Le but de ce travail était de rechercher le rôle du microenvironnement dans la progression tumorale du cholangiocarcinome intrahépatique (CCIH) par une approche translationnelle, associant recherche fondamentale et clinique. Une étude transcriptomique du stroma tumoral a permis de mettre en évidence une signature spécifique de celui-ci, dont l’analyse non supervisée montrait un enrichissement dans les gènes de la matrice extracellulaire, du cycle cellulaire, de la voie TGFβ et des marqueurs de cellules souches. Ces résultats ont été validés au niveau protéique par immunohistochimie sur tissue microarrays à partir d’une cohorte indépendante. La corrélation de ces résultats avec les données cliniques a permis de démontrer que le niveau d’expression de l’Osteopontin dans le stroma était un facteur de risque indépendant de récidive et de survie. Par ailleurs, nous avons démontré que le taux sérique d’Osteopontin préopératoire des patients porteurs d’un CCIH était significativement supérieur à celui de sujets sains. Avec un seuil déterminé à 57,8 ng/ml, la sensibilité et spécificité de ce biomarqueur diagnostique était respectivement de 80 et 100%. De plus, nous avons apporté des arguments supplémentaires concernant le rôle des cellules souches cancéreuses dans la progression du CCIH, en mettant en évidence une corrélation entre le niveau d’expression de marqueurs souches tels qu’EpCAM et CD44 dans le stroma tumoral ainsi que dans le tissu fibreux du foie « sain » péri-lésionnel et le risque de récidive. Les résultats de notre étude ont confirmé le rôle central du microenvironnement dans la progression du CCIH, permis de mettre en évidence 2 nouveaux biomarqueurs pronostiques, et ouvert de nouvelles voies de recherche thérapeutiques. / The aim of this study was to specifically determine through a translational approach combining basic and clinical research, the role of the microenvironment in the tumor progression of intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC). By gene expression profiling, we identified a signature that significantly discriminate the tumor stroma from non-tumor fibrous tissue, and the functional analysis of differentially expressed genes showed an enrichment in genes of the extracellular matrix , the cell cycle, the TGFb pathway and stem cell markers. Tissue microarray analysis using an independent cohort of ICC patients validated at a protein level the increased expression of selected candidate genes. Statistical analysis between basic and clinical data demonstrated that the stromal expression of Osteopontin was an independent prognostic marker for overall and disease-free survival. We also demonstrated that the preoperative serum level of Osteopontin was significantly higher in ICC patients than in healthy subjects. Our results identified the best diagnostic threshold to 57,8 ng/ml, associated with a sensitivity and specificity reaching to 80 and 100%, respectively. Moreover, we showed that level expression of stem cell markers such as EpCAM and CD44 in tumor stroma as well as in the fibrous non tumor liver tissue was correlated with recurrence, suggesting the pivotal role of cancer stem cells in ICC prognosis. In conclusion, our study confirmed the major involvement of the microenvironment in the progression of CCIH, allowed to identify two new prognostic tumor biomarkers, and highlighted new pathways for targeted therapeutics.

Les lymphomes hodgkiniens(LH) représentent 30% des lymphomes. 90 % des patients en sont gueris mais parfois au prix d'importants effets secondaires(cancers secondaires notamment). L'enjeu actuel consiste à identifier les patients susceptibles de bénéficier d'une déescalade thérapeutique(même résultat thérapeutique obtenu au prix d'un traitement moins lourd)Actuellemnt les facteurs pronostiques utilisé en routine(stade Ann Arbor et index pronostic internationnal) ne permettent qu'une stratification imparfaite des patients notamment pour les stades localisés. Dans le but d'identifier de nouveaux facteurs pronostiques des LH nous avons mené une étude d'expression génétique sur puces Affimetrix. Nous identifions une signature moléculaire reliée à un bon pronostic et enrichie en gènes lymphocytaires B comprenant BCL11A, un facteur de transcription exprimé par les lymphocytes B et les cellules dendritiques plasmocytoïdes. Nous validons ce résultats en immunohistochimie sur TMA et retrouvons un meilleur pronostic associé aux tumeurs dont le microenvironnement est riche en cellules BCL11A+ et CD20+. Nous mettons également en évidence dans les cas EBV+ une signature d'expression génique enrichie en gènes caractéristiques d'une réponse immunitaire Th1 et anti-virale. Ces résultats peuvent fournir un rationnel scientifique à de nouvelle stratégies thérapeutiques. Il sera intéressant d'évaluer le bénéfice d'une déescalade thérapeutique chez les patients dont la tumeur présente un microenvironnement riche en lympocytesB. / The outcome of classical Hodgkin lymphoma(cHL)patients may be related to the tumor microenvironment, which in turn may be influenced by Epstein-Barr virus(EBV)infection. To characterize the cHL microenvironment, a set of 63 cHL tissue samples was profiled using DNA microarrays. Their gene expression profile differed from that of histiocyte T-cell-richB-cell lymphoma(H/TCRBCL)samples that were used as controls, mainly du to high expression of PDCD1/PD-1 in H/TCRBCL. EBV-cHLtissues could be distinguished from EBV+samples by a gene signature characteristic ofTh1 and antiviral responses. Samples from cHL patients with favourable outcome overexpressed genes specific for B cells and genes involved in apoptotic pathways. An independent set of 146 cHL samples was analyzed using immunohistochemistry. It showed a significiant adverse value in case of high percentage of either TIA-1+-reactive cells or topoisomerase-2+tumor cells, whereas high numbers of BCL11A+, FOXP3+, or CD20+ reactive cells had a favorable influence. Our results suggest an antitumoral role for B cells in the cHL microenvironment and a stronger stromal influence of the strategies.120

Le mélanome est un cancer cutané dérivé de la transformation maligne des mélanocytes, cellules responsables de la pigmentation de la peau. Aujourd'hui, il est clairement reconnu que la progression tumorale est le produit d'une interaction dynamique entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. Parmi les modes de communication intercellulaire, la sécrétion de nanovésicules appelées exosomes apparaît depuis une vingtaine d'années comme des acteurs majeurs de cette communication. En effet, ils permettent le transport d'un matériel complexe qui pourra impacter le devenir des cellules réceptrices. Bien que différentes données de la littérature aient mis en évidence le rôle des exosomes dans la progression du mélanome ainsi que la résistance aux traitements, les mécanismes moléculaires associés restent peu connus. Le premier objectif de ma thèse a consisté en l'identification du contenu protéique des exosomes de mélanome. Pour cela, nous avons identifié par spectrométrie de masse l'exoprotéome de sept lignées de mélanome d'agressivités différentes. L'analyse de ces résultats nous a permis de mettre en évidence une signature spécifique au niveau des exosomes sécrétés par les cellules les plus agressives. Cette signature a pu être corrélée à des propriétés fonctionnelles portées par ces vésicules. En effet, le traitement de cellules moins agressives par ces vésicules suffit à augmenter leur potentiel migratoire. Ces résultats montrent le rôle joué par les exosomes de mélanome dans la communication entre cellules cancéreuses et la progression tumorale. Parmi les cellules composant le microenvironnement d'un mélanome invasif, les adipocytes présents dans l'hypoderme représentent un acteur émergeant favorisant la progression tumorale. L'équipe dans laquelle j'ai effectué ma thèse a été l'une des premières à montrer, dans un modèle de cancer du sein, l'importance des adipocytes dans l'agressivité tumorale. Bien que différentes études aient montré l'impact des adipocytes sur la progression du mélanome, les mécanismes moléculaires associés restent peu connus. Le second aspect de ma thèse a consisté en l'étude du rôle des adipocytes dans la progression de ce type de tumeurs. Ces derniers stimulent le potentiel migratoire de cellules de mélanome et cet effet est médié par les exosomes sécrétés par les adipocytes (ad-exos). De façon intéressante, nous avons observé que les ad-exos contiennent des protéines impliquées dans chaque étape du métabolisme des acides gras et induisent une reprogrammation métabolique des cellules cancéreuses. L'augmentation de la migration des cellules tumorales induite par les ad-exos est dépendante de ce remodelage métabolique. Ces résultats montrent que les ad-exos participent au dialogue délétère entre mélanome et adipocytes. Ce dialogue pourrait être amplifié dans des conditions d'obésité expliquant le pronostic défavorable observé chez ce sous-groupe de patients. Nous avons montré, qu'en condition d'obésité, la sécrétion d'exosomes par les adipocytes est augmentée. De plus, à quantité égale d'exosomes, l'effet des ad-exos de souris obèses sur la migration des cellules cancéreuses est amplifié. Les ad-exos pourraient donc en partie être responsables du mauvais pronostic observé pour les individus obèses. En conclusion, nous avons montré que les exosomes sont des acteurs majeurs de la progression du mélanome. La signature spécifique que nous avons mise en évidence dans les vésicules sécrétées par les lignées métastatiques pourrait, à terme, être utilisée pour le pronostic de ce cancer. D'autre part, les ad-exos induisent un remodelage métabolique des cellules cancéreuses conduisant à l'augmentation du potentiel migratoire. La compréhension du rôle joué par ces vésicules permettra à terme d'interrompre le dialogue délétère entre adipocytes et cellules tumorales, en particulier chez les individus obèses. / Melanoma is a skin cancer derived from the malignant transformation of melanocytes, cells involved in the skin pigmentation. It is now clearly established that tumor progression results in a dynamic interaction between tumor cells and their microenvironment. Among the different modes of cell communication, the secretion of nanovesicles called exosomes has been extensively studied in the last twenty years and they appear to be major actors in this communication. Indeed, they enable the transport of complex biological material that may impact the behavior of recipient cells. Whereas melanoma exosomes have been implicated in tumor progression and chemoresistance, the mechanisms associated with these processes are little known. The first part of my thesis consisted in the identification of the protein content of melanoma cell exosomes. We identified the exoproteome of seven melanoma lines with various degrees of agressivity using mass spectrometry. The obtained results highlighted the presence of a specific signature in the exosomes secreted by the most aggressive cells. Moreover, this signature was correlated with functional properties of the vesicles. Indeed, incubation of less aggressive cells with these vesicles promoted their migratory abilities. These results show the role of melanoma exosomes in cancer cell communication and in tumor progression. Among the cells composing the microenvironment of invasive melanoma, adipocytes, present in the hypodermis, represent an emerging actor in tumor progression. The group in which I did my PhD was one of the first to highlight the importance of fat cells in breast cancer aggressiveness. Whereas different studies have shown the role of adipocytes in melanoma progression, the mechanisms associated are little known. The second aim of my thesis therefore consisted in the study of the role of adipocytes in melanoma progression. We have shown that adipocytes stimulate the migratory abilities of melanoma cells and that this effect is mediated by exosomes secreted by adipocytes. Interestingly, we observed that these vesicles contain proteins involved in every step of fatty acid metabolism and induce a metabolic reprogramming of cancer cells. The increase in tumor cell migration induced by adipocyte exosomes is dependent on this metabolic remodeling. These results show that adipocyte exosome are actors of the deleterious dialogue between melanoma and adipocytes. This dialogue could be amplified in obese conditions and could explain the poor prognostic of this subtype of patients. We have shown that in obese conditions, exosome secretion by adipocytes is increased. In addition, at equal concentrations in exosomes, the effect of the vesicles secreted by adipocytes from obese mice on cancer cell migration is amplified. Adipocyte exosomes could therefore participate in the poor prognosis of obese patients. In conclusion, we have shown that exosomes represent a major player in melanoma progression. The specific pattern contained in the exosomes from aggressive cells could be used as prognostic biomarkers in melanoma. On the other hand, adipocyte exosomes induce a metabolic reprogramming of cancer cells and this leads to an increase in their migratory abilities. Understanding the role of adipocyte exosomes in tumor progression could help to stop the deleterious dialogue between adipocytes and tumor cells, particularly in obese individuals.

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont dus à une atteinte oligoclonale de la cellule souche hématopoïétique aboutissant à une dysplasie des lignées myéloïdes, des cytopénies sanguines et une évolution fréquente vers la leucémie aiguë. De nombreuses mutations décrites dans des gènes contrôlant la régulation épigénétique sont responsables de la genèse des SMD. Mais des travaux récents montrent également que des anomalies du microenvironnement médullaire, notamment des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), peuvent induire et propager un SMD suggérant l’idée d’une communication intercellulaire étroite entre la niche et les cellules hématopoïétiques. L’invalidation du gène Dicer1 (RNASE de type III impliquée dans le processing des microARN) dans les progéniteurs ostéoblastiques murins induit un véritable SMD avec dysmyélopoïèse.Nous avons confirmé la sous-expression de Dicer1 dans les CSM SMD à partir de prélèvements primaires de moelle totale et dans les CSM en expansion. La sous-expression de Dicer1 s’accompagne d’une dérégulation du profil des microARN au sein de CSM SMD mise en évidence par étude transcriptomique des CSM SMD vs CSM témoins. Nous avons découvert une possible cible thérapeutique : le miR-486-5p que nous avons retrouvé constamment surexprimé dans les CSM SMD. Un des moyens pour les CSM d’influer sur les cellules souches hématopoïétiques peut se faire par la sécrétion de vésicules extracellulaires (EVs). Ces EVs sont hétérogènes et peuvent être définies par leur taille. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux petites vésicules extracellulaires (sEVs) contenant la fraction exosomale qui est connue comme pouvant transporter des microARN, mARN et des protéines entre les cellules. Nous avons retrouvé ce miR-486-5p transporté comme cargo dans les sEVs sécrétées des CSM, des CSM vers les CD34+. De plus, nous montrons dans un modèle de co-incubation (sEVs avec CD34+ de sujets sains), que sur le plan fonctionnel, les sEVs provenant de CSM SMD induisent plus d’apoptose, plus de stress oxydatif ainsi que plus de dommage à l’ADN.Par ailleurs, la surcharge martiale observée chez les patients SMD est également responsable d’un stress oxydatif. Le déférasirox (DFX), un chélaleur de fer, a montré dans le cadre d’études rétrospectives une amélioration de l’érythropoïèse chez des patients SMD. Grâce à un modèle de différenciation érythroïde avec surcharge martiale, nous avons montré que de faibles doses de DFX induisent une meilleure prolifération des progéniteurs érythroïdes (moins d’apoptose et plus de cellules en cycle) via une activation de NF-κB. Cette activation est due à une diminution du niveau de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) en rapport avec une diminution du fer labile et est contrôlée de manière très fine par le niveau de ROS.Enfin, nous avons utilisé les propriétés du microenvironnement médullaire pour établir un modèle murin de SMD humain. En effet, la relative incapacité des cellules souches myélodysplasiques humaines de greffer et de reconstituer une hématopoïèse pathologique dans des souris immunodéprimées suggère que ces cellules souches SMD doivent avoir besoin d’un support extrinsèque du microenvironnement. Nous avons réalisé un modèle de souris humanisées en co-injectant des CSM et des CD34+ en intratibial. Une prise de greffe a été observée chez toutes les souris injectées et avons pu étudier l’évolution clonale au fil des générations dans les différentes sous-populations de progéniteurs myéloïdes (common myeloid progenitors (CMP), granulocyte macrophage progenitors (GMP) and megakaryocyte–erythroid progenitor (MEP)). Notre modèle est stable au cours des générations avec persistance du clone fondateur initial.En conclusion, ce travail confirme le rôle prépondérant du microenvironnement médullaire dans la genèse et la physiopathologie des syndromes myélodysplasiques et ouvre la voie à de nouvelles possibilités thérapeutiques. / Myelodysplastic syndromes (MDS) are hematopoietic stem cell (HSC) oligoclonal diseases leading to dysplasia, blood cytopenia and evolution to acute leukemia. Numerous mutations in genes involved in epigenetic regulation are responsible of MDS genesis. But recently, studies show that medullar microenvironment, particularly mesenchymal stromal cells (MSC), could induces and propagates a truly MDS suggesting a narrow communication between HSC and this niche. Dicer1’s (type III RNAse implicating in microRNA processing) invalidation in murine osteoblastic progenitors induces a MDS with sign of dysplasia.In this work, we have confirmed the under expression of Dicer1 in MDS mesenchymal stromal cells from total bone marrow and cultured MSC. Dicer1 down regulation leads to a deregulation of miRNome profile in MDS MSC highlighted by transcriptomic approaches. We found a potential therapeutic target: miR-486-5p which is constantly overexpressed in MDS MSC. Extracellular vesicles (EVs) could be a possible way for MSC to influence HSC fates. Those EVs are heterogeneous are could be characterized by their sight. We mainly focused on small EVs (sEVs) containing the exosomal fraction known to be able to carry miRNA, mRNA and proteins. We found that miR-486-5p is carry from MSC to the HSC. Transcriptomic analyses of HD HSC overexpressing miR-486-5p are ongoing. Moreover, in a co-incubation model (sEVs and healthy donor (HD) HSC), sEVs coming from MDS MSC induced apoptosis, oxidative stress and DNA damages.Moreover, iron overload seen in MDS patients is also able to induce DNA damages and oxidative stress. Deferasirox (DFX), an iron chelator, has shown an erythropoiesis improvement in MDS patients. Using an erythroid differentiation model with iron overload, we have observed that low dose of DFX induce a better proliferation of erythroid progenitors (less apoptosis and more cycling cells) due to NF-κB activation. This activation is due to a decrease of reactive oxygen species level in relation to a decrease of the labile iron pool.Finally, we have used medullar microenvironment properties to establish a murine model of MDS. Indeed, MDS HSC incapacity to reconstitute a pathological hematopoiesis in immunocompromised mice suggests that MDS HSC need an extrinsic support from the microenvironment. We have engineered a MDS patient derived xenograft (PDX) model by intra-tibial co-injection CD34+ cells with MSC. All mice engrafted et we have follow the clonal evolution over mice generation in the different subset of myeloid progenitors. (common myeloid progenitors (CMP), granulocyte macrophage progenitors (GMP) and megakaryocyte–erythroid progenitor (MEP)). Our model is stable over generations with persistence of the initial founding clone.In conclusion, this work confirms the preponderant role of the medullary microenvironment in the genesis and physiopathology of myelodysplastic syndromes and opens the way to new therapeutic possibilities.

L’immunothérapie est une avancée majeure dans le traitement des cancers, même s’il reste fondamental d’identifier de nouvelles cibles pour optimiser la réponse anti-tumorale. Des enzymes impliquées dans le métabolisme d'acides aminés ont été décrites comme pouvant inhiber ces réponses immunitaires et ainsi favoriser la progression tumorale. Elles sont donc devenues des cibles thérapeutiques de premier choix. L’IL-4 induced gene 1 (IL4I1) est une phénylalanine oxydase qui, au cours de cette dernière décennie, s’est dévoilée dans la littérature comme un véritable outil de la tolérance périphérique. Ses fonctions restent cependant largement inexplorées. Au cours de ma thèse, j’ai étudié les propriétés immunorégulatrices de l’IL4I1 en contexte tumoral dans un modèle de mélanome spontané (souris Ret), mais également dans la physiologie des lymphocytes B (LB). Dans un premier temps, mes résultats mettent en avant que l’activité enzymatique de l’IL4I1 dans les rates des souris Ret est corrélée avec la sévérité de la maladie. De façon intéressante, l’inactivation génétique de l’IL4I1 dans ce modèle (RetIL4I1KO) retarde le développement de la tumeur primaire, mais aussi la dissémination métastatique. Nous démontrons que l’IL4I1, principalement exprimée par les cellules myéloïdes, a la capacité de façonner la composante immunitaire du microenvironnement tumoral, et ce, par le recrutement préférentiel de cellules myéloïdes au détriment d’effecteurs lymphocytaires T. Par ailleurs, mes données chez les souris déficientes pour l’IL4I1 (IL4I1KO) ont mis en évidence un rôle crucial de l’IL4I1, régulant de nombreuses étapes de la biologie des LB. Les souris IL4I1KO présentent une sortie accélérée des LB de la moelle osseuse, entraînant l'accumulation de LB folliculaires en périphérie. Ces souris ont un taux sérique élevé d'immunoglobulines naturelles et des anticorps auto-réactifs. Nous démontrons aussi que l’IL4I1 contrôle la réaction du centre germinatif, la différenciation des plasmocytes et la production d'anticorps spécifiques en réponse à une immunisation par un antigène T-dépendant. In vitro, l’absence de l’IL4I1 dans les LB augmente l’activation des voies de signalisation en aval du récepteur à l’antigène des LB (BCR), ainsi que leur prolifération. Par conséquent, nos résultats révèlent une propriété clé de l’IL4I1, contrôlant négativement l'activation dépendante du BCR. Compte tenu de l’effet majeur de l’IL4I1 sur la biologie des LB, il reste important d’investiguer si l’hyperréactivité du BCR des LB déficients pour l’IL4I1 participe au meilleur contrôle de la progression tumorale. / Immunotherapy is one of the most promising advance in cancer treatments. It remains essential to identify new targets to maximize the anti-tumor immune response. Enzymes involved in amino acid metabolism have been described to impede these responses and thus promote tumor progression. They became good therapeutic targets. IL-4-induced gene 1 (IL4I1) is a phenylalanine oxidase which, over the last decade, was unveiled as a real tool for peripheral tolerance. However its functions remain largely unexplored. During my PhD thesis, I studied the immunoregulatory properties of IL4I1 in a tumoral context involving a spontaneous melanoma model (Ret mice), but also in the B cell physiology. First, my results highlight that the IL4I1 enzymatic activity is positively correlated with disease aggressiveness in the spleen of Ret mice. Interestingly, genetic inactivation of IL4I1 in this model (RetIL4I1KO) delayed the development of both primary tumor and metastatic dissemination. We demonstrate that IL4I1, mainly expressed by myeloid cells, has the ability to shape the immune compartment within the tumor microenvironment, through recruitment of myeloid cells instead of activated T cells. Furthermore, my data in mice deficient for IL4I1 (IL4I1KO) have emphasized a crucial role of IL4I1 in regulating many steps of B cell biology. Indeed, IL4I1KO mice exhibit an accelerated B cell egress from the bone marrow, resulting in the accumulation of peripheral follicular B cells. These mice have a high serum level of natural immunoglobulins and auto-reactive antibodies. We also demonstrate that IL4I1 controls the germinal center reaction, plasma cell differentiation and specific antibody production in response to a T-dependent antigen immunization. In vitro, the absence of IL4I1 in B cells increases their proliferation and the activation of signaling pathways upon B cell receptor (BCR) engagement. Thus, our results reveal a key role of IL4I1, which negatively controls the BCR-dependent activation. Regarding these effects of IL4I1 on B cell biology, it remains important to evaluate whether the BCR-dependent hyperreactivity in IL4I1KO mice contributes in the tumor control.

La sénescence cellulaire est un mécanisme de suppression cellulaire caractérisé par un arrêt irréversible du cycle cellulaire. Les cellules sénescentes ont également un secrétome spécifique qui influe sur les cellules voisines, pouvant induire leur entrée prématurée en sénescence, l'apoptose, la prolifération cellulaire et le développement tumoral. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'identifier une nouvelle protéine sécrétée par les fibroblastes sénescents et de caractériser ses fonctions dans les cellules sénescentes et dans les cellules tumorales. Nous avons mis en évidence la protéine WNT16B. Elle est surexprimée dans plusieurs modèles de sénescence cellulaire obtenus à partir de fibroblastes pulmonaires. Dans un modèle de souris transgénique, WNT16B est également associée avec l'accumulation de cellules sénescentes dans les lésions précancéreuses pulmonaires. WNT16B est impliqué dans le mécanisme de sénescence cellulaire. En effet, l'inhibition de WNT16B prévient l'entrée en sénescence, en empêchant l'activation de p53 et l'expression de p21/WAF1, et donc l'arrêt du cycle cellulaire.Nous avons finalement associé l'expression de WNT16B avec la présence de cellules sénescentes dans des tumeurs prélevées chez des patients atteints de carcinomes pulmonaires non à petites cellules. Cette expression est corrélée avec une meilleure survie pour les patients ayant reçu un traitement chimiothérapeutique. Ce dernier résultat fait donc le lien entre traitement, sénescence cellulaire et survie, et illustre le rôle potentiel des marqueurs des cellules sénescentes pour le suivi des patients. Globalement, ces travaux ont donc non seulement permis d'identifier WNT16B comme nouveau marqueur des cellules sénescentes, mais ils ont également ouvert des perspectives d'utilisation de ce marqueur pour l'identification, le traitement et le suivi des patients atteints d'un cancer.

Les Bmps sont des morphogènes jouant des rôles dans l’embryogenèse et l’organogenèse du tube digestif. Les BR-Smads, Smad1, Smad5 et Smad8, sont les effecteurs intracellulaires de cette cascade de signalisation et ils assurent la biodiversité des réponses biologiques associées aux Bmps. Plusieurs études ont démontrées des rôles importants pour le TGF-β dans le cancer colorectal et l’inflammation intestinale. Cependant, très peu d’études se sont attardées aux rôles pouvant être joués par d’autres membres de la superfamille du TGF-β dans ces pathologies. Dans cette étude, le modèle de souris possédant la délétion de Smad5 strictement à l’épithélium a permis de démontrer le rôle spécifique de cet effecteur dans les diverses actions associées à la signalisation des Bmps dans ce compartiment cellulaire. La perte conditionnelle de Smad5 cause un allongement villositaire, une hyper migration et une relocalisation cytoplasmique de la E-cadhérine dans les cellules épithéliales. Cette étude permet de démontrer l’importance de la signalisation des Bmps dans les maladies inflammatoires intestinales, puisque les défauts occasionnés par la perte de Smad5 au niveau de l’épithélium entrainent une plus grande susceptibilité à l’inflammation intestinale et des défauts importants dans la réparation la barrière épithéliale. Des mutations causant l’inhibition de la signalisation des Bmps sont fréquemment retrouvées chez des patients atteints du syndrome de JPS possédant un risque élevé de développer le cancer colorectal. Des études ont démontré l’implication des Bmps dans le maintien de l’homéostasie et l’initiation de la polypose intestinale, sans toutefois discriminer le mécanisme et le type cellulaire responsable de l’induction de ce phénotype. Les études antérieures du laboratoire ont permis de démontrer que la perte des Bmps strictement épithéliale était insuffisante pour initier la polypose colique, suggérant une implication de cette signalisation au niveau des cellules extra-épithéliales. Le modèle murin ayant la délétion du récepteur Bmpr1a dans le mésenchyme seulement a permis de mettre en évidence un rôle essentiel de cette signalisation dans le contrôle du microenvironnement entourant les cellules épithéliales et l’induction de la polypose colique. Le modèle cellulaire a révélé un profil transcriptionnel s’apparentant à celui retrouvé dans le microenvironnement des tumeurs de cancer colorectal. Cette étude démontre que la signalisation des Bmps mésenchymateuse est primordiale pour contrôler l’homéostasie intestinale et l’initiation de la polypose.

Le myélome multiple (MM) est une néoplasie B caractérisée par l'accumulation d'un clone plasmocytaire dans la moelle osseuse. Cette pathologie demeure incurable d'où la nécessité d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L'utilisation des puces à ADN a permis d'identifier, de nombreux gènes dont l'expression par les cellules de MM est associée à un mauvais ou bon pronostic. La plupart des gènes pronostics identifiés dans le MM codent pour des protéines impliquées dans les processus de réplication, de réparation et de recombinaison de l'ADN. Nous avons voulu aller plus loin dans l'identification et la fonction biologique de ces gènes pronostics. D'une part, nous avons recherché les gènes présentant des pics d'expression très élevés ‘gènes spikés' chez une fraction des patients. Ces gènes sont généralement associés à des évènements oncogéniques. D'autre part, nous avons identifié des gènes pronostics non associés à la machinerie du cycle cellulaire et qui sont fortement exprimés dans des cellules souches pluripotentes ou adultes. L'identification de ces gènes nous a permis de construire un score pronostic très puissant, éliminant les scores pronostics publiés à présent. Un autre aspect majeur est l'élucidation des mécanismes biologiques impliquant ces gènes et qui sont responsables de la résistance aux traitements et/ou de la courte durée de survie des patients, afin de pouvoir les reverser. Nous avons donc évalué le rôle biologique de DEPDC1A un gène fortement exprimée dans les cellules de MM en association avec un mauvais pronostic. Le knockdown conditionnel de DEPDC1A par l'utilisation d'un shRNA, inhibe la croissance des lignées de myélome avec une accumulation des cellules en phase G2/M du cycle cellulaire. Cette accumulation est associée à la phosphosphorylation et à la stabilisation de P53, et à l'accumulation de P21/WAF1. Le knockdown de DEPDC1A résulte également en l'expression de marqueurs de cellules plasmocytaires matures dans les lignées de MM : CD31, CD38, CD138, IL6R, CXCR4, CD9, VLA6. DEPDC1A contrôle donc le cycle cellulaire des plasmocytes tumoraux en interférant avec la voie P53 et bloque leur différenciation. Ces travaux montrent que DEPDC1A pourrait jouer un rôle essentiel dans la croissance des cellules de myélome et pourrait être une cible moléculaire prometteuse pour de nouvelles drogues ou de peptides-vaccins dans le MM. / Multiple myeloma (MM) is a B neoplasia characterized by the accumulation of a plasma cell clone in the bone marrow. This disease remains incurable, hence the need to identify new therapeutic targets. The use of DNA microarrays has identified many genes whose expression in MM cells is associated with poor or good prognosis. Most of the genes identified in the MM predictions encode proteins involved in DNA replication, repair and recombinaison processes. We wanted to go further in the identification and biological function of these prognostic genes.First, we looked for genes that have a spike expression, i.e. they are highly expressed in MMCs of a fraction of patients. These genes are generally associated with oncogenic events.On the other hand, we have identified pluripotent and adult stem cell genes unrelated to cell cycle and aberrantly expressed by human multiple myeloma cells in association with poor prognosis. The identification of these genes has allowed us to build a powerful prognostic score, stonger than already published scores.Another major aspect is the elucidation of biological mechanisms involving these genes that are responsible for drug resistance and/or short-term survival of patients, to revert them. We evaluated the biological role of DEPDC1A gene which are highly expressed in MM cells in association with a poor prognosis. The conditional knockdown of DEPDC1A by using an shRNA, inhibits the growth of myeloma cell lines with an accumulation of cells in G2/M phase of cell cycle. This accumulation is associated with phosphosphorylation and stabilization of p53, and accumulation of P21/WAF1. The knockdown of DEPDC1A also results in the expression of mature plasma cell in MM cell lines: CD31, CD38, CD138, IL6R, CXCR4, CD9, VLA6. DEPDC1A therefore controls the cell cycle of plasma cells by interfering with the p53 pathway and blocks their differentiation. This work shows that DEPDC1A could play a role in the growth of myeloma cells and could be a promising molecular target for new drugs or vaccine peptides in MM.

Le cancer de l'ovaire (CO) est la cinquième cause de décès chez les femmes qui se caractérise par son diagnostic tardif (stades FIGO III et IV) et par l’importance de ses métastases abdominales souvent observées au moment du diagnostic. Le traitement repose sur une chirurgie cytoréductive complète associée à une chimiothérapie. Malheureusement, parmi les patientes ayant une rémission clinique complète après la fin du traitement initial, 60% des personnes atteintes d'un cancer épithélial de l'ovaire (CEO) à un stade avancé rechuteront dans les cinq ans.L'importance de la néo-angiogenèse dans le développement des tumeurs a poussé les chercheurs à étudier d'autres stratégies. Les thérapies anti-angiogéniques ciblant le système vasculaire tumoral sont désormais utilisées en association avec la thérapie cytotoxique standard dans le traitement des CEO. Malheureusement, les progrès réalisés grâce à cette approche offrent encore un succès limité, qui peut s'expliquer en partie par l'interaction hétérotypique entre les cellules endothéliales et la tumeur. Plusieurs études suggèrent un dialogue complexe entre les cellules cancéreuses de l'ovaire (OCC) et les cellules endothéliales (EC) pouvant entraîner une sensibilité différente à la chimiothérapie et aux traitements anti-angiogéniques conduisant à la progression tumorale.L’objectif de la présente étude est d’étudier le rôle des interactions entre EC et OCC dans la prolifération et la chimiorésistance des CEO. Pour modéliser l'endothélium de la tumeur, nous avons utilisé notre modèle de cellules endothéliales AKT activées (E4+EC). Nous avons démontré en utilisant un modèle de coculture 2D que l’endothélium activé induit une prolifération et une chimiorésistance accrues dans les CEO par l’activation de la signalisation de Notch. Nous avons montré que l’expression et l’activation des récepteurs Notch étaient augmentées dans les cultures en coculture et dans les OCC résistantes à la chimiothérapie.L’accumulation d’ascite dans l’abdomen des patientes atteintes de CO semble jouer un rôle clé dans le mécanisme de propagation des OCC. Les OCC isolées flottent généralement dans l'ascite et forment des sphéroïdes multicellulaires. Dans ce contexte, nous avons développé un nouveau modèle 3D de sphéroïde pour étudier les interactions tumeur-endothélium dans un modèle plus proche des conditions in vivo. Nous avons démontré que les E4+EC et OCC formaient des angiosphères organisées avec un noyau de cellules endothéliales entourées par des OCC qui prolifèrent rapidement. Nous avons établi que l'activation de l'AKT dans les EC était nécessaire pour la formation d'angiosphères organisées. Fait intéressant, dans les ascites de patientes CEO, nous avons pu trouver des structures très similaires à nos angiosphères. De plus, dans une cohorte rétrospective de 59 patientes, nous avons montré que les EC étaient AKT activé chez des patientes atteintes de CEO, ce qui confirme l'importance de l'activation d’AKT dans la CEO. De plus, nous avons démontré l'importance du FGF2, de la Pentraxine 3 (PTX3), du PD-ECGF et du TIMP-1 dans l'organisation de l'angiosphères. Enfin, nous avons confirmé le rôle de Notch3/Jag1 dans le cross-talk des OCC-EC dans la prolifération et l'invasion des OCC au péritoine.En conclusion, notre étude illustre l’importance des EC AKT activé dans les CEO. Au vu des résultats mitigés des traitements anti-angiogéniques, se concentrer sur la normalisation vasculaire dans l'angiogenèse pathologique pourrait être plus efficace. Bien que l'AKT soit difficilement ciblable, la caractérisation génétique des tumeurs pourrait potentiellement identifier un sous-ensemble de tumeurs avec une signalisation NOTCH aberrante qui constituerait une cible idéale pour des inhibiteurs spécifiques. Alors que nous nous dirigeons vers la médecine personnalisée et de précision, il pourrait y avoir une place pour l'inhibition de NOTCH dans les CO en combinaison avec d'autres stratégies thérapeutiques. / Ovarian cancer (OC) is the most lethal gynecologic malignancy in developed countries and the fifth cause of death among women. OC is a heterogeneous disease, which is characterized by its late diagnosis (FIGO III and IV stages) and the importance of abdominal metastases often observed at the time of diagnosis. The mainstay of treatment involves complete cytoreductive surgery associated with platinum and taxane-based chemotherapy. Unfortunately, among patients achieving complete clinical remission after completion of initial treatment, 60% with advanced epithelial ovarian cancer (EOC) will relapse within five years.The importance of neo-angiogenesis in tumor formation, growth and dissemination has driven researchers to investigate into alternative strategies. Anti-angiogenic therapies targeting tumor vasculature are now used in combination with standard cytotoxic therapy in the treatment of EOC. Unfortunately, the progress achieved by this approach still offers limited success which can partly be explained by the heterotypic interaction between the tumor and endothelial cells. Evidence suggests a complex cross-talk between ovarian cancer cells (OCCs) and endothelial cells (ECs) that can result in the emergence of a heterogeneous tumoral and endothelial population with different sensitivity to chemotherapy and anti-angiogenic therapies leading to an increase of OCC proliferation and dissemination.The objective of the present study is to investigate the role of ECs and OCCs interactions in the proliferation and chemoresistance of EOC. To model tumor endothelium, we used our model of Akt-activated endothelial cells (E4+ECs). We demonstrated using a 2D co-culture model that activated endothelium induces increased proliferation and chemoresistance in EOC through the activation of Notch signaling. We showed that Notch receptor expression and activation are increased in co-culture and in OCCs resistant to chemotherapy.The accumulation of ascites in the abdomen of an OC patient seems to play a key role in the mechanism of OCC spreading. Detached cancer cells usually float in ascites and form multicellular spheroids. In this context, we developed a new model of organized multicellular 3D spheroid to study tumor-endothelium interactions in a model closer to in vivo conditions. We demonstrated that when cocultured in 3D condition, E4+ECs and OCCs formed organized tumor angiospheres with a core of endothelial cells surrounded by highly proliferating OCCs. We established that AKT activation in ECs was mandatory for the formation of organized angiospheres. Interestingly, in EOC patient ascites, we were able to find structures that were very similar to our angiospheres. In addition, in a retrospective cohort of 59 patients, we showed that ECs were AKT activated in EOC patients which support the importance of AKT activation in EC in EOC. Besides, we demonstrated the importance of FGF2, Pentraxin 3 (PTX3), PD-ECGF and TIMP-1 in angiosphere organization. Finally, we confirmed the role of Notch3/Jagged1 in OCCs-ECs crosstalk for OCC proliferation but also during peritoneum invasion.Altogether, our study illustrates the importance of AKT activated ECs in EOC. In a context of poor results of anti-angiogenic therapies in clinical settings, focusing on vascular normalization in pathological angiogenesis could be more efficient. While AKT is hardly targetable, the genetic characterization of tumors could potentially identify a subset of tumors with aberrant NOTCH signaling that would constitute an ideal target for specific inhibitors. As we move toward personalized and precision medicine, there might be a place for notch inhibition in advanced ovarian cancer in combination with other therapeutic strategies.

Les plaquettes sanguines ont comme rôle principal d’arrêter les saignements. Elles sont produites dans la moelle osseuse par des mégacaryocytes (MK) qui proviennent de la différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSH). L’objectif de ma thèse a été d’identifier les éléments cellulaires du microenvironnement contrôlant la mégacaryopoïèse. Mon travail a permis d’identifier une population particulière de progéniteurs hépatiques du foie foetal capable de promouvoir in vitro les étapes précoces de la mégacaryopoïèse à partir de CSH humaines et murines (Brouard et al., 2017). Le rôle des cellules endothéliales (EC) dans les étapes tardives de maturation a été étudié après purification à partir de moelle humaine dans des expériences de co-culture avec des MK prédifférenciés. Mes résultats montrent que ces EC ont la propriété unique, par comparaison avec des EC d’autres tissus, de promouvoir la maturation des MK. Une analyse transcriptionnelle différentielle a permis d’identifier des effecteurs possibles ouvrant des pistes pour mieux comprendre les mécanismes de la mégacaryopoïèse et pour améliorer la production des plaquettes en culture. / The main role of platelets is to stop bleeding. They are produced in the bone marrow by megakaryocytes (MK) that are produced by the differentiation of hematopoietic stem cells (HSC). The objective of my thesis was to identify the cellular elements of the microenvironment controlling megakaryopoiesis. My work has identified a particular population of hepatic progenitors from the fetal liver capable of promoting in vitro the early stages of megakaryopoiesis from human and murine HSC (Brouard et al., 2017). The role of endothelial cells (EC), purified from human bone marrow, in late maturation stages was studied in co-culture experiments with predifferentiated MK. My results show that these EC have the unique property in comparison with EC from other tissues, of promoting the maturation of MK. A differential transcriptional analysis identified possible effectors that could lead to a better understanding of the mechanisms of megakaryopoiesis and improve platelet production in culture.