des biais peuvent être introduits à de nombreuses étapes méthodologiques. Un des biais les plus importants est que l’approche NGS ne permet pas de différencier les microorganismes vivants, des cellules mortes ou endommagées, ni de l’ADN extracellulaire. Dans le contexte de notre travail –celui du microbiote pulmonaire chez des patients atteints de mucoviscidose et souvent exposés aux antibiotiques par voie intraveineuse à forte dose, l’analyse NGS pourrait évaluer incorrectement l’abondance et la diversité de ce microbiote pulmonaire. Un prétraitement des échantillons par propidium monoazide (PMA), qui permet de cibler sélectivement l’ADN des cellules vivantes, pourrait être une solution pour palier à cette limite. Notre étude avait donc comme objectif de déterminer si un prétraitement par PMA des expectorations modifiait le microbiote pro- et eucaryote pulmonaire analysé par NGS. Nous discutons l’intérêt et la relevance clinique de cette approche « PMA - NGS » permettant une quantification isolée des microorganismes vivants dans le contexte de la mucoviscidose. / Chronic pulmonary infection results in an irreversible decline in lung function in patients with cystic fibrosis (CF). While several bacteria are known as main causes for these infections (for example: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans...), more recently some fungal genera including filamentous fungi (such as Aspergillus, Scedosporium...) have also been identified as emerging or re-emerging pathogens able to cause invasive mycosis. Thus, the identification of the microorganisms involved in the respiratory colonizations and/or infections has become essential.Still now culture methods remain the gold standard for diagnostic of microbial infections. However, it could not identify non-culturable or difficult-to-cultivate microorganisms. Thanks to the development of high-throughput sequencing (next generation sequencing or NGS), recent studies have shown that the lung of patients with CF is a complex poly-microbial flora, also called the CF lung microbiota, which includes not only bacteria but also fungi (yeast and/or filamentous fungi), and viruses and phages. Dysbiosis (loss of abundance and/or diversity) of the lung microbiota has been associated with the patient's decreased lung function and poor clinical status.While lung bacteriota and its role in pathogenesis have widely been studied, few research studies focus on the fungal component (mycobiota/ mycobiome) of the lungs. Our thesis (PhD work) focuses on NGS analysis of pro- and eukaryotic lung microbiota in CF patients, in particular on the comparison of different methodological approaches to optimize and standardize the NGS protocol. This project has been developed under the supervision of Pr. Laurence Delhaes in the “Biology and Diversity of Eukaryotic Emerging Pathogens” team directed by Dr. Eric Viscogliosi.Firstly, we present a state of art on the current knowledge on the fungal colonization/infections risk in CF as well as the development of new concepts of lung microbiota and lung mycobiota on which our team focuses.Secondly, we applied the NGS approach to study the pro- and eukaryotic microbiota in the sputum samples of CF patient lung. Indeed, NGS is a powerful technique that may introduce biases on numerous methodological steps. One of the most important biases is that this technique could not differentiate among the living microorganisms, the dead or damaged cells, and the extracellular DNA. In the context of the CF lung microbiota which is often exposed to high-dose intravenous antibiotics, the analysis by NGS might evaluate4inaccurately the abundance and the diversity of the lung microbiota. Pretreatment of samples by propidium monoazide (PMA), which can target selectively the DNA of viable cells, could be a solution to overcome this limitation. Our study aimed to determine whether a sample pretreatment with PMA modified the lung pro- and eukaryotic microbiota analyzed by NGS. We discuss the clinical relevance of this approach "PMA - NGS" in the context of CF patients to a better quantification of living microorganisms.

Les oomycètes phytopathogènes ont co-évolué avec les microbiotes des plantes hôtes. Il en résulte la formation de biofilms et des réseaux complexes d’interactions dont nous commençons juste à comprendre l’incidence sur la biologie et la virulence des oomycètes. Déterminer la nature de ces interactions et leur rôle dans le contexte d’une infection est aujourd’hui un enjeu cognitif qui concerne la caractérisation des mécanismes moléculaires et communautaires sous-jacents. C’est également une opportunité en termes d’innovation pour élaborer des méthodes de lutte alternative à l’usage de fongicides. Dans ce contexte, ce travail de thèse a consisté à étudier, d’une part, la formation de biofilm chez Phytophthora parasitica, un oomycète polyphage et tellurique, ainsi que, d’autre part, les interactions au sein de ce biofilm entre P. parasitica et le microbiote procaryote rhizosphérique de la plante hôte Solanum lycopersicum. L’analyse du génome de P. parasitica et du transcriptome du biofilm a conduit à la caractérisation d’une nouvelle famille de mucines restreinte à la lignée des oomycètes, les protéines MUCL. Ces 315 protéines sécrétées (25-30 kDa) sont réparties en 15 groupes et possèdent deux domaines : un domaine hautement conservé de fonction inconnue ; un domaine caractéristique des mucines, riche en résidus Sérine et Thréonine avec de très nombreux sites putatifs d’O-glycosylation. Chez P. parasitica, les 3 gènes PPMUCL1/2/3 sont exprimés et co-régulés spécifiquement au stade biofilm. / The interactions between a pathogen and the host surface resident microbiota are critical to disease outbreak. These interactions shape the distribution, the density and the genetic diversity of inoculum. However for most plant pathogens how each of these interactions acts on disease as a single one or as a member of a functional network remains to be specified. This issue is addressed here through the analysis of two types of interactions involving the polyphagous oomycete P.parasitica : (i) the intraspecific interaction that leads to monospecific biofilm formation by P. parasitica zoospores on plant surface; (ii) the interspecific interactions that occur between P. parasitica biofilm and the prokaryotic microbiota of Solanum lycopersicum rhizosphere. The biology of monospecific biofilm is investigated through the characterization of MUCL, a new oomycete-specific Mucin-like Protein family. Gene profiling, biochemical and immunohistological analyses define the extent of this family and lead to identify three members, PPMUCL1/2/3, as residing in P. parasitica biofilm. The Phytophthora parasitica-Microbiota interaction is explored using first a metagenomic approach. Two microbial metagenomes derived from a soil of a tomato greenhouse is defined and compared after 16S RNA gene sequencing: M1 which corresponds to the sub-rhizospheric microbiota able to colonize the roots of axenic tomato seedlings; M2, the sub-microbiota able to colonize the tomato seedling roots previously coated with P. parasitica monospecific biofilm. A representative collection of microorganisms from M2 were also obtained through in vitro selection on a medium prepared from P. parasitica extract.

Les bactéries du phylum Bacteroidetes, classe Bacteroidia, sont parmi les plus importantes dans microbiotes gastrointestinaux des humains et d'autres mammifères. La bouche, entrée du tube digestif, est un environnement avec des sites anatomiques variés, auxquels s'associent des microbiotes de composition différente. L'union de la gencive et des dents, le sillon gingivo-dentaire ou sulcus, est un site de dépôt d'un biofilm complexe appelé plaque dentaire. Une bactérie de ce phylum, Porphyromonas gingivalis, est capable de perturber le système immunitaire humain et de produire un déséquilibre du biofilm oral également nommée dysbiose. Ceci déclenche la formation de la poche parodontale, un creusement pathologique du sulcus, et l'apparition de la parodontite. D’autres espèces du genre Porphyromonas sont également associées à la parodontite notamment chez les canidés. Les populations de P. gingivalis sont panmictiques et la plasticité de leurs génomes importante. La bioinformatique peut aider à identifier les causes de la mosaïcité des génomes de cette bactérie, à étudier les facteurs de virulence au niveau du genre bactérien pour expliquer l'existence d'espèces pathogènes et d'autres commensales et à décrire la dysbiose liée à la parodontite. La génomique comparative de P. gingivalis a démontré une corrélation entre le nombre de contigs dans les génomes draft de cette espèce et les répétitions génomiques, notamment des séquences d'insertion. Nous avons re-séquencé, re-assemblé et re-annoté trois souches de référence de cette bactérie qui avaient des génomes complets, en utilisant un séquençage en long-read. Nous avons mis en évidence des erreurs d'assemblage sur les trois génomes publiés, que nous avons corrigé. Une étude du pangénome de ces trois souches montre un génome core important. La plasticité de l'espèce serait donc plus dans l'organisation du génome que dans les différentes capacités de codage. Une sous partie du génome core, dont les gènes ont un pourcentage d'identité nucléotidique plus faible que la plupart (génome core variant) est intéressante pour expliquer les différences phénotypiques de ces bactéries. Nous avons étudié la répartition d'un facteur de virulence, les fimbriae, structures d'adhésion, au sein du genre Porphyromonas et lié les loci à la phylogénie et au caractère pathogène des espèces. Finalement, une description de la dysbiose qui a lieu lors d'une parodontite est faite par une analyse du microbiote de patients atteints de parodontite et d'individus sains. Les genres prépondérants lors des deux états sont mis en évidence. Au cours de ces travaux, nous montrons l'importance de la biocuration et sa valeur ajoutée dans les travaux de génomique et bioinformatique en général. Seulement en faisant ce travail lent et lourd de biocuration, les réponses apportées aux questions biologiques seront pertinentes. / Bacteria of Bacteroidetes phylum, Bacteroidia class, are amongst the more important in gastrointestimal microbiota, either human or from other mammals. The mouth, digestive tube entry, is an environment with varied anatomic sites, each having a particular microbiota with different composition. The union between gingiva and teeth, the gingival sulcus, is a site for biofilm (dental plaque) formation and accumulation. Porphyromonas gingivalis, a bacterium from this phylum, can modulate the inmune system and produce an oral biofilm desequilibrium called dysbiosis. This triggers the formation of a periodontal pocket, a pathological deepening of the gingival sulcus, and the emergence of periodontitis. Other Porphyromonas species are also associated to periodontitis, mainly in canids. P. gingivalis populations are panmictic and their genomes are highly plastic. Bioinformatics can help to identify the causes of this genomic mosaicity, to study Porphyromonas virulence factors in order to explain why some species are pathogens and other are commensal, and to describe the dysbiosis linked to periodontitis. P. gingivalis comparative genomics showed a correlation between the number of contigs in draft genomes and genomic repeats, mainly insertion sequences. We resequenced, reassembled and reannotated three reference strains of this bacterium that already had complete published genomes, using long-read sequencing. We showed that misassemblies were present in the three published genomes, and we corrected them. A pangenome study of the three strains showed that the core genome is preponderant. The species plasticity might be related more to the genome organization than to different coding capacities. A subpart of th core genome, with genes having a nucleotidic identity percentage lower than the majority (variable core genome), is interesting for explaining the phenotypic differences of bacteria. We analysed the repertoire of a virulence factor, fimbriae, adhesion structures, in the Porphyromonas genus to link the loci to phylogeny and pathogenicity of its species. Finally, we described the dysbiosis occuring with periodontitis, analysing gingival microbiota of patients having the illness and healthy individuals. Preponderant genera in both states are highlighted. With this work, we demonstrate the importance of biocuration and its added value for genomic and bioinformatic studies in general. Only with this slow and arduous work, the answers to biological questions will be relevant.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-15Bitstream added on 2014-06-13T19:44:13Z : No. of bitstreams: 1 sterzo_ev_dr_jabo.pdf: 1284040 bytes, checksum: 1b92a11284babaa3c1ccc125e04e5893 (MD5) / O presente estudo teve por objetivo descrever as alterações morfológicas ocorridas nos cecos de pintos de corte, machos e fêmeas, tratados com Microbiota Cecal (MC) antes e após infecção por Salmonella enterica enterica sorovar Enteritidis (SE) durante a primeira semana de vida. No 1º dia de vida, os pintos foram tratados com MC antes e depois da infecção por SE. Durante todo o período experimental as condições clínicas, assim como a taxa de mortalidade foram observadas. No 1º, 3º, 5º e 7º dias pós infecção (dpi) quatro aves de cada sexo/tratamentos foram sacrificadas por meio de deslocamento cervical para obtenção de amostras do ceco para análises morfológicas (histologia e microscopia eletrônica de varredura), morfométricas e contagem do número de células inflamatórias e células caliciformes PAS+ e AB+. Os dados mostraram alguns episódios de diarréia e quadros de depressão nos pintos infectados com SE no 5º e 7º dpi; nesse período não foi observada mortalidade. No tocante às análise morfológicas, os pintos infectados por SE respondem ao processo infeccioso com um processo inflamatório agudo no 1º dpi, e a partir do 3º dpi, o processo se cronifica. A Microbiota Cecal (MC) antes da infecção, evita as alterações morfofuncionais causadas pela bactéria nos cecos dos pintos de corte, além disso, a MC induz a proliferação de células caliciformes PAS+ e AB+ e, conseqüentemente aumenta a produção de muco, sendo um fator de proteção ao epitélio cecal / This study aimed to describe the morphological changes occurred in the caecu, of males and females broiler chickens treated with Cecal Microbiote (CM) before and after the infection with Salmonella enterica enterica serovar Enteritidis (SE) during the first week of life. On the first day of life, chickens were treated with CM before and after the infection with SE. Throughout the experimental period, the clinical conditions as much as the mortality rates were observed. On 1st, 3rd, 5th and 7th days post infection (dpi), four birds of each sex/treatment were slaughtered by cervical dislocation in order to obtain samples from the caecum for morphological analysis (histology and scanning electron microscopy), morphometrical analysis and counting of the number of inflammatory and goblet cells PAS+ and AB+. The data showed some diarrhea episodes and depression symptoms in the chickens infected with SE on 5th and 7th dpi; in this period it was not observed any mortality. Concerning the morphological analysis, the chicks infected with SE respond to infectious process with and acute inflammatory process on 1st dpi and after the 3rd dpi the process gets chronicle. The Cecal Microbiote (CM) prior to infection avoid the morphological and functional alterations caused by the bacteria in broiler chickens caecum, in addition, the CM induces the proliferation of goblet cells PAS+ and AB+ and consequently increases mucus production being a protection factor to the caecum epithelium

Orientador: Isabel Cristina Boleli / Banca: Adriano Sakai Okamoto / Banca: Ana Maria Iba Kanashiro / Banca: Antonio Carlos Alessi / Banca: Maria Rita Pacheco / Resumo: O presente estudo teve por objetivo descrever as alterações morfológicas ocorridas nos cecos de pintos de corte, machos e fêmeas, tratados com Microbiota Cecal (MC) antes e após infecção por Salmonella enterica enterica sorovar Enteritidis (SE) durante a primeira semana de vida. No 1º dia de vida, os pintos foram tratados com MC antes e depois da infecção por SE. Durante todo o período experimental as condições clínicas, assim como a taxa de mortalidade foram observadas. No 1º, 3º, 5º e 7º dias pós infecção (dpi) quatro aves de cada sexo/tratamentos foram sacrificadas por meio de deslocamento cervical para obtenção de amostras do ceco para análises morfológicas (histologia e microscopia eletrônica de varredura), morfométricas e contagem do número de células inflamatórias e células caliciformes PAS+ e AB+. Os dados mostraram alguns episódios de diarréia e quadros de depressão nos pintos infectados com SE no 5º e 7º dpi; nesse período não foi observada mortalidade. No tocante às análise morfológicas, os pintos infectados por SE respondem ao processo infeccioso com um processo inflamatório agudo no 1º dpi, e a partir do 3º dpi, o processo se cronifica. A Microbiota Cecal (MC) antes da infecção, evita as alterações morfofuncionais causadas pela bactéria nos cecos dos pintos de corte, além disso, a MC induz a proliferação de células caliciformes PAS+ e AB+ e, conseqüentemente aumenta a produção de muco, sendo um fator de proteção ao epitélio cecal / Abstract: This study aimed to describe the morphological changes occurred in the caecu, of males and females broiler chickens treated with Cecal Microbiote (CM) before and after the infection with Salmonella enterica enterica serovar Enteritidis (SE) during the first week of life. On the first day of life, chickens were treated with CM before and after the infection with SE. Throughout the experimental period, the clinical conditions as much as the mortality rates were observed. On 1st, 3rd, 5th and 7th days post infection (dpi), four birds of each sex/treatment were slaughtered by cervical dislocation in order to obtain samples from the caecum for morphological analysis (histology and scanning electron microscopy), morphometrical analysis and counting of the number of inflammatory and goblet cells PAS+ and AB+. The data showed some diarrhea episodes and depression symptoms in the chickens infected with SE on 5th and 7th dpi; in this period it was not observed any mortality. Concerning the morphological analysis, the chicks infected with SE respond to infectious process with and acute inflammatory process on 1st dpi and after the 3rd dpi the process gets chronicle. The Cecal Microbiote (CM) prior to infection avoid the morphological and functional alterations caused by the bacteria in broiler chickens caecum, in addition, the CM induces the proliferation of goblet cells PAS+ and AB+ and consequently increases mucus production being a protection factor to the caecum epithelium / Doutor