La réduction des émissions de méthane (CH 4) des ruminants permet de limiter les impacts environnementaux négatifs de leur élevage et d’améliorer leur efficacité digestive. Dans le rumen, le CH 4 est majoritairement produit par les méthanogènes à partir de l’hydrogène (H 2). La disponibilité de l’H 2 pour ces micro-organismes est réduite en limitant sa production par les protozoaires (via un apport de lipides ou extraits de plantes dans la ration) ou en stimulant des voies utilisatrices d’H 2 compétitives à la méthanogenèse (via un apport alimentaire de nitrate). Aucune étude n’a porté sur l’association de stratégies alimentaires jouant à la fois sur la production et l’utilisation d’H 2 pour diminuer les émissions de CH 4 . Notre objectif était de comprendre l’importance des différentes voies métaboliques de l’H 2 dans le rumen. Nous avons émis l’hypothèse que manipuler simultanément la production et l’utilisation de l’H 2 permet une diminution plus importante des émissions de CH 4 plutôt que d’agir sur un seul niveau. Nos résultats expérimentaux ont montré l’additivité de l’association lipides du lin-nitrate sur la méthanogenèse des bovins. Cet effet était persistant mais non bénéfique pour les performances digestives et laitières des animaux. L’association saponine de thé-nitrate n’a pas été efficace pour réduire les émissions de CH 4 car l’effet dépressif de la saponine sur les protozoaires n’a pas été observé. Cette thèse ouvre la possibilité d’étudier le potentiel anti-méthanogène de nouvelles associations de stratégies alimentaires ayant des mécanismes d’action différents dans le rumen. Les conditions d’utilisation de ces stratégies en élevage devront être délimitées, et leur rentabilité prouvée, pour être acceptées par l’éleveur. / Reduction of methane (CH 4) emissions from ruminants may limit the negative environmental impacts of their breeding and may improve their digestive efficiency. In the rumen, CH 4 is mainly produced by methanogens from hydrogen (H 2). Hydrogen availability for these micro-organisms is reduced by limiting its production by protozoa (via lipids or plants extracts supplementation in diets) or by stimulating pathways competing with methanogenesis for H 2 consumption (via nitrate supplementation in diets). No study tested association of dietary strategies acting on both H 2 production and consumption to reduce CH 4 emissions. Our objective was to understand the importance of the different H 2 metabolic pathways in the rumen. We assumed that simultaneous manipulation of H 2 production and consumption reduces CH 4 emissions to a higher extent than acting on a single pathway. Our experimental results showed the additive CH 4 -mitigating effect of the association lipids from linseed-nitrate supplemented to bovine. This effect was persistent but not beneficial for digestive and lactating performances of animals. The association tea saponin-nitrate was not efficient to reduce CH 4 emissions, as the depressive effect of saponin towards protozoa has not been observed. This PhD thesis opens the possibility to study the anti-methanogenic potential of new association of dietary strategies having different mechanisms of action in the rumen. Conditions of use of these strategies at the breeding scale will have to be delineated, and their cost effectiveness proved to be accepted by farmers.

Dans le contexte de l'antibiorésistance, l'objet de ce doctorat vise à évaluer l'impact d'antibiotiques sur le microbiote intestinal de porcelets. La colistine et le ceftiofur, pour lesquels les résistances incluent essentiellement et respectivement mutations chromosomiques et gènes plasmidiques, ont été utilisés. La colistine a significativement réduit la population des entérobactéries, mais aucun E. coli résistant n'a été détecté. L'administration de ceftiofur a eu un impact limité sur les populations bactériennes composant l'écosystème digestif mais a conduit à une forte sélection et à la diffusion d'un gène plasmidique codant pour une bêta-lactamase à spectre étendu. Puis, dans le cadre de la réglementation visant à diminuer l'expérimentation animale, un modèle in vitro colique porcin, nommé PigutIVM, a été mis au point afin de simuler l'environnement digestif du porcelet et a permis de confirmer, in vitro, l'effet observé in vivo de la colistine sur le microbiote. Cet outil a ensuite été utilisé pour évaluer l'impact d'un probiotique, Saccharomyces cerevisiae, comme alternative aux antibiotiques. Le modèle PigutIVM devrait se positionner comme un outil de prédiction pertinent dans les domaines d'investigation aussi bien nutritionnels que pharmacologiques. / In the context of antibiotic resistance, the aim of the current PhD work is to assess the impact of antibiotics on intestinal microbiota of piglets. Two antibiotics i.e. colistin and ceftiofur, for which the main resistances include respectively chromosomal mutations and plasmid genes have been used. Colistin significantly reduced the population of Enterobacteriaceae, but there was no selection of resistant E. coli. The administration of ceftiofur had a limited impact on the bacterial populations that make up the digestive ecosystem but it led to strong selection and dissemination of a plasmid gene encoding an extended-spectrum beta-lactamase. Then, in the framework of regulations to reduce animal testing, an in vitro model of colonic pig named PigutIVM was developed in order to simulate the digestive environment of the piglet and then check the effect of colistin on the microbiota simulated in PigutIVM in vitro. Therefore both the approaches i.e. in vivo and in vitro were compared in order to check the effect of colistin on intestinal microbiota of piglets. This tool was then used to evaluate the impact of a probiotic i.e. Saccharomyces cerevisiae, as alternative to antibiotics. Therefore we assume that this PigutIVM model should be positioned as a relevant predictive tool in the fields of nutritional and pharmacological investigations.

La fermentation des fibres alimentaires est l’une des fonctions majeures du microbiote intestinal humain. Les bactéries fibrolytiques synthétisent un grand nombre d’enzymes, appelées Glycoside Hydrolases (GH), indispensables à la déconstruction de la grande variété structurelle des polysaccharides pariétaux que nous ingérons. Au cours de ce travail, nous avons exploré, grâce à une approche de métagénomique fonctionnelle, l’organisation et les propriétés des systèmes enzymatiques bactériens impliqués dans la dégradation des glycanes de parois végétales dans l’intestin humain.En premier lieu, nous avons cherché à déterminer si les bactéries de la muqueuse iléale étaient capables de dégrader les fibres pariétales dans un contexte sain. Cette fonction étant généralement décrite pour le microbiote colique par extrapolation de travaux menés à partir de selles humaines, nos connaissances de la dégradation des fibres dans la partie haute du tractus digestif sont donc très limitées. Un total de 20 000 clones issus du métagénome bactérien d’une partie saine de la muqueuse iléale d’un individu a été criblé pour des activités de dégradation de la carboxymethylcellulose et du xylane, deux substrats modèles des polysaccharides pariétaux. Douze clones métagénomiques positifs nous ont permis de mettre en évidence un arsenal de gènes bactériens codant pour des GH et d’autres protéines impliquées dans le métabolisme des fibres alimentaires dont certains organisés en PUL (Polysaccharide Utilization Loci), des clusters de gènes spécialisés dans la dégradation des polysaccharides complexes. Ces gènes proviennent de chromosomes bactériens assignés au genre Bacteroides ou à des espèces de Clostridiales, et codent pour des enzymes capables de dégrader également des β-glucanes à liaisons mixtes. L’étude de la prévalence de ces gènes dans les métagénomes de référence indique que plusieurs d’entre eux proviendraient de souches bactériennes plutôt spécifiques de la muqueuse iléale. De plus, certaines enzymes présentent des propriétés inédites potentiellement intéressantes dans le domaine biotechnologique. Nos recherches ont donc permis de revisiter la fonction fibrolytique du microbiote intestinal chez l’Homme et de proposer une localisation de cette fonction dès l’intestin grêle.Dans un second temps, en utilisant une approche méthodologique similaire, nous avons étudié la capacité du microbiote fécal d’un individu obèse à dégrader des polysaccharides pariétaux complexes, en général moins consommés par les individus obèses. Au total, nous avons identifié 50 clones appartenant à 14 espèces bactériennes des phyla suivants : Bacteroidetes, Firmicutes et Actinobacteria. Les inserts métagénomiques portent des gènes codant pour différentes familles de GH, impliquées dans la dégradation des polysaccharides d’intérêt. Les premières analyses de la prévalence de ces gènes chez plus d’une centaine d’individus (obèses ou non), par interrogations des catalogues de gènes microbiens de référence, suggèrent des associations avec le statut phénotypique « obèse ». / Among the crucial functions of the intestinal microbiota, extracting energy from food such as dietary fibres is of major importance. Facing the huge diversity of incoming complex carbohydrates, the fibrolytic bacteria synthesize a set of diversified Carbohydrate-Active Enzymes (CAZymes) including Glycoside Hydrolases (GH) that specifically disrupt complex polysaccharides. Here, using functional metagenomic approaches, we explored the organization and properties of bacterial enzymatic systems involved in the breakdown of plant cell wall (PCW) glycans in the intestinal tract.Firstly, we investigated the capacity of the microbiota associated to the human ileum mucosa to degrade complex non-starch polysaccharides in a healthy context. This function has never been investigated in this part of the intestine, but it has been rather associated to microorganisms inhabiting the colon, due to more accessible fecal samples. Using a fosmid library derived from a healthy part of the human ileal mucosa, we screened 20,000 metagenomic clones for their activities against carboxymethylcellulose and xylan chosen as models of the major PCW polysaccharides from dietary fibres. Twelve positive clones revealed a broad range of CAZyme encoding genes from Bacteroides to Clostridiales species, as well as Polysaccharide Utilization Loci (PUL). Functional GH genes were identified and break-down products examined from different polysaccharides including mixed-linkage β-glucans. Revealed CAZymes and PUL were also examined for their prevalence in human gut microbiomes. Part of them belongs to unidentified strains rather specifically established in the ileum. Others were enzymes unclassified in identified GH families or with original properties addressing novel candidates for biotechnological applications. Thus, we evidenced for the first time that the ileal mucosa associated-microbiota encompasses the enzymatic potential for PCW complex polysaccharide degradation that might start in the small intestine.In a second time, by using the same methodology, we harvested the enzymatic capacities of the fecal microbiota from an obese person to disrupt complex polysaccharides from dietary fibres usually consumed in lower quantity in obese people. This study aimed at examining the links between genes encoding enzymes specifically dedicated to PCW complex carbohydrates and the obese phenotypic status using reference microbial gene catalogs. We screened a fecal metagenomic library from an obese individual on representative PCW substrates and identified 50 clones belonging to 14 different species from the Bacteroidetes, Firmicutes and Actinobacteria phyla. The metagenomic inserts harbor genes encoding enzymes from GH families specific from complex carbohydrate degradation. First querying of the prevalence of these genes in hundreds individuals (obese and control), using catalogs of reference microbial genes, suggest associations with the "obese" phenotypic status.

La maladie alcoolique du foie (MAF) regroupe l’ensemble des lésions qui apparaissent suite à une consommation excessive et chronique d’alcool. A consommation d’alcool égale, les patients n’évolueront pas tous vers les formes sévères de la maladie. Le microbiote intestinal est un cofacteur déterminant dans la sévérité de la MAF. Parmi les métabolites fécaux entre des souris recevant le microbiote intestinal de patients avec des lésions sévères ou non, les acides biliaires ont été identifiés comme les plus discriminants. Le récepteur aux acides biliaires TGR5, exprimé sur les cellules de Kupffer, favorise leur profil anti-inflammatoire.Nous avons évalué l’impact du récepteur TGR5 dans la MAF chez des souris déficientes pour ce récepteur. La déficience en TGR5 aggrave la MAF, sans passer par une modulation de la cellule de Kupffer. C’est en fait le microbiote intestinal qui est impacté chez les souris déficientes pour TGR5, et qui médie cette aggravation.Par ailleurs, afin de moduler le microbiote intestinal au cours de la MAF, nous avons évalué le rôle de la pectine, qui favorise la croissance de certaines bactéries et peut chélater les acides biliaires. Malgré ses propriétés chélatantes, ce sont bien les modifications du microbiote intestinal induites par la pectine qui jouent un rôle protecteur et curatif dans la MAF.Ces différentes études devraient permettre d’identifier des cibles thérapeutiques potentiellement applicables chez des patients alcooliques et basées sur la modulation du microbiote intestinal. / Alcoholic liver disease (ALD) includes all the liver injuries occurring as a result of excessive and chronic alcohol consumption. Nevertheless, among heavy drinker, only a subset of individuals will develop severe liver injury. Intestinal microbiota was identified as a major player in the mechanisms involved in ALD. Moreover, bile acids were the most discriminant faecal metabolites between mice with or without liver injury. The bile acids receptor TGR5, which is expressed on Kupffer cells, promotes their anti-inflammatory profile.We assessed the role of bile acids receptor TGR5 in ALD using TGR5-deficient mice. TGR5-deficiency worsens ALD, but without modulating the Kupffer cells profile. However, intestinal microbiota is impaired in TGR5-deficient mice, and this is responsible for ALD worsening.Furthermore, in order to modulate the intestinal microbiota during ALD, we assessed the role of pectin, which is known to promote the growth of certain bacteria and that is a bile acids sequestrant. Despite its sequestrant properties, pectin-induced changes in intestinal microbiota play a protective and curative role in ALD.These studies will allow the identification of new therapeutic targets that could be used for alcoholic patients, using intestinal microbiota modulation.

Au cours des dernières années, l’immunothérapie a révolutionné le paysage en oncologie. L’anti-CTLA-4 a montré son efficacité sur la survie globale des patients atteints de mélanome métastatique. Cependant, ce traitement présente des limites à son utilisation telles que l'efficacité clinique obtenu chez seulement 20% des patients et la survenue fréquente de colites pouvant être sévères. La recherche de biomarqueurs prédictifs de réponse clinique et/ou de développement de toxicité devient maintenant un enjeu majeur pour sélectionner les patients pouvant avoir un bénéfice à l’utilisation de ces traitements. En partant de l’observation que les colites induites par l’anti-CTLA-4 présentent des similitudes avec les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, nous avons émis l’hypothèse de l’existence d’un microbiote intestinal associé à une dysrégulation du système immunitaire pouvant prédire la réponse clinique et/ou la survenue d’une colite induite par l’anti-CTLA-4. Nous avons montré dans une cohorte de patients atteints de mélanome métastatique et traités par ipilimumab, qu'un microbiote intestinal enrichi en Faecalibacterium et autres Firmicutes est associé à une meilleure survie globale et sans progression ainsi qu'un risque accru de développer une colite. Les patients avec une flore enrichie en Firmicutes présentent également après traitement par ipilimumab, une activation lymphocytaire plus efficace. Par la suite, nous nous sommes intéressés aux métabolites issus du microbiote fécal et leur implication dans la réponse à l'anti-CTLA-4. Le butyrate est le principal métabolite produit par les Firmicutes. Nous avons observé chez la souris, une inhibition de l'efficacité anti-tumorale de l'anti-CTLA-4 lorsqu'elles étaient supplémentées en butyrate. In vivo, nous avons montré que le butyrate inhibe la surexpression sur les cellules dendritiques, des molécules CD80 et CD86 (molécules B7) induite par l'anti-CTLA-4. Cette immaturité des cellules dendritiques entraine un défaut d'activation des lymphocytes T spécifiques d'antigènes dépendant de l'axe CD28/B7 réduisant ainsi l'efficacité anti-tumorale. Chez l'Homme, nous avons valider cette hypothèse en montrant qu'une concentration sérique élevée en butyrate est associée à une diminution de la survie globale et sans progression comparativement aux patients avec un faible niveau de butyrate sérique.Ces travaux mettent en évidence le lien entre la composition du microbiote et les réponses immunologiques au blocage du CTLA-4. Ils apportent une explication sur un lien indirect via le butyrate entre la composition du microbiote intestinal et la réponse anti-tumorale aux immunothérapies. / In the last years, immunotherapy has revolutionized the landscape in oncology. The efficacy of anti-CTLA-4 has been demonstrated by improving overall survival of patients with metastatic melanoma. However, this treatment has limitations to its use such as the clinical efficacy obtained in only 20% of patients and the high incidence of severe colitis. Predictive biomarkers of clinical response and / or toxicity development are mandatory for a better selection of patients who will benefit from this treatment. Based on the observation that anti-CTLA-4-induced colitis has similarities with inflammatory bowel disease, we hypothesized that the gut microbiota associated with dysregulation of the immune system may predict the clinical response and / or occurrence of anti-CTLA-4-induced colitis.In a cohort of patients with metastatic melanoma treated with ipilimumab, we have shown that a gut microbiota enriched with Faecalibacterium and other Firmicutes is associated with a better of overall and progression-free survival as well as an increased risk of developing colitis. Firmicutes-driven microbiota is also associated with an improvement in lymphocyte T activation after ipilimumab treatment. Subsequently, we were interested in microbial metabolites and their involvement in the clinical response to anti-CTLA-4. Butyrate is the main metabolite produced by the Firmicutes. In mice, we observed an inhibition of anti-tumor effect of anti-CTLA-4 in butyrate-supplemented mice. In vivo, we have shown that butyrate inhibits the overexpression on dendritic cells, of CD80 and CD86 molecules (B7molecules) induced by anti-CTLA-4. This immaturity of the dendritic cells leads to a poor signaling of CD28 / B7 axis and activation of antigen-specific T-cells, thereby reducing anti-tumor efficacy. In humans, we validated this hypothesis by showing that a high serum concentration of butyrate is associated with decreased overall and progression-free survival compared to patients with low serum butyrate levels.This studie highlights the link between the composition of gut microbiota and the immunological responses to CTLA-4 blockade. They provide an explanation of an indirect link via butyrate, between the composition of the gut microbiota and the anti-tumor response to immunotherapies.

Les douleurs abdominales chroniques, souvent associées à une hypersensibilité viscérale d’origine colique (HSVC), sont l’un des symptômes majeurs constatés lors du syndrome de l’intestin irritable (SII). Le SII est une colopathie chronique fonctionnelle touchant environ 11% de la population mondiale et altérant significativement la qualité de vie des patients. L’étiologie multifactorielle de cette pathologie rend la physiopathologie complexe. Les gastroentérites infectieuses ont été décrites comme l’un des facteurs de risque dans le développement du SII-post-infectieux (SII-PI). Le SII-PI survient en effet dans 4 à 31% des cas suite à une gastroentérite aigüe d’origine bactérienne, virale ou parasitaire. Ces infections peuvent avoir de nombreuses répercussions et en particulier sur l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale, le système immunitaire ou encore sur le microbiote intestinal. Par ailleurs, suite à une infection parasitaire, le risque de développer un SII est de 40% contre seulement 14% suite à une infection bactérienne.Blastocystis est le parasite intestinal le plus fréquemment retrouvé chez l’Homme. Néanmoins, malgré de récentes études épidémiologiques rapportant une plus forte prévalence de ce parasite chez les patients atteints de SII, son rôle en santé humaine reste débattu. De plus, d’autres études rapportent que les individus porteurs de ce parasite présentent des douleurs abdominales et sont atteints d’une dysbiose intestinale. Actuellement, l’absence d’un modèle animal d’infection par Blastocystis reproductible ne permet pas d’étudier les mécanismes physiopathologiques liés à l’infection et donc d’explorer la contribution éventuelle de ce parasite dans le SII.Les objectifs de ce travail de thèse étaient tout d’abord de mettre en place un modèle murin d’infection expérimentale par Blastocystis pour dans un deuxième temps évaluer si ce parasite est capable d’induire une HSVC et une dysbiose intestinale avec l’objectif d’établir un nouveau modèle de SII d’origine infectieuse chez le rat. Pour répondre au premier objectif, le pouvoir infectieux de différents sous-types et différentes formes du parasite (formes vacuolaires ou kystes), isolés de cultures axéniques ou purifiés à partir de selles de patients et d’animaux a été évalué chez des animaux de laboratoire (rats et souris). Nous avons ainsi réussi à établir un modèle reproductible d’infection chronique par Blastocystis chez le rat de laboratoire à l’aide de kystes purifiés à partir de selles humaines.L’utilisation de ce modèle in vivo, nous a permis de mettre en évidence que le sous-type 4 (ST4) de Blastocystis induit une HSVC sans origine inflammatoire chez les rats expérimentalement infectés. De plus, les animaux développent un comportement type anxio-dépressif corrélé à l’HSVC. La dysbiose intestinale associée à l’infection se caractérise par une augmentation de la richesse bactérienne et une diminution du ratio Firmicutes/Bacteroidetes. Par ailleurs, nous avons corrélé l’HSVC à l’augmentation de l’abondance relative du genre Bacteroides et la diminution de l’abondance relative de la famille des Clostridiaceae, bactéries productrices d’acides gras à chaine courte (AGCC). Une diminution des taux d’AGCC fécaux a d’ailleurs été constatée chez les rats infectés. De plus, nous avons mis en évidence une augmentation de l’activité de protéases à sérine dans les fèces des animaux infectés pouvant expliquer l’HSVC.Ces données suggèrent qu’une infection gastro-intestinale par Blastocystis serait associée à une hypersensibilité viscérale d’origine colique (HSVC) et à un déséquilibre de la flore intestinale (dysbiose). Ainsi, ce nouveau modèle d’infection pourrait être un bon modèle de SII d’origine infectieuse et pourrait donc contribuer à un meilleur diagnostic et au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des pathologies chroniques de l’intestin chez certains individus. / Chronic abdominal pain often associated with colonic hypersensitivity (CHS) is one of the major symptoms of irritable bowel syndrome (IBS). IBS is a functional chronic disorder affecting ~11% of worldwide population and disturbing patients’ quality of life. Etiology is multifactorial and thus pathophysiology is complex and remains poorly understood. Infectious gastroenteritis has been described as one of the risk factors for development of post-infectious IBS (PI-IBS). PI-IBS can occur in 4-31% of patients following acute gastroenteritis of bacterial, viral or parasitic origin. Numerous studies support a role for pathogen-mediated modifications in the resident intestinal microbiota, epithelial barrier integrity and immune activation in PI-IBS. Interestingly, the risk of IBS is highest with protozoal enteritis, with ~40% of individuals developing IBS against ~14% following bacterial infection. Blastocystis is the most common intestinal parasite found in human intestinal tract. Nevertheless, clinical relevance remains controversial, despite recent epidemiological studies showing a higher prevalence of this parasite in IBS patients. Interestingly, studies report that individuals carrying Blastocystis display abdominal pain and intestinal dysbiosis. Currently, the lack of reproducible animal model of Blastocystis infection does not allow to study the pathological mechanisms related to infection and thus to explore the potential contribution of this parasite in IBS.The aims of this study were first to develop a murine model of Blastocystis infection and then to investigate whether this parasite could lead to the development of intestinal dysbiosis associated CHS with the aim of developing a new PI-IBS rat model.The first aim was to evaluate the infectivity of different parasitic subtypes and stages (vacuolar and cystic forms) isolated from axenic cultures or purified from human or animal feces, into laboratory animals (rats and mice). Interestingly, we succeeded in the development of a reproducible model of chronic infection by Blastocystis in laboratory rats using cysts purified from human stool.Using this animal model, we found that Blastocystis ST4 induced non inflammatory CHS in infected rats. In addition infected rats developed anxiety- and depressive-like behavior correlated with CHS. Infection associated intestinal dysbiosis was characterized by increased bacterial richness and decreased Firmicutes/Bacteroidetes ratio. Interestingly, we correlated CHS with the increase in the relative abundance of genus Bacteroides and the decrease in the relative abundance of the family Clostridiaceae, some bacteria producing Short Chain Fatty Acids (SCFAs). Indeed, fecal SCFAs levels were decreased in infected rats. These decreases were correlated with the relative abundance of genus Oscillospira which was also described increased in Blastocystis individual carriers. In addition, we have demonstrated an increase in fecal serine protease activity in infected animals that may explain development of CHS.These data suggest that a gastrointestinal infection with Blastocystis may be associated with the establishment of intestinal dysbiosis associated CHS. Thus, this new infectious model could be a good model of PI-IBS and could therefore contribute to a better diagnosis and development of new therapeutic strategies for chronic bowel diseases.

Grâce aux avancées de la technologie et nouvelles stratégies OMICS, de nombreuses études se sont intéressées au microbiote vaginal ces dernières années. Elles ont révélé l'impact de ce dernier sur la santé de la femme. En effet, un déséquilibre de la flore vaginale la rend vulnérable, la prédisposant à la vaginose bactérienne ainsi qu’à des complications gynéco-obstétricales sévères. La pathogénèse de la vaginose reste encore méconnue et le traitement classique par antibiothérapie échoue dans plus de 50% des cas. En analysant 50 prélèvements vaginaux provenant de patientes atteintes de vaginose et de femmes saines vivant en France et au Sénégal, nous avons constaté une plus grande diversité bactérienne chez les patientes par rapport aux témoins avec l'augmentation d'espèces telles que Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae ainsi que les procaryotes sensibles à l'oxygène, y compris les Cocci anaérobies à Gram-positif et les Prevotella. Les femmes saines renfermaient plus d’espèces de Lactobacillaceae et de Proteobacteria dans leurs flores. La combinaison de la métagénomique et la culturomique a permis d’identifier un complexe de 11 espèces/genres bactériens associés à la vaginose. L’utilisation de la culturomique a permis d’accroître le répertoire des bactéries humaines avec l’isolement de 27 nouvelles espèces. Le faible taux de recouvrement entre les données de métagénomique et celles de culturomique montre la nécessité de persévérer dans l’isolement des bactéries par culturomique. L’obtention d'isolats permettra d'explorer in vitro les compétitions entre les bactéries et pourrait servir également de matière première pour développer un traitement par bactériothérapie / Over the last decades, thanks to the technologic progresses including advanced molecular techniques and new OMICS strategies, many studies have focused on the vaginal microbiota. Thus, revealing the impact of the vaginal flora on women health. Indeed, the disruption of the vaginal bacterial community makes it prone to bacterial vaginosis and severe obstetrical and gynecological disorders. The pathogenesis of bacterial vaginosis is still unknown, and relapses are very frequent. Conventional treatment with antibiotic therapy fails in more than 50% of cases. The analysis of 50 vaginal samples from bacterial vaginosis patients and healthy women living in France and Senegal, showed a higher bacterial diversity in patients compared to controls with the increase of species such as Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae as well as oxygen-sensitive prokaryotes including Gram-positive anaerobic cocci, and Prevotella spp. Healthy women harbored more Lactobacillaceae species and Proteobacteria in their microbiota. The combination of metagenomics and culturomics has allowed the identification of a complex of 11 bacterial species/genera associated with bacterial vaginosis. The use of the culturomics approach has extended the repertoire of human-associated bacteria, with the isolation of 27 new bacterial species. The low range overlap between metagenomic and culturomics data indicates the need to continue the isolation of bacteria by culturomics. Obtaining isolates will make it possible to explore in vitro the competitions between the bacteria but can also be used as primary material for the development new treatments by bacteriotherapy

Les maladies inflammatoires à médiation immunitaire représentent un groupe de maladies cliniquement distinctes mais liées par de multiples mécanismes pathogéniques inflammatoires sous- jacents, associant facteurs génétiques, immunitaires et environnementaux. La pathogenèse de ces maladies n’est toujours pas complètement établie, en particulier l’importance et les interactions entre ces différents facteurs, mais leur étude a permis d’établir un lien entre diverses maladies, comme les spondylarthropathies et les maladies des barrières épithéliales telles que le psoriasis et les maladies inflammatoires de l’intestin. En effet, ces dernières partagent des voies biologiques communes perturbées, notamment au niveau de l’immunité de type 3.Afin d’étudier les interactions entre les articulations, la peau et l’intestin dans un contexte inflammatoire, nous avons utilisé un modèle murin développant un syndrome inflammatoire spontané multi-organique lié à une déficience en tristétraproline, qui est une protéine impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle de nombreuses cibles inflammatoires. Ce syndrome présente des similitudes avec le groupe des spondylarthropathies, par l’atteinte des articulations et de la peau, et une dépendance au TNFα et à l’IL-23. Dans ce contexte, nous avons investigué les bases cellulaires et moléculaires responsables de ce syndrome spontané, et les liens entre les différents organes, grâce à des approches transgéniques et interventionnelles.Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux interactions entre la peau et les articulations. Nous avons montré qu’une inflammation cutanée se développait en l’absence de tristétraproline, liée à une dérégulation de l’immunité de type 3 et que la tristétraproline avait un rôle essentiel au sein des kératinocytes dans le maintien de l’homéostasie cutanée, mais également dans le contrôle d’une inflammation systémique et articulaire. Nous avons ensuite étudié plus spécifiquement le rôle de la tristétraproline au niveau de l’homéostasie intestinale. Nous avons observé que la perte de tristétraproline n’entraînait pas de pathologie intestinale franche grâce à la présence de mécanismes régulateurs locaux tels qu’une expansion intestinale de lymphocytes T régulateurs et de cellules lymphoïdes innées du groupe 3, et que la perte de la tristétraproline au sein des cellules épithéliales intestinales ne perturbait pas l’homéostasie intestinale. Par contre, la modulation du microbiote intestinal a permis de montrer son impact direct sur le contrôle de l’inflammation locale mais également sur les manifestations systémiques de ce syndrome spontané. Enfin, la modulation des voies de détection microbienne a montré de façon plus complexe un rôle amplificateur ou inhibiteur selon les compartiments investigués.En conclusion, malgré une complexité liée aux différents types cellulaires probablement impliqués et au nombre d’organes atteints, ce modèle murin spontané a donc permis une étude plus détaillée des liens entre la peau, les intestins et les articulations dans un contexte inflammatoire, ainsi que le rôle du microbiote, dans le but d’une meilleure compréhension de la pathogenèse de maladies inflammatoires humaines et de leur prise en charge. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Un nombre grandissant d’associations entre diverses pathologies humaines et dysbiose intestinale (définie ici comme altération de la composition du microbiote par rapport à sa composition habituelle) sont observées. Parmi les facteurs qui pourraient induire la dysbiose, les bactériophages (dit phages), sont des candidats pertinents par leur fonction prédatrice.L’objectif de la thèse a été de déterminer si les prophages de souches bactériennes du microbiote intestinal humain ont un impact négatif sur la stabilité de leur hôte dans l’intestin. Pour cela, nous avons utilisé des souris sans germes primo-colonisées avec la souche Escherichia coli LF82, puis inoculées soit avec Faecalibacterium prausntizii A2-165, soit avec Roseburia intestinalis L1-82, deux souches appartenant aux espèces dominantes du microbiote intestinal humain. Chacune de ces souches possède deux prophages dans son génome, Lagaffe et Mushu pour F. prausnitzii, Jekyll et Shimadzu pour R. intestinalis. L’impact des prophages a également été étudié lors d’une inflammation intestinale induite au DSS.Pour la combinaison F. prausnitzii/E. coli, aucun des deux prophages de F. prausnitzii n’a d’activité délétère pour son hôte bactérien chez la souris, même durant une inflammation induite au DSS. Afin de mieux caractériser l’ensemble des prophages présents chez cette espèce, une analyse bio-informatique effectuée sur 15 souches de F. prausnitzii a permis de constater que la prévalence de Mushu et Lagaffe était faible, mais aussi de découvrir une remarquable richesse phagique : au total, 18 espèces de prophages répartis en nouveaux 8 genres viraux ont été décrits. Une étude in silico de l’abondance de ces phages dans les viromes intestinaux humains a révélé que des phages du genre ‘Lugh’ et ‘Epona’ sont plus souvent présents et/ou abondants dans les viromes de patients des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) que chez les individus sains. Sachant que les patients atteints de MICI ont une population appauvrie de F. prausnitzii dans leur microbiote, ces observations suggèrent une activité accrue de ces phages pendant la maladie : ils pourraient déclencher ou aggraver la baisse de population de F. prausnitzii dans les patients, participant ainsi à l’aggravation des symptômes des MICI.Avec la combinaison R. intestinalis/E. coli., aucune variation de population ou effet délétère du phage Jekyll n’a pu être observé. En revanche, la population du phage Shimadzu est loin d’être stable. Dans toutes les souris, et même en l’absence d’un traitement au DSS, un mutant virulent de Shimadzu émerge, appelé Shi-vir. Ce mutant lyse massivement la population intestinale de R. intestinalis, menant à un effondrement de la population hôte. La population bactérienne remonte ensuite à son niveau initial grâce à l’émergence de mutants bactériens résistants à l’infection. Cette résistance a essentiellement pour origine l’acquisition d’un espaceur associé au système CRISPR-Cas de type IIC de R. intestinalis, et dirigé contre le phage Shimadzu. Cependant, l’acquisition de cet espaceur ne peut se faire sans qu’une sous-population de R. intestinalis soit préalablement guérie du prophage Shimadzu, sans quoi un tel espaceur tuerait la bactérie.J’ai ainsi démontré qu’un prophage peut déstabiliser sa population hôte dans l’environnement intestinal et créer des dysbioses intestinales transitoires. La pression de sélection qui résulte de l’infection par le phage Shi-vir a permis l’accélération de l’évolution de l’hôte bactérien.En conclusion, une fraction des phages tempérés du microbiote intestinal pourrait avoir un impact négatif sur la stabilité de sa population hôte dans l’environnement intestinal, soit parce le ratio phage/bactérie augmente dans cet environnement (cas des phages Lugh et Epona de F. prausnitzii), soit parce qu’il évolue vers la virulence (cas de Shi-vir chez R. intestinalis) et induit une dysbiose transitoire. / A growing number of associations is observed between various human pathologies and intestinal dysbiosis, here defined as an alteration of the microbiota composition. Among the potential factors inducing dysbiosis, bacteriophages, called phages, are relevant candidates by their predatory function.The aim of the thesis was to determine whether prophages of bacterial strains from the human gut microbiota have a negative impact on the stability of their host in the gut environment. We studied this question by using germ-free mice colonized first with Escherichia coli strain LF82, then inoculated with two bacterial strains belonging to dominant species of the human intestinal microbiota, Faecalibacterium prausnitzii strain A2-165 or Roseburia intestinalis strain L1-82. Each of these strains has two prophages in its genome, Lagaffe and Mushu for F. prausnitzii, Jekyll and Shimadzu for R. intestinalis. The impact of these prophages was also studied during intestinal inflammation using DSS (Dextran Sulfate Sodium)-induced colitis in mice.In mice colonized with F. prausnitzii and E. coli , prophages of F. prausnitzii did not have any deleterious activity for the bacterial host, even during DSS-induced inflammation. In order to better characterize prophages of the F. prausnitzii species, a bioinformatic analysis carried out on 15 strains of F. prausnitzii highlighted that the prevalence of Mushu and Lagaffe was low. However, this analysis revealed also an enormous diversity of phages and we described 18 species of prophages divided into 8 new proposed genera. An in silico study of their abundance in 173 human intestinal viromes revealed that the phage genera 'Lugh' and 'Epona' were more present and/or abundant in viromes of Inflammatory Bowel Disease (IBD) patients compared to healthy subjects. Given that IBD patients have lower populations of F. prausnitzii in their microbiota compared to healthy subjects, our observations suggest an increased activity of these phages during disease. They may trigger or worsen population decline of F. prausnitzii in patients, participating thus to the aggravation of IBD symptomsIn mice colonized with R. intestinalis and E. coli, we did not observe variation of Jekyll population or deleterious effect of this phage on its host. In contrast, the Shimadzu population was not stable. Indeed, even in the absence of DSS treatment we observed in all mice the emergence of a virulent mutant of Shimadzu, called Shi-vir. This mutant massively lysed R. intestinalis, leading to a collapse of the bacterial host population. Then this population rose back to its original level thanks to the emergence of bacterial mutants resistant to the viral infection. This resistance was mainly due to the acquisition of a spacer associated with the CRISPR-Cas type IIC system of R. intestinalis, directed against the Shimadzu phage. However, acquisition of this spacer could not be observed unless the Shimadzu prophage was cured from the strain, showing that this spacer would kill the Shimadzu lysogen.I have shown therefore that a prophage can destabilize its host population in the intestinal environment and create transient intestinal dysbiosis. I have also highlighted that the selection pressure imposed by an ex-temperate phage infection, the Shi-vir phage, has allowed an acceleration of its host evolution.Overall, this work establishes that a fraction of the temperate phages present in intestinal microbiota may impact negatively bacterial population stability, either because the phage/bacteria ratio increases (for the Lugh and Epona phages de F. prausnitzii), or because the temperate phage evolves towards virulence (case of the Shi-vir mutant on R. intestinalis), and induces a transient dysbiosis.

L’obésité et le surpoids sont aujourd’hui des problèmes de santé majeurs au niveau mondial touchant près de 1,9 milliard d’adultes. Cet état physiologique se définit comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme avec des conséquences néfastes sur la santé. L’obésité tient son origine d’un déséquilibre de la balance énergétique résultant d’une consommation excessive de calories par rapport aux dépenses énergétiques. En accord avec cette idée, les lipides alimentaires représentent les macronutriments les plus caloriques dont la biodisponibilité est assurée par l’intestin. L’accumulation excessive de ces lipides dans les tissus tel que le foie, le tissu adipeux et les vaisseaux sanguins déclenche une inflammation bas-bruit. Cette inflammation bas-bruit est souvent associée à une augmentation modérée de l’endotoxémie métabolique, c’est-à-dire du taux sanguin des lipopolysaccharides bactériens provenant du microbiote intestinal.Dans un premier temps, les travaux de cette thèse avaient pour objectif de définir la contribution de l’intestin dans la mise en place de cette endotoxémie métabolique à travers le rôle du récepteur CD36. En effet, il est montré que ce récepteur participe à la biodisponibilité des lipides en favorisant leur absorption et la formation des chylomicrons qui véhiculent les lipopolysaccharides. Les données obtenues ont permis de montrer que CD36 participe aux situations d’endotoxémie métabolique en régulant l’écologie microbienne du site d’absorption des lipides alimentaires.Dans un second temps, ces travaux se sont intéressés à la contribution de la réponse inflammatoire dans les mécanismes d’absorption des lipides alimentaires au travers du rôle de l’inflammasome NLRP3. Ils ont permis de montrer que cet inflammasome participe à la digestion et à l’absorption des lipides alimentaires lors d’un régime hyperlipidique obésogène.L’ensemble de ces données permet d’établir le rôle majeur de l’intestin dans la mise en place de l’endotoxémie et des processus inflammatoires conduisant à une situation d’obésité. De plus, le récepteur CD36 et l’inflammasome NLRP3 pourrait constituer des cibles thérapeutiques de choix pour limiter la mise en place de cet état physiologique. / Nowadays, obesity and overweight are major health problems affecting nearly 1.9 billion adults. This physiological state is defined as an excessive accumulation of fat mass in the body with harmful consequences on health. Obesity is caused by a disequilibrium in the energy balance resulting from an excessive calorie consumption in relation to the energy expenditure. According to this concept, dietary fats represent the most caloric macronutrients whose bioavailability is ensured by the intestine. Excessive accumulation of these lipids in tissues such as liver, adipose tissue and blood vessels triggers low-grade inflammation. This low-grade inflammation is often associated with a moderate increase in metabolic endotoxemia, i.e. an increase in the blood level of bacterial lipopolysaccharides coming from the intestinal microbiota.First, the aim of this thesis was to elucidate the contribution of the intestine to the development of the metabolic endotoxemia through the role of the CD36 receptor. Indeed, this receptor participates in the bioavailability of dietary lipids by promoting their absorption and the formation of chylomicrons able to carry the lipopolysaccharides. The data obtained showed that CD36 could participates in metabolic endotoxemia situations by regulating the microbial ecology of the food lipid absorption site.In a second step, this work focused on the contribution of the inflammatory response to the absorption mechanism of dietary lipids through the role of the NLRP3 inflammasome. It showed that this inflammasome is involved in the digestion and absorption of dietary lipids in high-fat diet-induced obesity.The data obtained allow to establish the major role of the intestine in the development of endotoxemia and inflammation during the development of obesity. In addition, the CD36 receptor and the NLRP3 inflammasome may be therapeutic targets to limit the development of this physiological condition.