Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

En raison de l'eutrophisation croissante des eaux douces, les proliférations de cyanobactéries sont de plus en plus fréquentes à l'échelle mondiale. Dans 40 à 75% des cas, les cyanobactéries produisent des hépatotoxines [e.g. microcystines (MCs)], endotoxines qui sont libérées dans le milieu lors de la lyse cellulaire et qui constituent un réel danger pour les organismes cibles, dont font partie les mollusques gastéropodes (intoxication par ingestion de cyanobactéries toxiques ou par exposition aux toxines dissoutes dans l'eau). Les MCs s'accumulent principalement dans le foie des vertébrés où elles interagissent de manière réversible (MCs libres) ou irréversible (MCs liées) avec des protéines phosphatases et conduisent à la destruction des tissus. Au travers d'expositions chroniques à faibles doses en laboratoire, nous avons démontré la consommation de cyanobactéries toxiques (Planktothrix agardhii) par 2 espèces de gastéropodes, le pulmoné Lymnaea stagnalis et le prosobranche Potamopyrgus antipodarum. Cette consommation entraîne une baisse de croissance et de fécondité, et l'accumulation de MCs dans les tissus des gastéropodes. D'autre part, les effets histopathologiques sont beaucoup plus marqués chez le pulmoné intoxiqué par ingestion de cyanobactéries toxiques que par exposition à la MC dissoute dans le milieu, suggérant une moindre pénétration de la toxine dissoute (voie orale ou tégumentaire) dans le mollusque. Les deux voies d'intoxication engendrent un impact négatif sur la descendance de L. stagnalis, en termes de taux d'éclosion des œufs, de développement embryonnaire et de survie des néonates. Ces résultats prédisent un impact sur la structure des communautés de gastéropodes (e.g., baisse d'abondance et de diversité, disparition d'espèces sensibles) et un risque de contamination du réseau trophique à travers l'accumulation de MCs par les gastéropodes. Ces prédictions ont toutes deux été démontrées lors d'un suivi mensuel d'un an des communautés de gastéropodes du Lac de Grand Lieu (Loire Atlantique). De plus, le risque de transfert des MCs des gastéropodes à leurs consommateurs a été vérifié au laboratoire à travers : 1) la persistance des MCs liées dans les tissus du pulmoné même après 3 semaines de dépuration, et 2) l'accumulation de MCs dans les organes de l'épinoche Gasterosteus aculeatus (principalement dans le foie et les muscles) après consommation de glandes digestives de L. stagnalis intoxiquées par des MCs.

Environ 10 millions de personnes, soit près d'un tiers de la population canadienne, utilise des eaux souterraines comme source d’eau potable, et plus de 80% de la population rurale canadienne dépend de l'approvisionnement en eau souterraine pour faire son approvisionnement en eau. Le Bilan de la qualité de l'eau potable au Québec 2005-2009, nous montre qu’environ 14% des habitants du Québec prend leur eau de puits individuelle. Dans la municipalité de Saint-François-Xavier-de-Brompton (SFXB) il n'y a pas de système collectif de production de l’eau potable. Pour cette raison, les quelque 2 500 habitants de cette municipalité s'approvisionnent en eau à partir de puits privés. La première étape de cette recherche (réalisée en 2013), vise à déterminer le portrait spatio-temporel de la qualité de l’eau potable dans cinq puits individuels à SFXB. Les campagnes d'échantillonnage ont été réalisées de la mi-mai jusqu’à la fin de novembre (22 en 2013 et 24 en 2014). Le suivi environnemental réalisé, testé l’eau potable sur soixante-dix produits pharmaceutiques et pesticides, cyanotoxines (microcystines MC-LR), métaux et metalloïdes en état de traces, nitrate et phosphore total. Pendant ce suivi environnemental, on a quantifié seize contaminants émergents CÉ (neuf produits pharmaceutiques, six pesticides et MC-LR), du cadmium, de l’arsenic, du fer, du manganèse et une quantité suffisante de nitrates et phosphore total pour garantir l’eutrophisation du Petit Lac Saint-François (PLSF) placé quelques mètres en aval de nos résidences riveraines. En 2014 la deuxième étape du projet a débuté, en élargissant la zone d’étude avec l’ajout de dix-huit municipalités du centre-sud de Québec, mais cette fois ci, en prenant des eaux potables traitées des municipalités petites à moyennes (médiane de 4000 habitants). Les campagnes d'échantillonnage ont été réalisées de mai jusqu’à la fin de novembre (8 en 2014 et 4 en 2015). Dans les dix-huit municipalités, onze molécules (6 produits pharmaceutiques, 4 pesticides et MC-LR) ont été quantifiées dans au moins un échantillon, y compris le cancérogène connu cyclophosphamide et le fongicide thiabendazole, dont la présence dans l'eau potable municipale traitée au Québec est signalée ici pour la première fois. Les concentrations maximales de produits pharmaceutiques quantifiés variaient de 48 à 1233 ng l-1 et de pesticides de 40 à 366 ng l-1.

Dans cette étude de trois lacs sujets aux efflorescences de cyanobactéries, nous avons examiné la diversité des bactéries diazotrophes et des cyanobactéries toxiques. Nous avons tenté de définir les facteurs environnementaux influençant la composition des communautés phytoplanctoniques, la concentration ainsi que la composition des microcystines (MCs). Nous avons émis l’hypothèse que l’azote jouerait un rôle majeur dans le façonnement des communautés cyanobactériennes et influencerait la concentration et composition des MCs. Des concentrations de cette toxine ainsi que le gène mcyE codant pour l’enzyme microcystine synthétase ont été détectés à chaque échantillonnage dans tous les lacs. L’azote, particulièrement sous sa forme organique dissoute (AOD) ainsi que la température de l’eau étaient les facteurs environnementaux expliquant le mieux les concentrations des MCs, tandis que la biomasse de Microcystis spp. était globalement le meilleur prédicteur. Le gène nifH codant pour l’enzyme nitrogénase (fixation d’azote) a aussi été détecté dans chaque échantillon. Malgré les concentrations faibles en azote inorganique dissous (AID) et les densités importantes d’hétérocystes, aucun transcrits du gène n’a été détecté par réverse-transcription (RT-PCR), indiquant que la fixation d’azote n’avait pas lieu à des niveaux détectables au moment de l’échantillonnage. De plus, le pyroséquençage révèle que les séquences des gènes nifH et mcyE correspondaient à différents taxons, donc que les cyanobactéries n’avaient pas la capacité d’effectuer les deux fonctions simultanément. / In this study of three eutrophic lakes prone to cyanobacterial blooms, we examined the diversity of diazotrophic bacteria and toxic cyanobacteria. We evaluated the environmental factors effects on the community composition, the concentration and composition of the family of toxins microcystins (MCs). Since the assimilation of nitrogen and the synthesis of MCs in cyanobacteria are thought to be under the same control of the NtcA transcriptor, we hypothesised that nitrogen played a major role in shaping cyanobacterial communities and influenced indirectly the concentration and composition of MCs. The mcyE gene coding for the microcystin synthetase enzyme and MCs concentrations were detected at each sampling date in all lakes. Nitrogen, particularly under its organic dissolved form (DON) as well as water temperature were the environmental factors explaining the most variation in MC concentration although Microcystis spp. biomass was overall the best predictor. The nifH gene coding for the nitrogenase enzyme (N2-fixation) was also detected at all times. Even though the concentrations of dissolved inorganic nitrogen were relatively low, and that heterocysts were present in high densities, no nifH transcripts were detected by RT-PCR, indicating that no N2-fixation was going on at detectable levels at the time of sampling. Moreover, pyrosequencing revealed that sequences of the genes nifH and mcyE corresponded to different taxa, thus cyanobacteria did not have the capacity to perform both functions simultaneously.

Dans cette étude de trois lacs sujets aux efflorescences de cyanobactéries, nous avons examiné la diversité des bactéries diazotrophes et des cyanobactéries toxiques. Nous avons tenté de définir les facteurs environnementaux influençant la composition des communautés phytoplanctoniques, la concentration ainsi que la composition des microcystines (MCs). Nous avons émis l’hypothèse que l’azote jouerait un rôle majeur dans le façonnement des communautés cyanobactériennes et influencerait la concentration et composition des MCs. Des concentrations de cette toxine ainsi que le gène mcyE codant pour l’enzyme microcystine synthétase ont été détectés à chaque échantillonnage dans tous les lacs. L’azote, particulièrement sous sa forme organique dissoute (AOD) ainsi que la température de l’eau étaient les facteurs environnementaux expliquant le mieux les concentrations des MCs, tandis que la biomasse de Microcystis spp. était globalement le meilleur prédicteur. Le gène nifH codant pour l’enzyme nitrogénase (fixation d’azote) a aussi été détecté dans chaque échantillon. Malgré les concentrations faibles en azote inorganique dissous (AID) et les densités importantes d’hétérocystes, aucun transcrits du gène n’a été détecté par réverse-transcription (RT-PCR), indiquant que la fixation d’azote n’avait pas lieu à des niveaux détectables au moment de l’échantillonnage. De plus, le pyroséquençage révèle que les séquences des gènes nifH et mcyE correspondaient à différents taxons, donc que les cyanobactéries n’avaient pas la capacité d’effectuer les deux fonctions simultanément. / In this study of three eutrophic lakes prone to cyanobacterial blooms, we examined the diversity of diazotrophic bacteria and toxic cyanobacteria. We evaluated the environmental factors effects on the community composition, the concentration and composition of the family of toxins microcystins (MCs). Since the assimilation of nitrogen and the synthesis of MCs in cyanobacteria are thought to be under the same control of the NtcA transcriptor, we hypothesised that nitrogen played a major role in shaping cyanobacterial communities and influenced indirectly the concentration and composition of MCs. The mcyE gene coding for the microcystin synthetase enzyme and MCs concentrations were detected at each sampling date in all lakes. Nitrogen, particularly under its organic dissolved form (DON) as well as water temperature were the environmental factors explaining the most variation in MC concentration although Microcystis spp. biomass was overall the best predictor. The nifH gene coding for the nitrogenase enzyme (N2-fixation) was also detected at all times. Even though the concentrations of dissolved inorganic nitrogen were relatively low, and that heterocysts were present in high densities, no nifH transcripts were detected by RT-PCR, indicating that no N2-fixation was going on at detectable levels at the time of sampling. Moreover, pyrosequencing revealed that sequences of the genes nifH and mcyE corresponded to different taxa, thus cyanobacteria did not have the capacity to perform both functions simultaneously.

La diversité et la distribution des cyanobactéries dans les écosystèmes aquatiques conduisent à des effets nuisibles dans l’eau par la production d’une variété de toxines cyanobactériennes qui présentent des risques pour la faune et la santé humaine. Différentes techniques analytiques émergentes ont été développées pour détecter et quantifier les toxines cyanobactériennes dans l'environnement. Dans ce mémoire nous avons examiné la présence de cyanotoxines multi-classes, dont 12 microcystines, les anatoxines, la cylindrospermopsine (CYN), les anabaenopeptines (AP-A, AP-B) et la cyanopeptoline-A dans les eaux de surface et les poissons sauvages. L'échantillonnage a été conduit pendant l’été 2018, dans l'écosystème fluvial de la réserve écologique de la Rivière aux Brochets (QC, Canada) près de la Baie Missisquoi (Lac Champlain). La méthode analytique employée combine la chromatographie liquide ultra haute performance et une ionisation par électronébuliseur (UHPLC-ESI) avec l’usage d’un spectromètre de masse triple quadripôle. Sur les 18 cyanotoxines ciblées, 14 ont été détectées dans des échantillons d'eau de surface impactés par la floraison ; les toxines ont culminé au début de la mi-septembre avec les concentrations les plus élevées de MC-LR (3,8 μg L-1) et MC-RR (2,9 μg L-1). Parmi les 71 poissons prélevés sur le terrain (10 espèces au total), 38% avaient des détections positives d'au moins une cyanotoxine. Dans les échantillons positifs, les plages de concentration dans le muscle du poisson étaient les suivantes : la somme des microcystines ΣMC (0,16-9,2 μg kg-1), la CYN (46-75 μg kg-1), et les anabaénopeptines AP-A (1,1-5,4 μg kg-1) et AP-B (0,01 à 5,0 μg kg-1). Dans l'ensemble, 17% des échantillons de poisson étaient positifs pour AP-A ou AP-B. A notre connaissance, ceci constitue le premier signalement de bioaccumulation d'anabaénopeptines dans la faune. La somme maximale des concentractions des microcystines ΣMC dans les poissons était 1,15 fois plus élevées que la recommandation de l'apport quotidien (8 μg kg-1 de tissu-1) de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) pour les adultes et équivalaient presque à la valeur dérivée pour les jeunes enfants 9.3 μg kg-1. La concentration de CYN était également environ 3 fois plus élevée que la limite dérivée des valeurs recommandées pour la santé humaine. / The diversity and widespread distribution of cyanobacteria in aquatic ecosystems lead to harmful effects in water through the production of a variety of cyanobacterial toxins, which pose a great danger to fauna and human health. Different emerging analytical techniques have been developed to detect and quantify cyanobacterial toxins in the environment. In this thesis we examined the presence of multi-class cyanotoxins, including 12 microcystins, anatoxins, cylindrospermopsin (CYN), anabaenopeptins (AP-A, AP-B) and cyanopeptolin-A in surface water and wild fish. Sampling was conducted during the 2018 summer season in the fluvial ecosystem of the Pike River ecological reserve (QC, Canada) near Missisquoi Bay, Lake Champlain. This study was carried out using an analytical method combining ultra-high-performance liquid chromatography and ionization by electrospray (UHPLC-ESI) with the use of a triple quadrupole mass spectrometer. Of the 18 cyanotoxins targeted, 14 were detected in surface water samples impacted by the bloom; toxins peaked in early mid-September with the highest concentrations of MC-LR (3.8 μg L-1) and MC-RR (2.9 μg L-1). Among the 71 fish sampled in the field from 10 species, 38% had positive detections of at least one cyanotoxin. In positive samples, the concentration ranges in fish muscle were as follows: the sum of microcystins ΣMC (0.16-9.2 μg kg-1), CYN (46-75 μg kg-1), AP -A (1.1-5.4 μg kg-1) and AP-B (0.01 to 5.0 μg kg-1). Overall, 17% of the fish samples were positive for AP-A or AP-B; to our knowledge, this is the first report of accumulation of anabaenopeptins in wildlife. The maximum sum ΣMC of microcystin concentrations in fish was 1.15 times higher than the recommendation of the World Health Organization (WHO) Daily Intake (8 μg kg-1 tissue-1) for adults and was almost equivalent to the derived value for young children 9.3 μg kg-1. The concentration of CYN was also approximately 3 times higher than the limit derived from the recommended human health values.

Les suppléments alimentaires à base d’algues sont commercialisés pour leurs bénéfices pour la santé ainsi que pour leur valeur nutritionnelle. Cependant, certains de ces produits peuvent être contaminés par des toxines produites par la cooccurrence d’espèces toxigènes. Afin d’évaluer l’ampleur de la contamination en toxines dans différents suppléments disponibles sur le marché nord-américain, nous avons achetés 37 échantillons de spiruline, d’Aphanizomenon flos-aqua, de Chlorella et de varech et les avons analysés pour 27 toxines par des méthodes de chromatographie liquide et de spectrométrie de masse (LC-MS/MS ou LC-HRMS). Nous avons détecté des microcystines dans les huit échantillons d’Aphanizomenon à des niveaux allant jusqu’à 1000 ng/g et de l’acide 2,4-diaminobutyrique (DAB) dans tous les échantillons de suppléments à des concentrations incluses entre 3 et 1600 ng/g. L’anatoxine A (ANA-a) et le β-amino-N-méthylalanine (BAMA) n’ont pas été détectés tandis que les autres toxines ont été détectées de façon plus aléatoire à des concentrations variables, sans lien clair avec l’espèce de l’algue. En considérant ces résultats, les produits à base d’Aphanizomenon devraient faire l’objet d’un contrôle plus strict pour prévenir leur contamination et restreindre la vente de produits contaminés. Ces découvertes seraient également d’intérêt pour les consommateurs afin qu’ils puissent évaluer les risques associés à la consommation régulière de certains suppléments à base d’algues / Algal dietary supplements are marketed for their health benefits and nutritional value. However, these types of products can be contaminated by toxins produced by co-occurring toxigenic cyanobacteria. In order to evaluate the contamination of different supplements available on the North American market, we purchased 37 samples of spirulina, Aphanizomenon flos-aquae, Chlorella and kelp, and analysed them to identify 27 suspected toxins using liquid chromatography mass spectrometry methods (LC-MS/MS or LC-HRMS). We found microcystins (MC) in the 8 Aphanizomenon samples with levels up to 1000 ng g-1 dw and 2,4-diaminobutyric acid (DAB) in all samples with values ranging from 3 to 1600 ng g-1. Anatoxin-a (ANA) and β-amino-N-methylalanine (BAMA) were not detected, while other toxins were diversely detected with no clear link to the nature of the alga. Considering these results, Aphanizomenon products may require stricter monitoring to prevent further contamination. The findings are also of interest to consumers so that they can properly assess the risks that may be involved in the regular consumption of certain algal dietary supplements.

Les cyanobactéries ont une place très importante dans les écosystèmes aquatiques et un nombre important d’espèces considéré comme nuisible de par leur production de métabolites toxiques. Ces cyanotoxines possèdent des propriétés très variées et ont souvent été associées à des épisodes d’empoisonnement. L’augmentation des épisodes d’efflorescence d’origine cyanobactériennes et le potentiel qu’ils augmentent avec les changements climatiques a renchéri l’intérêt de l’étude des cyanobactéries et de leurs toxines. Considérant la complexité chimique des cyanotoxines, le développement de méthodes de détection simples, sensibles et rapides est toujours considéré comme étant un défi analytique. Considérant ces défis, le développement de nouvelles approches analytiques pour la détection de cyanotoxines dans l’eau et les poissons ayant été contaminés par des efflorescences cyanobactériennes nuisibles a été proposé. Une première approche consiste en l’utilisation d’une extraction sur phase solide en ligne couplée à une chromatographie liquide et à une détection en spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS) permettant l’analyse de six analogues de microcystines (MC), de l’anatoxine (ANA-a) et de la cylindrospermopsine (CYN). La méthode permet une analyse simple et rapide et ainsi que la séparation chromatographique d’ANA-a et de son interférence isobare, la phénylalanine. Les limites de détection obtenues se trouvaient entre 0,01 et 0,02 μg L-1 et des concentrations retrouvées dans des eaux de lacs du Québec se trouvaient entre 0,024 et 36 μg L-1. Une deuxième méthode a permis l’analyse du b-N-méthylamino-L-alanine (BMAA), d’ANA-a, de CYN et de la saxitoxine (STX) dans les eaux de lac contaminés. L’analyse de deux isomères de conformation du BMAA a été effectuée afin d’améliorer la sélectivité de la détection. L’utilisation d’une SPE manuelle permet la purification et préconcentration des échantillons et une dérivatisation à base de chlorure de dansyle permet une chromatographie simplifiée. L’analyse effectuée par LC couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et des limites de détections ont été obtenues entre 0,007 et 0,01 µg L-1. Des échantillons réels ont été analysés avec des concentrations entre 0,01 et 0,3 µg L-1 permettant ainsi la confirmation de la présence du BMAA dans les efflorescences de cyanobactéries au Québec. Un deuxième volet du projet consiste en l’utilisation d’une technologie d’introduction d’échantillon permettant des analyses ultra-rapides (< 15 secondes/échantillons) sans étape chromatographique, la désorption thermique à diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et à la spectrométrie de masse (MS). Un premier projet consiste en l’analyse des MC totales par l’intermédiaire d’une oxydation de Lemieux permettant un bris de la molécule et obtenant une fraction commune aux multiples congénères existants des MC. Cette fraction, le MMPB, est analysée, après une extraction liquide-liquide, par LDTD-APCI-MS/MS. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et des concentrations entre 1 et 425 µg L-1 ont été trouvées dans des échantillons d’eau de lac contaminés du Québec. De plus, une analyse en parallèle avec des étalons pour divers congénères des MC a permis de suggérer la possible présence de congénères ou d’isomères non détectés. Un deuxième projet consiste en l’analyse directe d’ANA-a par LDTD-APCI-HRMS pour résoudre son interférence isobare, la phénylalanine, grâce à la détection à haute résolution. La LDTD n’offre pas de séparation chromatographique et l’utilisation de la HRMS permet de distinguer les signaux d’ANA-a de ceux de la phénylalanine. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et la méthode a été appliquée sur des échantillons réels d’eau avec un échantillon positif en ANA-a avec une concentration de 0,21 µg L-1. Finalement, à l’aide de la LDTD-APCI-HRMS, l’analyse des MC totales a été adaptée pour la chair de poisson afin de déterminer la fraction libre et liée des MC et comparer les résultats avec des analyses conventionnelles. L’utilisation d’une digestion par hydroxyde de sodium précédant l’oxydation de Lemieux suivi d’une purification par SPE a permis d’obtenir une limite de détection de 2,7 µg kg-1. Des échantillons de poissons contaminés ont été analysés, on a retrouvé des concentrations en MC totales de 2,9 et 13,2 µg kg-1 comparativement aux analyses usuelles qui avaient démontré un seul échantillon positif à 2 µg kg-1, indiquant la possible présence de MC non détectés en utilisant les méthodes conventionnelles. / Cyanobacteria have a very important place in aquatic ecosystems and a significant number of species are considered harmful given their production of toxic metabolites. These cyanotoxins have various chemical proprieties and have often been associated with poisoning episodes. The frequency of cyanobacterial blooms is increasing and the study of cyanobacteria and their toxins is of increasing interest, especially considering the potential increase associated with climate changes. Given the chemical complexity of the cyanotoxins, the development of simple, sensitive and fast detection methods is an analytical challenge. Considering these issues, the development of new analytical approaches for the detection of cyanotoxins in water and fish samples contaminated with harmful cyanobacterial blooms have been proposed. A first approach consists of the use of an on-line solid phase extraction coupled to liquid chromatography and tandem mass spectrometry (SPE-LC-MS/MS) for the analysis of six microcystins (MCs), anatoxin-a (ANA-a) and cylindrospermopsin (CYN). This method allows a simple and rapid analysis and enables the chromatographic separation of ANA-a and its isobaric interference, phenylalanine. The detection limits ranged from 0.01 to 0.02 µg L-1 and concentrations in lake waters were found between 0.024 and 36 µg L-1. A second method consists of using manual solid phase extraction (SPE) coupled to high resolution mass spectrometry (HRMS) for the determination of b-N-methylamino-L-alanine (BMAA), ANA-a, CYN and saxitoxin (STX) in contaminated lake water. The analysis of two conformational isomers of BMAA was done to improve the selectivity. Dansyl chloride-based derivatization allows simplified chromatography. The detection limits were obtained between 0.007 and 0.01 µg L-1. The analysis of bloom water samples detected concentrations of cyanotoxins between 0.01 and 0.3 µg L-1 allowing the confirmation of the presence of BMAA in algal blooms in Québec. A second part of the project consists in the use of an alternative sample introduction technology for MS analysis. It enables ultra-fast analysis (< 15 seconds/sample) without the use of a chromatographic step, and is called laser diode thermal desorption (LDTD) coupled with atmospheric pressure chemical ionization (APCI). The first LDTD project consists of the analysis of total MCs via Lemieux oxidation in order to obtain a common moiety of all MCs existing congeners. This fraction, the MMPB, is analyzed after a liquid-liquid extraction step, with the LDTD-APCI-MS/MS. A value of 0.2 µg L-1 was obtained for detection limit and concentrations between 1 and 425 µg L-1 have been found in contaminated water samples. In addition, a comparison with a parallel analysis using MCs congeners’ standards suggested the possible presence of undetected MCs or isomers. A second project involves the direct analysis of ANA-a using LDTD-APCI-HRMS in order to solve the isobaric interference, phenylalanine, which is possible due to the high resolution detection. The LDTD offers no chromatographic separation and by using HRMS, we can distinguish ANA-a signals from those of phenylalanine. A value of 0.2 µg L-1 was obtained as detection limit and the method has been applied on water bloom samples with a positive concentration of 0.21 µg L-1. Finally, using the LDTD-APCI-HRMS combination, analysis of total MCs has been adapted to fish tissues to determine the unbound and bound MCs and compare the results with standard analysis. The use of digestion with sodium hydroxide prior to Lemieux oxidation followed by SPE purification yielded a detection limit of 2.7 µg kg-1. Total MCs concentrations were found between 2.9 and 13.2 µg kg-1 in real field-collected contaminated fish samples and comparison was made with standard analysis which yield a single positive sample with a concentration of 2 µg kg-1. This indicates the possible presence of undetected MCs using conventional analytical methods.