Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont des pathogènes zoonotiques responsables de toxi-infectionsalimentaires pouvant évoluer vers des atteintes potentiellement mortelles chez l’Homme. La survie des EHECet l’expression des gènes de virulence dans l’environnement digestif humain sont des facteurs essentiels dans laphysiopathologie de ces infections mais sont mal connus, essentiellement par manque de modèles d’études adaptés.L’absence de traitement spécifique a conduit à s’intéresser à des moyens préventifs et/ou curatifs alternatifs, commel’utilisation de probiotiques. L’objectif de ce travail de thèse est d’étudier le comportement de souches EHEC dansl’ensemble du tractus digestif et l’influence de souches probiotiques, en utilisant des approches in vitro et in vivocomplémentaires.In vitro, dans le tractus gastro-intestinal supérieur, on observe une mortalité bactérienne dans l’estomac, suivie d’unereprise de croissance dans les parties distales de l’intestin grêle. De plus, la survie des EHEC dépend à la fois de lasouche/sérotype étudié et de la matrice alimentaire dans laquelle les bactéries sont ingérées. En conditions coliqueshumaines simulées, les EHEC sont progressivement éliminés du milieu colique et leurs principaux gènes de virulence(stx1 codant la Shiga-toxine 1 et eae codant l’intimine) sont surexprimés dans les heures suivant l’inoculation dupathogène. L’ajout de levures probiotiques du genre Saccharomyces ne modifie pas la survie du pathogène dansl’environnement colique, que celles-ci soient administrées en traitement « curatif » ou « prophylactique ». Parcontre, l’administration de S. cerevisiae CNCM I-3856 permet (i) de moduler favorablement l’activité fermentairedu microbiote intestinal, en augmentant la production d’acétate et en réduisant celle du butyrate et (ii) de diminuersignificativement l’expression de stx1. Par ailleurs, l’effet du pathogène et des probiotiques sur le microbiote coliqueest individu dépendant, confortant l’hypothèse que des facteurs associés à l’hôte, comme le microbiote, pourraientconditionner l’évolution clinique des infections à EHEC et l’efficacité d’une stratégie probiotique. Enfin, dans unmodèle murin d’anses iléales, l’administration préventive de S. cerevisiae CNCM I-3856 limite significativementl’interaction d’O157:H7 avec les plaques de Peyer et les lésions hémorragiques associées.Ces résultats confirment donc l’intérêt d’une stratégie probiotique dans le contrôle des infections à EHEC. Uneétude plus approfondie du transcriptome du pathogène dans l’environnement digestif humain, en présence ou non deprobiotiques, permettrait de mieux comprendre la physiopathologie des infections à EHEC et les mécanismes associés / The enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are zoonotic pathogens that cause food-borne infection withwhich leads to life-threatening damage in humans. EHEC survival and expression of virulence genes in the humandigestive track are key factors in the pathogenesis of these infections, but little is known, mainly due to lack ofappropriate study models. The absence of specific treatment has led to an interest in preventive and/or alternativemeasures healing, such as the use of probiotics. The objective of this study is the behavior of EHEC strains in theentire digestive tract and the influence of probiotic strains, using in vitro and in vivo complementary approaches.In vitro, in the upper gastrointestinal tract, a bacterial mortality was observed in the stomach, followed bya bacterial resumption in the distal segment of the small intestine. Moreover, survival depends on both theEHEC strain/serotype studied and the food matrix in which the bacteria are ingested. In simulated humancolon conditions, EHEC was progressively eliminated from the bioreactor and the major virulence genes (stx1encoding Shiga-toxin 1 and eae encoding intimin) are overexpressed in the hours following the inoculation ofpathogen. Probiotic yeasts Saccharomyces genus does not modify the survival of the pathogen in the in vitro colonicenvironment, that they be administered in treatment "curative" or "prophylactic". Still, the administration ofS. cerevisiae CNCM I-3856 allows (i) to favorably modulate fermentation activity of the intestinal microbiota, byincreasing the production of acetate and reducing that of butyrate and (ii) reduce significantly the expression ofstx1. Furthermore, the effect of pathogenic and probiotic on colonic microbiota is donor-dependent, supporting thehypothesis that factors associated with the host, as the microbiota could condition the clinical course of EHEC andefficiency a probiotic strategy. Finally, in a murine model of ileal loops, preventive administration of S. cerevisiaeCNCM I-3856 significantly limits the interaction of O157:H7 with the Peyer’s patches and results hemorrhagic lesions.These results confirms the interest of probiotic strategy in controlling EHEC infections. Further transcriptomestudies are warranted for the pathogen in the human digestive environment, with or without probiotics for the betterunderstanding of the pathophysiology of EHEC and so on the mechanisms involved in the antagonistic effect ofprobiotics.

Demodex est un genre d’acariens dont deux espèces sont connues pour coloniser la peau de l’homme : Demodex folliculorum et Demodex brevis. Leur implication dans le développement de la rosacée reste controversée. Cette maladie est caractérisée par une inflammation chronique de la peau et est définie en quatre sous-type majeurs : la rosacée érythémato-télangiectasique (ETR), la rosacée papulopustuleuse (PPR), la rosacée phymateuse et la rosacée oculaire. Certains pensent que le rôle des acariens est principalement d’exacerber une inflammation déjà enclenchée. Toutefois, l’isolation par culture d’un Bacillus oleronius à partir du broyat d’un Demodex de patient atteint de rosacée papulopustuleuse ont remis sur le devant de la scène le rôle de l’acarien en tant que vecteur de bactéries pathogènes. Le but de notre étude était de décrire le microbiote associé au Demodex par clonage du gène de l’ARN ribosomal 16S afin d’identifier par la suite d’éventuelles différences en fonction du statut de l’hôte (ETR, PPR ou sain). Le microbiote décrit présentait une diversité jusqu’alors insoupçonnée. Une partie des espèces identifiées n’avaient jamais été rapportées chez l’homme, pouvant donc correspondre au microbiote spécifique de l’acarien. Il serait composé comme d’une majorité de Protéobactéries. De manière intéressante, les proportions des phyla majeurs étaient différentes en fonction du groupe étudié. De plus, il semblerait que certaines espèces soient spécifiques des Demodex collectés chez des patients atteints de rosacée. Par exemple, Bartonella quintana n’a été détectée qu’à partir de Demodex d’une patiente atteinte de rosacée érythémato-télangiectasique. / Demodex is a genus of mites comprising two species known to colonize human skin: Demodex folliculorum and Demodex brevis. Their role in the pathogenesis of rosacea remains controversial. Rosacea is defined by a chronic inflammation of the skin and four main subtypes are defined : erythematotelangiectasic rosacea (ETR), papulopustular rosacea (PPR), phymatous rosacea and ocular rosacea. Mites are thought to be only involved in the exacerbation of a pre-existing inflammation. The growth of Bacillus oleronius from a crushed Demodex mite collected on a PPR patient gave rise to a new hypothesis that the mite is actually the vector of pathogenic bacteria. Present study aimed at describing the microbiote associated with Demodex mites by a 16S rRNA clone library approach. This allowed us to compare the obtained bacterial communities according to the group of patients the mites were collected from (erythematotelangiectasic rosacea, papulopustular rosacea or healthy subjects). The microbiota described here revealed an unexpected diversity. Part of the identified species had never been reported on human beings and could thus represent the microbiota specific to Demodex. As in many arthropods, this microbiota was predominantly composed of Proteobacteria. Interestingly, the proportion of the main phyla Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria differed according to the host status. Though, some species appeared to be specific to Demodex collected from patients with erythematotelangiectasic rosacea or papulopustular rosacea. Among them, we identified Bartonella quintana only from a mite collected on a patient with erythematotelangiectasic rosacea.

La santé digestive du lapin est difficile à maîtriser en élevage, notamment en période de sevrage où des troubles digestifs sont fréquents et peuvent entraîner des pertes importantes. Bien que l’utilisation d’antibiotiques diminue, afin d’éviter l’apparition de problèmes de résistance, des solutions alternatives doivent être trouvées. Nos principaux objectifs étaient : i) d’étudier l’influence de l’incorporation de fibres rapidement fermtentescibles (FRF) dans un aliment distribué précocement dès 15 jours d’âge, en comparaison d’un aliment avec antibiotiques (tiamuline et apramycine) utilisés pour lutter contre l’entéropathie épizootique du lapin ; ii) de déployer des méthodologies en génomique ciblant l’espèce lapin (amélioration et réannotation d’un microarray) et son microbiote digestif (pipeline d’analyse du gène de l’ARNr 16S), pour du phénotypage moléculaire. L’originalité de notre travail réside ainsi dans l’acquisition de données par trois approches complémentaires : phénotypique, transcriptomique, et métagénomique. Au niveau phénotypique, la stimulation de l’activité fermentaire par les FRF est vérifiée avec une hausse de la concentration caecale en AGV (+20%) et une plus forte acidité du biotope caecal. De plus, les FRF tendent à réduire la mortalité en post-sevrage et améliorent l’efficacité alimentaire. Au niveau transcriptomique, nous avons tout d’abord apporté de nouvelles connaissances sur l’immunité du lapin adulte avec la stimulation in vitro de cellules mononuclées du sang périphérique par du LPS et de la PMA-ionomycine. Cette étude confirme l’importance du lapin comme animal modèle pour la recherche biomédicale. Chez le jeune lapin, la nouvelle version du microarray nous a permis de montrer que les fonctions biologiques sont plus rapidement mises en place avec les FRF qu’avec un aliment standard, et que les antibiotiques nivellent l’expression génique. De plus, les FRF contribueraient à limiter l’inflammation intestinale. Au niveau métagénomique et en ciblant l’ARNr 16S, nous montrons qu’une augmentation de l’activité microbienne caecale n’est pas associée à une modification majeure de la composition du microbiote, à l’exception de la stabilisation de l’abondance des Campylobacteraceae, qui limiterait l’inflammation digestive. Nos travaux, encore préliminaires, n’ont pas permis d’identifier des corrélations significatives entre l’expression génique dans le sang et/ou l’iléon, et les profils taxonomiques (OTUs) majoritaires du microbiote digestif. L’ensemble de nos résultats suggère d’une part que les FRF peuvent être proposées comme une nouvelle stratégie nutritionnelle péri-sevrage, avec une amélioration de l’efficacité alimentaire et une protection accrue de la santé digestive, et d’autre part que des approches génomiques sont prometteuses pour qualifier finement les phénotypes d’intérêt chez le lapin. / Digestive health of rabbits is difficult to manage in breeding systems, especially around weaning where digestive problems are very common and can result in significant losses. The use of antibiotics decreases in order to avoid the emergence of problems with antibiotic resistance, but alternatives must be found. The objectives of this work were: i) to study effects of the incorporation of rapidly fermentable fiber (FRF) in diets fed to rabbits from 15 days of age, and compared to a feed with antibiotics (tiamulin and apramycin), used to fight against epizootic rabbit enteropathy; ii) to deploy genomics methodologies targeting the rabbit species (improvement and re-annotation of a microarray) and the digestive microbiota (pipeline analysis of 16S rRNA gene), for molecular phenotyping. An innovative approach was used in this work through the combination of three complementary approaches: phenotypic, transcriptomic, and metagenomic. At the phenotypic level, the stimulation of the fermentation activity by FRF is verified with higher cecal VFA concentrations (+ 20%) and higher cecal acidity. Moreover, the FRF tend to reduce mortality post-weaning and improve feed efficiency. At the transcriptomic level, we obtained new data on the immunity of the adult rabbit with in vitro stimulation of peripheral blood mononuclear cells with LPS and PMA-ionomycin. This study confirms the importance of the rabbit as an animal model for biomedical research. In young rabbits, the new version of the microarray allowed us to show that biological functions are more quickly implemented with FRF than a standard diet, and that antibiotics level out the gene expression. In addition, FRF help to limit intestinal inflammation. At the metagenomic level, the targeting of the 16S rRNA, we showed that an increase in cecal microbiota activity is not associated with major changes of microbiota composition, with the exception of the stabilization of the relative abundance of Campylobacteraceae, which limits gastrointestinal inflammation. Our preliminary results did not identify significant correlations between gene expression in blood and/or ileum, and principal taxonomic profiles of the digestive microbiota. Our results suggest that FRF can be proposed as a new nutrition strategy peri-weaning, with improved feed efficiency and increased protection of digestive health, and secondly that genomic approaches are promising to describe more precisely phenotypes of interest in rabbits.

Les relations entre bactéries intestinales, aliments et hôte jouent un rôle crucial dans lemaintien de la santé humaine. La caractérisation fonctionnelle d’Uhgb_MP, une enzyme dela famille 130 des glycoside hydrolases découverte par métagénomique fonctionnelle, arévélé une nouvelle fonction de dégradation par phosphorolyse des polysaccharides de laparoi végétale et des glycanes de l'hôte tapissant l'épithélium intestinal. Les déterminantsmoléculaires de la spécificité d’Uhgb_MP vis-à-vis des mannosides ont été identifiés grâce àla résolution de sa structure cristallographique, sous forme apo et en complexe avec sesligands. Un nouveau procédé de synthèse par phosphorolyse inverse d'oligosaccharidesmannosylés à haute valeur ajoutée, a aussi été développé. Enfin, la caractérisationfonctionnelle de la protéine BACOVA_03624 issue de Bacteroides ovatus ATCC 8483, unebactérie intestinale hautement prévalente, a révélé que la famille GH130 comprend à la foisdes glycoside-hydrolases et des glycoside-phosphorylases capables de dégrader lesmannosides et les galactosides, et de les synthétiser par phosphorolyse inverse et/outransglycosylation. L’ensemble de ces résultats, ainsi que l’identification d’inhibiteurs desenzymes de la famille GH130, ouvrent de nouvelles perspectives pour l'étude et le contrôledes interactions microbiote-hôte / The interplay between gut bacteria, food and host play a key role in human health. Thefunctional characterization of Uhgb_MP, an enzyme belonging to the family 130 of glycosidehydrolases, discovered by functional metagenomics, revealed novel functions of plant cellwall polysaccharide and host glycan degradation by phosphorolysis. The moleculardeterminants of Uhgb_MP specificity towards mannosides were identified by solving itscrystal structure, in apo form and in complex with its ligands. A new process of high addedvalue mannosylated oligosaccharide synthesis by reverse-phosphorolysis was alsodeveloped. Finally, the functional characterization of the BACOVA_03624 protein fromBacteroides ovatus ATCC 8483, a highly prevalent gut bacterium, revealed that GH130 familyboth contains glycoside phosphorylases and glycoside hydrolases, which are able to degrademannosides and galactosides, and to synthesize them by reverse-phosphorolysis and/ortransglycosylation. All these results, together with the identification of GH130 enzymeinhibitors, open new perspectives for studying, and potentially also for controlling,interactions between host and gut microbes

Au cours des dernières années, de nombreuses études ont porté sur les relations entre le microbiote intestinal et l'obésité. Des groupes bactériens ont été incriminés et des hypothèses proposées mais les mécanismes liant microbiote et obésité restent en grande partie inconnus. Le microbiote intestinal est constitué de plusieurs centaines d’espèces et est spécifique de chaque individu. Récemment, il a été révélé l’implication potentielle de ce microbiote dans le développement de l’obésité. Lors d’une étude précédente, notre équipe a ainsi montré que les souris sans germes (dites « axéniques ») sont résistantes à l’obésité et aux désordres métaboliques induits par un régime hypercalorique (Roy et al. 2012). Par ailleurs, nous avons observé que certaines souris conventionnelles soumises à un tel régime développent une obésité et une insulinorésistance importantes (phénotype dit répondeur) tandis que d'autres restent minces et tolérantes au glucose (phénotype dit non répondeur) indépendamment de la quantité de nourriture consommée. Les mécanismes expliquant cette hétérogénéité de phénotype sont actuellement peu connus. Ce projet de thèse vise donc à élucider les mécanismes liant le microbiote intestinal au développement de l'obésité et des désordres associés en partant du principe que l'hétérogénéité (en termes de composition et de fonctions) du microbiote intestinal, spécifique de chaque individu (aussi bien chez l'homme que chez le rongeur), joue un rôle dans ces réponses différentes à un même régime hypercalorique. Pour ce faire, des souris conventionnelles ont reçu un régime contrôle ou un régime hyperlipidique pendant 12 semaines. A l’issu de ce régime, des souris ont été sélectionnées en tant que répondeuses ou non-répondeuses Une approche par métagénomique à partir d’échantillons fécaux prélevés avant et après régime hyperlipidique et issus des souris répondeuses et non-répondeuses ont été analysés. Les profils de microbiotes avant et après régime hyperlipidique ont été comparés afin de déterminer les effets de ce régime sur le microbiote intestinal. De plus, le profil du microbiote des souris répondeuses a été comparé à celui des souris non-répondeuses afin de détecter des espèces bactériennes, des gènes ou des voies métaboliques sous- ou sur-représentés dans les deux phénotypes. Par ailleurs, des échantillons de fèces, d’urine et de plasma prélevés avant et après le régime hyperlipidique ont été analysés par métabolomique et nous avons ainsi analysé les fluctuations métaboliques induites par l’effet du régime. L’ensemble de ces travaux a eu pour but d’identifier s’il existe un microbiote de prédisposition au développement ou à la résistance du développement d’une obésité induite. Au cours de ce projet de thèse nous avons utilisé l’approche de métagénomique à partir d’échantillon fécaux afin d’identifier les profils du microbiote intestinal des souris NR et des souris R avant et après régime hyperlipidique en vue de mesurer l’impact de ce type de régime sur le microbiote, et surtout de détecter les espèces bactériennes, les gènes ou les voies métaboliques potentiellement sous- ou sur-représentés dans les deux phénotypes. D’autre part, l’approche de métabolomique a été utilisée sur des échantillons d’urine, de fèces et de plasma avant et après régime afin de visualiser les fluctuations métaboliques induites par l’effet du régime d’une part et d’identifier les métabolites (biomarqueurs) associés à chacun des phénotypes d’autre part. / In recent years, numerous studies have examined the relationship between the gut microbiota and obesity. Bacterial groups have been incriminated but the mechanisms linking microbiota and obesity remain largely unknown. Intestinal microbiota consists of several hundred species and is specific for each individual. Recently, it was revealed that the potential contribution of microbiota in the development of obesity. In a previous study, our team has shown that mice without germs (called "germ-free") are resistant to obesity and metabolic disorders induced by a high calorie diet (Roy et al. 2012). Furthermore, we observed that certain conventional mice subjected to such a plan develop an important obesity and insulin resistance (responder phenotype) while others remain thin and glucose tolerant (non responder phenotype) regardless of the amount of food consumed. The mechanisms explaining this phenotype heterogeneity are currently poorly known. This PhD project aims to elucidate the mechanisms linking the intestinal microbiota in the development of obesity and disorders associated with the assumption that heterogeneity (in terms of composition and functions) of the intestinal microbiota, specific for each individual ( both in humans than in rodents), plays a role in these different responses to the same high-fat diet. To do this, conventional mice received control diet or a high fat diet for 12 weeks. At the end of this diet, mice were selected as a responder or non-responder A metagenomics approach from fecal samples taken before and after high fat diet and from responder and non-responder mice were analyzed. Microbiota profiles before and after fat diet were compared to determine the effects of this diet on the intestinal microbiota. In addition, the profile of the microbiota of responder mice was compared to that of non-responder mice in order to detect bacterial species, genes or pathways under- or over-represented in both phenotypes. Furthermore, samples of feces, urine and plasma collected before and after fat diet were analyzed by metabolomics and we have analyzed the metabolic changes induced by the effect of diet. All of this work has been aimed to identify if there is a predisposition microbiota to the development or the resistance of induced obesity. In this PhD project we used the metagenomic approach from fecal sample to identify the profiles of the intestinal microbiota in mice NR and R mice before and after fat diet in order to measure the impact of this type of diet on the microbiota, and especially to detect bacterial species, genes or metabolic pathways potentially under- or over-represented in both phenotypes. On the other hand, the approach of metabolomics has been used on samples of urine, feces and plasma before and after diet in order to visualize the metabolic changes induced by the effect of diet on the one hand and to identify metabolites (biomarkers) associated with each other hand phenotypes.

Le cancer colorectal est un problème de santé publique majeur à travers le monde. Les données épidémiologiques mettent en avant une association positive entre consommation de viande rouge et risque de cancer colorectal. En 2007, le fond mondial de recherche contre le cancer (WCRF) et l’institut américain de recherche contre le cancer (AICR) ont établi deux recommandations fortes qui sont de limiter la consommation de viande rouge à 500 g par semaine et d’éviter la consommation de charcuterie. Cependant, la viande rouge possède des qualités nutritionnelles intéressantes. De plus, les recommandations alimentaires sont très peu suivies par les populations appartenant aux catégories socio-professionnelles inférieures, qui consomment le plus de produits à base de viande et sont donc les plus à risque. Deux mécanismes semblent expliquer l’effet promoteur de la viande : la peroxydation des acides gras alimentaires et la formation de composés N-nitrosés, ces deux réactions étant catalysées par le fer héminique provenant de la viande rouge. Dans ce contexte, le projet SécuriViande a été mis en place afin de développer de nouveaux moyens de production qui permettraient, à terme, de diminuer le risque de cancer colorectal en inhibant les deux réactions catalysées par l’hème. Cette thèse a permis de valider expérimentalement l’association épidémiologique en montrant que la consommation de viande rouge et de charcuteries modèles induit la promotion de la cancérogenèse colorectale dans deux modèles animaux : le rat initié à l’azoxyméthane et la souris Min. De plus, mariner la viande bovine avec un mélange aqueux de raisin-olive est efficace pour diminuer le nombre de lésions précancéreuses chez le rat initié et les biomarqueurs associés à la cancérogenèse hème-induite dans les deux modèles. Cette thèse a également permis de proposer de nouveaux mécanismes pouvant expliquer l’effet promoteur de l’hème. Ainsi, le microbiote intestinal participe à la lipoperoxydation induite par le fer héminique. De plus la consommation d’hème, via la production d’aldéhydes issus de la lipoperoxydation, induit une augmentation de la perméabilité, de l’inflammation et de la génotoxicité au niveau de la muqueuse intestinale. En conclusion, cette thèse apporte : (i) une validation expérimentale de l’effet promoteur de la consommation de viande rouge et de charcuterie fraîches, (ii) un mode de prévention par la marinade de la viande bovine avec des extraits d’un mélange d’antioxydants raisin-olive, (iii) la mise en évidence de l’implication du microbiote dans la lipoperoxydation hème-induite et (iv) une meilleure caractérisation des conséquences de la consommation de fer héminique sur la muqueuse intestinale, via la formation d’aldéhydes. A terme, ces résultats pourraient être utilisés afin de mettre sur le marché des produits à base de viande plus sains vis-à-vis du risque de cancer colorectal, sans modifier les habitudes des consommateurs et ainsi de diminuer l’incidence du cancer colorectal. / Colorectal cancer is a real health issue worldwide. Epidemiological studies show positive association between red meat intake and colorectal cancer risk. In 2007, the World Cancer Research Fund (WCRF) and the American Institute for Cancer Research (AICR) made two strong recommendations: reduce fresh red meat intake less than 500 g per week and avoid cured meat. Nevertheless, red meat has nutritional interest and dietary recommendations are poorly followed by people in the lowest socio-professional category, who consume the most meat products and so who have the highest risk. Two mechanisms appear to explain promoting effect of meat: dietary fatty acids peroxidation and N-nitroso compounds formation, both reactions being catalyzed by heme iron from red meat. In this context, SécuriViande project was set up to develop new production ways which could lead to reduced colorectal cancer risk inhibiting the two reactions catalyzed by heme. This thesis has shown that fresh red meat and cured-meat intake induce colorectal carcinogenesis promotion in two animal models: azoxymethane induced-rats and Min mice. Marinate beef with an aqueous mixture of grape-olive is effective to reduce the number of precancer lesions in rats and biomarkers associated with heme-induced carcinogenesis in both models. This thesis also highlights new potential mechanisms of promoting effect of heme. Thus, microbiota is involved in heme-induced lipid peroxidation. Moreover, heme iron intake increases intestinal mucosa permeability, inflammation and genotoxicity, via aldehydes produced by lipoperoxidation. In conclusion, this thesis provides (i) an experimental validation of fresh red meat and cured meat promoting effect, (ii) a way to prevent this promoting effect by marinating beef with extracts of grape-olive antioxidants, (iii) the demonstration of microbiota involvement in heme-induced lipoperoxidation and (iv) a better characterization of heme iron intake consequences on intestinal mucosa via aldehydes formation. Ultimately, these findings could be used to market safer meat products, without changing consumer habits and so reduce colorectal cancer incidence.

Les hépatopathies métaboliques regroupent les maladies non alcooliques du foie (NAFLD) et les maladies alcooliques du foie (MAF) causées respectivement par l’obésité ou une consommation excessive d’alcool. Ces pathologies vont de la simple stéatose à des formes aggravées pouvant aller jusqu’au carcinome hépatocellulaire. D’autres facteurs que le surpoids ou l’abus d’alcool jouent un rôle dans la susceptibilité des patients à développer une NAFLD ou une MAF. Cette thèse a pour objectif de clarifier et d'étudier les mécanismes et les facteurs participant à l’installation de l’inflammation dans ces deux pathologies. Mes travaux ont porté d’une part sur le rôle de la cellule de Kupffer dans les étapes précoces de la NAFLD et d’autre part sur l’étude du microbiote intestinal comme cofacteur déclenchant de la MAF. La cellule de Kupffer lors de la stéatose, étape précoce de la NAFLD, présente une dérégulation de son homéostasie lipidique qui participe à son phénotype pro-inflammatoire et favorise l’inflammation hépatique. L’impact du fructose, largement utilisé dans notre alimentation actuelle, a été étudié et aggrave l’inflammation hépatique lors d’un régime hyperlipidique et ceci est associé à une dysbiose spécifique. Dans la MAF, une dysbiose intestinale, une diminution des Bacteroides, a été associée aux lésions hépatiques dans un modèle murin d’alcoolisation. L‘utilisation de traitements permettant de maintenir cette population à des taux élevés a corrigé cette dysbiose et protégé les animaux face aux lésions hépatiques. Ces travaux permettent d‘envisager le MI comme une cible prometteuse permettant de contrôler l’évolution des hépatopathies métaboliques vers des formes sévères. / Metabolic hepatopathies is including Non Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Alcoholic Liver Disease (ALD) due to an excessive consumption of alimentation or alcohol. The pathologies range from simple steatosis to aggravated forms until hepatocellular carcinoma. Other factors than overweight or alcohol abuse play a role in sensitivity of patients to develop NAFLD or ALD. The aim of this thesis is to clarify and study the mechanisms and factors that lead to the installation of inflammation in those pathologies. My work covered in part on the role of Kupffer cell in the early stages of NAFLD and secondly on the study of intestinal microbiota as a cofactor triggering the MAF.The Kupffer cell role in steatosis, the early stages of NAFLD, showed a deregulation of its lipid homeostasis involved in the pro-inflammatory phenotype and promotes liver inflammation. The impact of fructose, widely used in our current diet, was studied and worsening liver inflammation during high fat diet. This is associated with a specific dysbiosis. In ALD, intestinal dysbiosis, a decrease of Bacteroides, leading to liver damage has been established. The use of treatments to maintain this population with high levels corrected the dysbiosis and has protected animals against liver damages. Both works on the NAFLD and ALD establish MI is a promising target to control the evolution of metabolic liver diseases toward aggravated forms.

L’intestin des mammifères est colonisé par une dense communauté microbienne avec lequel il a établi, au cours d’une longue co-évolution, des relations mutualistes. Ces relations, bien qu’essentiellement basées sur des avantages métaboliques permettent également la maturation complète du système immunitaire, dont le développement est initié in utero par un programme génétique. Chez la souris, seule la SFB a été décrite comme présentant un fort pouvoir immunostimulant permettant la coordination d’un large panel de réponses immunes, notamment IgA et Th17 dont le site d’induction préférentiel serait les plaques de Peyer. La première partie de ma thèse a contribué à la finalisation de travaux consacrés à l’étude des caractéristiques des réponses IgA et Th17 induites par SFB. Nous avons ainsi mis en évidence la capacité de la SFB à stimuler la maturation post-natale de follicules lymphoïdes isolés et de tissus lymphoïdes tertiaires qui se substitueraient aux plaques de Peyer en tant que sites inducteurs des réponses IgA et Th17 stimulées par SFB. Cependant, ce microbiote constitue aussi une source antigénique importante pouvant représenter une menace pour l’intégrité de l’hôte. Notamment, la SFB peut provoquer une inflammation chronique délétère en périphérie de l’intestin, chez des souris prédisposées génétiquement. Cela suggère l’existence de mécanismes capables de réguler la colonisation par la SFB, afin d’éviter tout phénomènes compromettant l’intégrité physiologique de l’hôte. À l’aide de souris immunodéficientes axéniques ou seulement colonisées par SFB, nous avons pu mettre en évidence un rôle de la voie de signalisation des TLR dans le contrôle de la colonisation par SFB. Cependant, ni les peptides anti-microbiens, ni les IgA ne semblent impliqué dans le contrôle de la colonisation par SFB. / The mammalian intestine is heavily colonized by a huge microbial community. During a long coevolution process, the host has evolved mutualistic relationships with its microbiota. Thes relationships, mainly based on metabolstic advantages, also allow the full maturation of the host immune system, which development is initiated in utero by a genetic program. In mice, only SFB has been yet described to display strong immunostimulant properties allowing the coordination of a large panel of immune responses, more specifically IgA and Th17 responses, which preferential induction sites might be the Peyer's patches. The first part of my thesis contributed to complete a work dedicated to the characterization of the IgA et Th17 responses induced by SFB. We have underscored SFB capacity to stimulate the post-natal maturation of isolated lymphoid follicles and also tertiary lymphoid tissues that would substitute to Peyer's patches as inductors sites of both IgA and Th17 responses induced by SFB. However, this microbiote also constitutes a potential antigenic threat for the host integrity. Notably, the SFB could provoke chronic deleterious inflammation in peripheric compartment in genetically predisposed individuals. It suggests the establishment of highly regulated mechanisms regulating SFB colonization, to avoid compromising events for the host homeostasis. In a second part of my thesis, with the help of immunodeficient axenic mice, we have shown a role of TLR signaling pathways in the control of SFB colonization. However, antimicrobial peptides, IgA, IL-17 or IL-22 seem to be involved int eh control of SFB colonization.

L’industrie porcine met beaucoup d’efforts pour contrôler la contamination par Salmonella en fin de production. Malgré tout, d’après des données européennes de la European Food Safety Authority (EFSA), les produits de viande porcine pourraient être responsables de 10 à 20 % des cas rapportés de salmonellose chez l’Homme. Il semble donc qu’une approche incluant des actions en amont, c’est-à-dire à la ferme, pourrait permettre de réduire la pression de contamination au niveau de l’abattoir et donc la contamination de la viande. Le transfert de Salmonella entre les truies contaminées et les porcelets pourrait être une source importante de contamination dans la filière porcine. Cependant au Canada peu d’information est disponible sur cette voie d’introduction. Nous avons donc décrit le lien entre les souches retrouvées chez les truies et celles retrouvées chez leurs porcelets dans les étapes subséquentes d’un système de production commercial Québécois. De plus, l’établissement du microbiote intestinal chez le porc en production est directement influencé par le microbiote maternel et celui-ci influence l’excrétion de Salmonella chez les porcs en engraissement. Dans cette étude, nous avons donc tout d’abord décrit, dans ce même système, le microbiote des truies en lien avec leur excrétion de Salmonella. Nous avons ensuite décrit le microbiote des porcelets et des porcs en engraissement en relation avec ce microbiote maternel et avons tenté d’identifier des déterminants de l’excrétion qui peuvent être transférés de la truie à sa progéniture à l’intérieur de cette pyramide de production. Pour ce faire, nous avons tout d’abord échantillonné les matières fécales de truies à différents moments de la gestation dans une maternité. Une détection de Salmonella a été effectuée et les populations bactériennes retrouvées dans le microbiote fécal de ces truies ont été décrites par séquençage à haut débit de type MiSeq. Ceci nous a permis de mettre en évidence une réduction significative du niveau de Salmonella excrétées par ces truies entre le début et la fin de la gestation. Nous avons aussi pu mesurer des variations dans le microbiote fécal de celles-ci selon l’excrétion de Salmonella, mais aussi selon le moment de la gestation. Un séquençage a aussi été effectué sur les fèces des porcelets nés de ces truies avant leur sevrage. Ceci nous a permis de démontrer que le statut d’excrétion de la truie influence leur microbiote fécal. Cependant, aucun transfert direct de taxon spécifique de cette relation n’a pu être mesuré. De plus, indépendamment du statut d’excrétion de Salmonella des truies, nous avons démontré qu’à ce moment les porcelets d’une portée avaient des microbiotes fécaux plus semblables entre eux que comparativement à ceux de leurs contemporains, confirmant l’influence de la truie sur le microbiote des porcelets dans les fermes échantillonnées. Finalement, des échantillonnages de matière fécale de ces porcs ont aussi été effectués en engraissement. Leur statut d’excrétion de Salmonella et la composition de leur microbiote ont aussi été évalués à cette étape. Grâce à ces échantillons, nous avons démontré que, dans le système de production étudié, le statut d’excrétion de la truie n’avait pas d’impact sur le microbiote des animaux après l’étape du sevrage. Nous avons cependant démontré que dans les fermes faisant partie de l’étude, les porcs nés d’une même mère avaient toujours un microbiote fécal différenciable de celui de leurs congénères. Ceci suggère ainsi le potentiel d’actions visant à moduler le microbiote intestinal de la truie et qui pourrait être transféré au bénéfice de leurs porcelets. Nous avons aussi décrit par typage, à l’aide de courbes de fusion à haute résolution (HRM), la circulation et le transfert des Salmonella de la maternité vers les autres étapes de la production dans cette pyramide de production. Les résultats obtenus démontrent ici que, malgré une excrétion des truies dans la période périnatale, les souches retrouvées plus tard chez les porcelets en pouponnière et dans leur environnement ont des profils HRM différents de celles retrouvées en maternité. Les truies auraient donc, dans le système de production étudié, un effet marginal sur la contamination des porcelets et ceux-ci se contamineraient plutôt dans l’environnement de la pouponnière ou de l’engraissement. Cette étude a permis de mieux décrire la présence de Salmonella dans un système de production porcine commercial au Québec et ainsi de mieux comprendre l’impact de la transmission de Salmonella entre les truies et les porcelets. Ces nouvelles connaissances permettront de mieux cibler les étapes où des mesures efficaces pourraient être implantées pour réduire la contamination du produit fini. L’étude du microbiote a aussi permis de mettre en évidence une influence de la truie sur le microbiote fécal de ses porcelets et ce jusqu’en engraissement, sans pour autant avoir pu identifier de taxons directement transférés, ni avoir pu mesurer d’effet de cette influence sur l’excrétion de Salmonella. Néanmoins, au-delà de la problématique spécifique de Salmonella, cette étude ouvre des perspectives de modulation du microbiote intestinal de la truie au bénéfice de l’orientation du microbiote digestif du porc pendant toute la production, microbiote dont les effets sur la santé et le bien-être sont de mieux en mieux documentés. / The pork industry is putting a lot of effort into controlling Salmonella contamination at the end of production. However, according to the European Food Safety Authority (EFSA) data, pig meat products may be responsible for 10-20% of reported cases of salmonellosis in humans. It therefore seems that an approach including actions upstream, on the farm, could make it possible to reduce the pressure of contamination at the slaughterhouse and therefore the contamination of the meat. The transfer of Salmonella between contaminated sows and piglets could be an important source of contamination in the pig sector. However, in Canada little information is available on this route of introduction. We have therefore described the link between the strains found in sows and those found in their piglets in the subsequent stages of production in a Quebec commercial production system. In addition, the establishment of this microbiota in pigs in production is directly influenced by the maternal microbiota and that the intestinal microbiota influences the excretion of Salmonella in fattening pigs. In this study, we therefore first described the microbiota of sows in relation to their excretion of Salmonella in this same production system. We then described the microbiota of piglets and fattening pigs in relation to this maternal microbiota and attempted to identify determinants of shedding that can be transferred from the sow to its offspring within this production pyramid. To do this, we first sampled the feces of sows at different times of gestation in a maternity unit. Salmonella was detected and the bacterial populations found in the fecal microbiota of these sows were described by high-throughput sequencing of the MiSeq type. This allowed us to highlight significant variations in the level of Salmonella excreted by these sows at different times of gestation. We were also able to measure variations in the fecal microbiota of these depending on the excretion of Salmonella, but also according to the time of gestation. Sequencing was also carried out on the feces of piglets born from these sows before weaning. This allowed us to demonstrate that the sow's shedding status influences their fecal microbiota. However, no direct taxon transfer specific to this relationship could be measured. In addition, up to the nursery, we have demonstrated that piglets from the same litter have more similar fecal microbiota than compared to other contemporary animals, confirming the influence of the sow on the piglet microbiota in the sampled farms. Finally, fecal samples from these pigs were also carried out for fattening. Their Salmonella excretion status and the composition of their microbiota were also assessed at this stage. Using these samples, we demonstrated, in the production system that was studied, that the impact of the sow’s status on the microbiota was not retained for fattening after the weaning stage and did not affect the risk of shedding during fattening. However, we have shown that on the farm included in our study that pigs born to the same mother always have a differentiated fecal microbiota from that of their counterparts. This thus demonstrates the potential for actions aimed at modulating the intestinal microbiota of the sow and which could be transferred to the benefit of their piglets. We have also described by High Resolution Melt typing (HRM) the circulation and transfer of Salmonella from the maternity to the other stages of production in this production pyramid. The results obtained demonstrate here that despite the excretion of sows in the perinatal period, the strains found later in the piglets at the nursery and their environment have different HRM profiles from those found in maternity. In the studied production system, sows would therefore have a marginal effect on the contamination of piglets in the production system studied, compared to the environment in the nursery among other things. This study made it possible to better describe the circulation of Salmonella in a commercial swine production system in Quebec and thus to better understand the impact of Salmonella transmission between sows and piglets. This new knowledge will allow us to better target the stages where effective measures could be implemented to reduce contamination of the finished product. The study of the microbiota also made it possible to highlight an influence of the sow on the fecal microbiota of its piglets and this until fattening, without being able to identify taxa directly transferred nor to have been able to measure the effect of this influence on the excretion of Salmonella. However, beyond the specific problem of Salmonella, this study opens up perspectives for modulating the intestinal microbiota of the sow for the benefit of the orientation of the digestive microbiota of pigs throughout production, a microbiota whose effects on health and well-being are getting increasingly well documented.

Les cancers du rein métastatiques résistants aux inhibiteurs de tyrosine kinase peuvent faire l’objet de traitements fondés sur le blocage des points de contrôles immunitaires (ICB). Cependant, les ICB induisent des réponses chez une minorité de patients, et des efforts sont en cours pour identifier les mécanismes à l'origine de la résistance. Les ICB compromettent l'intégrité de la barrière intestinale, affectant ainsi la composition du microbiote, favorisant ainsi soit l'accumulation intestinale, soit la translocation de commensaux immunogènes capables de moduler le tonus immunitaire systémique et de reprogrammer le microenvironnement tumoral. Pour déterminer si des profils microbiens distincts du microbiote intestinal pourraient expliquer la résistance aux ICB, ma thèse a montré que dans une cohorte de 249 patients atteints de cancer traités par ICB que la prescription d’antibiotiques (ATB) a significativement diminué la survie sans progression (PFS) et la survie globale (OS) par rapport aux patients sans ATB. Nous avons confirmé ces données en analysant 121 cencers du rein traités par ICB à Gustave Roussy et 239 cancers du poumon traités par ICB au Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Nous avons validé que la dysbiose liée à l'ATB diminue l'activité des ICB. Par la suite, nous avons analysé de manière prospective les microbiotes fécaux de 100 patients atteints de tumeurs sensibles à l'anti-PD-1 en utilisant la métagénomique (MG). Nous avons démontré que les bactéries intestinales présentes avant le traitement anti-PD-1 étaient systématiquement différentes entre les patients qui ont répondu (R) au traitement et les patients qui n’ont pas (NR). Entre les R, nous avons observé une surreprésentation d’Akkermansia muciniphila. Au sein d'une large cohorte de patients RCC (n = 85) traités avec un anticorps anti-PD-1, nous avons analysé le microbiote fécal de 69 patients. Des empreintes de MG spécifiques étaient liées aux meilleures réponses et à la survie sans progression. A. muciniphila et Bacteroides spp étaient plus abondants chez les R. Pour valider la pertinence de ces constatations, nous avons mis en évidence deux principaux éléments de preuve. Premièrement, nous avons démontré que chez les patients atteints de NSCLC, la présence de lymphocytes T CD4 + et CD8 + à mémoire spécifiques de l’IFNγ + vis-à-vis de A. muciniphila prédit une PFS plus longue. Deuxièmement, une transplantation de microbiote fécal (FMT) a été réalisée à l'aide de selles de patient pour recoloniser des souris axéniques ou traitées par ATB dans deux modèles murins. Les matières fécales de R entrainaient une réponse immunitaire plus forte contre la tumeur par rapport aux matières fécales de NR. Ensuite, une supplémentation orale d'A. muciniphila post-FMT avec des matières fécales de NR restaurait l'efficacité de l'anti- PD-1. Dans ce contexte, les cellules dendritiques sécrétaient plus d'IL-12, augmentant le recrutement de lymphocytes T CCR9 + CXCR3 + CD4 + à partir des ganglions lymphatiques mésentériques jusque dans les lits tumoraux, ainsi qu'une augmentation du rapport CD4 + /Treg dans le lit tumoral de souris co-traitées avec mAb anti-PD-1 et A. muciniphila. Enfin, nous avons montré qu'une supplémentation orale avec Bacteroides (B. salyersiae mais pas B. xylanisolvens) ou A. muciniphila pourrait restaurer l'efficacité des ICB dans un modèle FMT- défavorable/dysbiotique". La découverte de bactéries immunogènes capables de prédire et d'accroître les avantages cliniques de l'ICB contribuera au développement de nouveaux outils de biomarqueurs et d'un futur concept thérapeutique, grâce auxquels le traitement du cancer peut être amélioré par la modulation du microbiote intestinal. / Metastatic RCC resistant to tyrosine kinase inhibitors are amenable to new therapies based on immune checkpoint blockade (ICB). However, ICB induces responses in a sizeable minority of patients and efforts are ongoing in order to identify mechanisms driving resistance. ICB compromise the integrity of the intestinal barrier, hereby affecting the composition of the intestinal microbiome, thereby promoting either the intestinal accumulation or the translocation of immunogenic commensals capable of modulating the systemic immune tone and reprogramming the tumor microenvironment. To address whether distinct microbial patterns of the intestinal microbiome could account for the resistance to ICB in RCC, during my PhD I showed in a cohort of 249 patients with cancers treated with ICB that antibiotic (ATB) prescription in a therapeutic window of -2 months up to +1 month after starting ICB significantly decreased progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) compared to patients without ATB. We confirmed this data analyzing 121 RCC treated with ICB at Gustave Roussy and 239 NSCLC treated with ICB at Memorial Sloan Kettering Cancer Center. We validated that ATB-related dysbiosis decreases activity of ICB. More precisely, patients in RCC ATB group treated with ICB had a higher rate of primary progressive disease. Subsequently, we prospectively analyzed the fecal microbiomes of 100 patients with tumours amenable to anti-PD-1 mAb using quantitative metagenomics (MG) by shotgun sequencing. We demonstrated that gut bacteria present before anti-PD-1 therapy was consistently different between patients who responded (R) to treatment and patients who did not (NR). In R we observed an overrepresentation of un- and classified Firmicutes. The commensal most significantly associated with favorable clinical outcome and PFS was Akkermansia muciniphila. Within a large cohort of RCC patients (n = 85) treated in the NIVOREN study with anti-PD-1 Ab at Gustave Roussy, we analyzed the fecal microbiome of 69 patients. Specific MG-fingerprints were related to best responses and PFS. A. muciniphila and Bacteroides spp were more abundant in R (Derosa et al. ASCO Merit Award 2018). To validate the relevance of these findings, we brought up two major lines of evidence. First, we demonstrated that in NSCLC patients, the presence of specific IFNγ+ memory CD4+ and CD8+ T cells toward A. muciniphila predicted a longer PFS. Secondly, fecal microbiota transplantation (FMT) was performed using patient feces to recolonize germ-free or ATB-treated mice in two tumor models (MCA-205 and RENCA, the renal cell carcinoma model). Feces from R conveyed a stronger immune response against the tumor compared to feces from NR. Next, in MCA-205 model oral supplementation with A. muciniphila post-FMT with NR feces restored the efficacy of PD-1 Abs. In this setting, dendritic cells secreted more IL-12, increasing the recruitment of CCR9+CXCR3+CD4+ T lymphocytes from the mesenteric lymph nodes into tumor beds as well as an increase of CD4+/Treg ratio within the tumor bed of mice co-treated with anti-PD-1 mAb and A. muciniphila. Finally, we showed that oral supplementation with Bacteroides (B. salyersiae but not B. xylanisolvens) or A. muciniphila could restore the efficacy of ICB in "unfavorable/dysbiotic" FMT. The discovery of immunogenic bacteria capable of predicting and increasing clinical benefit of ICB will help for the development of novel biomarker tools and a future therapeutic concept, whereby treatment of cancer can be improved by the modulation of gut microbiome.