Le microenvironnement tumoral, et notamment le stress hypoxique, joue un rôle immunosuppressif permettant l’échappement des cellules tumorales à la surveillance du système immunitaire. Des études récentes ont montré que l’échange de microvésicules (MVs) entre les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire peut être responsable de l’établissement d’un microenvironnement immunosuppressif. Dans ce contexte, nous avons étudié l’effet des MVs issues des cellules tumorales hypoxiques sur la cytotoxicité des cellules «Natural Killer» (NKs). Nos résultats démontrent clairement que les cellules NKs sont capables d’internaliser les MVs issues des cellules tumorales normoxiques et hypoxiques. Cependant, seules les MVs hypoxiques sont capables de diminuer significativement la cytotoxicité des cellules NKs. Ainsi, nous avons déterminé que les MVs dérivées des cellules tumorales hypoxiques séquestrent deux immunomodulateurs, le TGF- et le miR-23a. Nous avons montré que le transfert de TGF- et miR-23a aux cellules NKs était responsable de la diminution respective de l’expression du récepteur activateur NKG2D à leur surface et de la protéine membranaire associée aux lysosomes (LAMP-1/CD107a) impliquée dans la dégranulation des granules cytotoxiques. Dans la deuxième partie de cette étude nous avons montré que les cellules tumorales soumises à un stress hypoxique étaient capables de déjouer un système immunitaire fonctionnel et d’échapper ainsi à la surveillance immunitaire des cellules NKs. En effet, nos résultats ont clairement démontré que la résistance des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NKs n’était pas liée à un défaut de reconnaissance, mais plutôt à l’activation d’un mécanisme de résistance intrinsèque dans les cellules tumorales. Ce mécanisme de résistance implique l’activation de l’autophagie qui opère dans les cellules tumorales pour dégrader le granzyme B, une protéase à sérine secrétée par les cellules NKs dont l’internalisation par les cellules tumorales cibles est nécessaire pour induire leur mort. Les expériences d’imagerie cellulaire combinées à des approches biochimiques ont confirmé que le niveau de granzyme B dans les cellules tumorales hypoxiques était significativement mois élevé par rapport à celui des cellules tumorales normoxiques. Ces résultats suggèrent fortement que le granzyme B est destiné à être dégradé par autophagie dans les cellules tumorales hypoxiques. En effet, l’inhibition génétique et pharmacologique de l’autophagie dans les cellules tumorales hypoxiques était suffisante pour contrecarrer la dégradation de granzyme B et ainsi restaurer la sensibilité des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NKs. Nos résultats ont clairement établi que l’inhibition de l’autophagie pouvait améliorer la réponse immunitaire antitumorale dépendante des cellules NK. Nous avons validé ce concept in vivo chez la souris en utilisant deux modèles syngéniques de cancer du sein et de mélanome. L’ensemble de nos travaux indiquent clairement que le stress hypoxique, qui est une caractéristique majeure du microenvironnement tumoral, peut favoriser l’établissement d’un microenvironnement immunosuppressif par plusieurs mécanismes qui ne s’excluent pas mutuellement. En effet, le stress hypoxique modifie les caractéristiques des cellules tumorales et active des mécanismes de résistance à la surveillance immunitaire. De plus, les cellules tumorales modifiées peuvent éduquer et exporter leur phénotype hypoxique aux cellules immunitaires présentes dans le microenvironnement afin d’affaiblir leur pouvoir cytotoxique. Nos résultats ouvrent ainsi la voie à la mise en place de nouvelles applications cliniques en immunothérapie anticancéreuse basées sur la réactivation des lymphocytes cytotoxiques et l’inhibition simultanée de l’autophagie. / The tumor microenvironment, including hypoxic stress plays an immunosuppressive role in tumor cell escape from immune surveillance. Recent studies have shown that the exchange of microvesicles (MVs) between tumor cells and cells of the immune system could be responsible for the establishment of an immunosuppressive microenvironment. In this context, we investigated the effect of MVs derived from hypoxic tumor cells on the cytotoxicity of Natural Killer (NK) cells. Our results clearly demonstrated that NK cells are able to internalize MVs derived from both normoxic and hypoxic tumor cells. However, only hypoxic MVs are able to significantly reduce the cytotoxicity of NK cells. Thus, we revealed that MVs derived from hypoxic tumor cells sequester two immunomodulators, TGF- and miR-23a. We have shown that the transfer of TGF- and miR-23a to NK cells was responsible for the respective reduction of the expression of NKG2D activating receptor on their surface and lysosomal-associated membrane protein (LAMP-1 / CD107a) involved in degranulation of cytotoxic granules.In the second part of this thesis we have shown that tumor cells subjected to hypoxic stress were able to outmaneuver a functional immune system and thus escape NK-mediated immune surveillance. Indeed, our results clearly demonstrated that the resistance of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis was not related to the impairment of recognition by NK cells, but rather to the activation of an intrinsic resistance mechanism in tumor cells. We showed that the resistance mechanism involves the activation of the autophagy which operates in the tumor cells to degrade the granzyme B, a serine protease secreted by NK cells and internalized by target tumor cells to induce cell death. Cell imaging experiments combined to biochemical approaches have confirmed that the level of granzyme B in hypoxic tumor cells was significantly higher compared to normoxic tumor cells. The analysis of the subcellular distribution of granzyme B reveals that it is predominantly present in the endosomes and autophagosomes of hypoxic tumor cells. These results strongly suggest that granzyme B is subjected to be degraded by autophagy in hypoxic tumor cells. Genetic and pharmacological inhibition of autophagy in hypoxic tumor cells was sufficient to block the degradation of granzyme B and thus restore the sensitivity of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis. Our results clearly demonstrated that inhibition of autophagy could improve NK-mediated antitumor immune response. We validated this concept in vivo using two syngeneic mice model of breast cancer and melanoma.Taken together, our work clearly shows that hypoxic stress, which is a major feature of the tumor microenvironment, can promote the establishment of an immunosuppressive microenvironment by several mechanisms which are not mutually exclusive. Thus, hypoxic stress changes the characteristics of tumor cells and activates the mechanisms of resistance to immune surveillance. In addition, tumor cells can educate and export their hypoxic phenotype to the immune cells in the microenvironment in order to impair their cytotoxicity. Our findings pave the way for the development of new clinical applications in cancer immunotherapy based on the reactivation of cytotoxic lymphocytes and simultaneous inhibition of autophagy.

Chez les mammifères adultes, les cellules souches et les progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) présents dans la moelle osseuse sont à l'origine de la production des cellules sanguines tout au long de la vie. L'auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation des CSPH sont sous le contrôle d'un microenvironnement cellulaire spécifique appelé " niche ". Deux niches sont identifiés dans la moelle osseuse : une niche endostéale et vasculaire. Les processus moléculaires contrôlant les communications cellulaires entre les niches et les HSPC sont complexes et demeurent mal connues. Du fait de la conservation des facteurs de transcription et des voies de signalisations entre les mammifères et la drosophile, l'organe hématopoïétique de la drosophile : la glande lymphatique s'est avéré être un excellent modèle pour étudier les communications cellulaires entre les niches et les CSPH. La glande lymphatique est accolée au tube cardiaque (système vasculaire), qui contrôle la morphologie et la fonction du PSC (Posterior Signaling Center), un centre de signalisation contrôlant la différenciation des cellules immunitaires/sanguines dans la glande lymphatique. Au cours de mes travaux de thèse, j'ai réalisé un crible fonctionnel in vivo, pour déterminer si indépendamment de son effet sur le PSC, les cellules du tube cardiaque étaient capables de contrôler directement l'homéostasie de la glande lymphatique. La réalisation de ce crible m'a permis d'identifier quatre ligands produits par les cellules du tube cardiaque et requis au maintien des progéniteurs hématopoïétiques dans la glande lymphatique, notamment le ligand Branchless de la voie de signalisation FGF (Fibroblast Growth Factor). La perte de fonction du ligand FGF/Branchless dans le tube cardiaque ou du récepteur FGF/Breathless dans les progéniteurs hématopoïétiques entraine une différenciation accrue et une diminution du pool de progéniteurs dans la glande lymphatique. Mes résultats indiquent que le tube cardiaque a un rôle équivalent à une niche pour contrôler l'hématopoïèse dans la glande lymphatique et que la voie de signalisation FGF joue un rôle clé dans ces communications cellulaires. [...] / In adult mammals, hematopoietic stem cell and progenitors (HSPC) are present in the bone marrow and produce all blood cell type along the life. Renewal, proliferation and differentiation of the HSPC are tightly control by a specific microenvironment called the "niche", composed by an endosteal and a vascular niche. Molecular processes controlling cellular communications between niches and HSPC are complex and remain poorly understood. Since many transcription factors and signalization pathway are conserved in controlling hematopoiesis both in mammals and Drosophila, the Drosophila hematopoietic organ: the lymph gland became an excellent model to decipher cellular communications between the niche and HSPC. The lymph gland is aligned the cardiac tube (vascular system), which control the size and the function of the PSC (Posterior Signaling Center). The PSC is a signaling center controlling the differentiation of immune/blood cells in the lymph gland. During my PhD, I performed an in vivo functional screen to determine whether independently of its role on the PSC, cardiac cells were able to control directly the lymph gland homeostasis. The realization of this screen, allowed me to identify four ligands produced by cardiac tube cells and required to maintain lymph gland hematopoietic progenitors. One of this ligand is a FGF (Fibroblast Growth Factor) ligand Branchless. Knock down of FGF/branchless ligand in cardiac tube cells or FGF/Breathless receptor in hematopoietic progenitors lead to an increase in immune cells differentiation at the expense of the progenitor pool. My results establish that the cardiac tube plays a role similar to a niche in controlling lymph gland homeostasis and the FGF pathway plays a key role in this cellular communication. [...]