Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le but de ce travail était de rechercher le rôle du microenvironnement dans la progression tumorale du cholangiocarcinome intrahépatique (CCIH) par une approche translationnelle, associant recherche fondamentale et clinique. Une étude transcriptomique du stroma tumoral a permis de mettre en évidence une signature spécifique de celui-ci, dont l’analyse non supervisée montrait un enrichissement dans les gènes de la matrice extracellulaire, du cycle cellulaire, de la voie TGFβ et des marqueurs de cellules souches. Ces résultats ont été validés au niveau protéique par immunohistochimie sur tissue microarrays à partir d’une cohorte indépendante. La corrélation de ces résultats avec les données cliniques a permis de démontrer que le niveau d’expression de l’Osteopontin dans le stroma était un facteur de risque indépendant de récidive et de survie. Par ailleurs, nous avons démontré que le taux sérique d’Osteopontin préopératoire des patients porteurs d’un CCIH était significativement supérieur à celui de sujets sains. Avec un seuil déterminé à 57,8 ng/ml, la sensibilité et spécificité de ce biomarqueur diagnostique était respectivement de 80 et 100%. De plus, nous avons apporté des arguments supplémentaires concernant le rôle des cellules souches cancéreuses dans la progression du CCIH, en mettant en évidence une corrélation entre le niveau d’expression de marqueurs souches tels qu’EpCAM et CD44 dans le stroma tumoral ainsi que dans le tissu fibreux du foie « sain » péri-lésionnel et le risque de récidive. Les résultats de notre étude ont confirmé le rôle central du microenvironnement dans la progression du CCIH, permis de mettre en évidence 2 nouveaux biomarqueurs pronostiques, et ouvert de nouvelles voies de recherche thérapeutiques. / The aim of this study was to specifically determine through a translational approach combining basic and clinical research, the role of the microenvironment in the tumor progression of intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC). By gene expression profiling, we identified a signature that significantly discriminate the tumor stroma from non-tumor fibrous tissue, and the functional analysis of differentially expressed genes showed an enrichment in genes of the extracellular matrix , the cell cycle, the TGFb pathway and stem cell markers. Tissue microarray analysis using an independent cohort of ICC patients validated at a protein level the increased expression of selected candidate genes. Statistical analysis between basic and clinical data demonstrated that the stromal expression of Osteopontin was an independent prognostic marker for overall and disease-free survival. We also demonstrated that the preoperative serum level of Osteopontin was significantly higher in ICC patients than in healthy subjects. Our results identified the best diagnostic threshold to 57,8 ng/ml, associated with a sensitivity and specificity reaching to 80 and 100%, respectively. Moreover, we showed that level expression of stem cell markers such as EpCAM and CD44 in tumor stroma as well as in the fibrous non tumor liver tissue was correlated with recurrence, suggesting the pivotal role of cancer stem cells in ICC prognosis. In conclusion, our study confirmed the major involvement of the microenvironment in the progression of CCIH, allowed to identify two new prognostic tumor biomarkers, and highlighted new pathways for targeted therapeutics.

Introduction. Alors qu’elle constitue le seul traitement curatif du cholangiocarcinome intrahépatique (CCIH), la résection reste associée à un taux de récidive supérieur à 60% et un taux de survie réelle à 5 ans inférieur à 20%. Une estimation fiable du pronostic ainsi qu’une meilleure compréhension de la biologie tumorale est essentielle pour améliorer le pronostic.Méthodes. A l’appui des données clinico-biologiques de deux larges cohortes de patients avec CCIH réséqué (MSKCC, n=189 et AFC, n=522), trois objectifs ont été explorés. Tout d’abord, définir quel modèle pronostique publié est le plus performant. Ensuite, définir la fiabilité de l’évaluation pronostique préopératoire à partir de, respectivement, l’imagerie, des microARN (miR) circulants diagnostiques et du profil génomique tumoral. Enfin, évaluer l’impact pronostique de la survenue d’événements périopératoires tels que transfusion et morbidité.Résultats. Premièrement, les nomogrammes apportaient une meilleure estimation pronostique en comparaison à la classification AJCC 7ème édition. Deuxièmement, la taille et la multifocalité tumorale sur l’imagerie préopératoire permettaient de différencier deux groupes de patients de pronostic clairement distincts (p<0,001). L’existence d’une mutation d’un gène de remodelage de la chromatine (BAP1, ARID1A, PBRM1) tendait à être associé à une survie sans récidive plus favorable qu’en l’absence de mutation (p=0,09). Alors qu’ayant un potentiel comme marqueur diagnostique circulant, miR21 et miR221 n’étaient pas associé à la survie. Troisièmement, la transfusion peropératoire n’impactait pas la survie à long terme alors que la survenue d’une complication sévère (grade Dindo-Clavien > 2) était indépendamment associée à une survie globale plus courte (p=0,002).Conclusion. Alors que les nomogrammes postopératoires apportent une meilleure estimation pronostique, le développement de modèles pronostiques préopératoires est faisable notamment à partir de l’imagerie et de marqueurs biologiques tumoraux complémentaires. / Introduction. Complete resection stands as the only curative option for intrahepatic cholangiocarcinoma (IHCC). Still, prognosis remains poor after resection due to a recurrence rate over 60% leading to actual 5-year survival rates below 20%. Reliable prognostic estimation and better understanding of tumor biology would be of interest for improving IHCC prognosis.Methods. Using clinical and biological data from two large cohort of resected IHCC (MSKCC, n=189 and AFC, n=522), three objectives have been explored. First, assessing the performances of different published prognostic models. Second, defining the reliability of preoperative prognostic estimation using imaging, tumoral genomic profiling and circulating tumoral microRNA (miR). Third, evaluating the prognostic impact of perioperative events such as blood transfusion and morbidity.Results. First, nomograms displayed better prognostic accuracy over the AJCC 7th edition staging system. Second, tumor size and multifocality on preoperative imaging allowed patient stratification in groups statistically different regarding prognosis (p<0.001). Further, the presence of chromatine remodeling gene mutations (BAP1, ARID1A, PBRM1) tended towards longer recurrence-free survical (p=0,09). Some diagnostic circulating miR such as miR21 and miR221 were not associated with survival. Third, in contrast with intraoperative transfusion, the occurrence of severe morbidity (Dindo-Clavien grade > 2) was independently associated with shorter overall survival (p=0.002).Conclusion. Nomograms outperform conventional staging sytem. Preoperative prognostic estimation is feasible and reliable using imaging. Identifying new prognostic biomarkers would help refining preoperative prognostic estimation.

Le cholangiocarcinome (CC) est un cancer des voies biliaires qui représente environ 15% des cancers primitifs du foie,mais de pronostic redoutable en raison d'un diagnostic tardif faute de marqueurs spécifiques.La présence d'auto anticorps (Ac) est rapportée comme marqueurs diagnostiques précoce de certains cancers.La présence d'auto-Ac dans le CC n'a pas été signalée, et aucun biomarqueur immunologique de cette maladie n'a été identifié. L'objectif de notre étude était d'identifier des auto-Ac potentiellement utilisables comme biomarqueur de CC, par analyse sérologique du protéome. Des immunoblots ont été réalisés à partir de la séparation par électrophorèse 2D de protéines de lignées tumorales de CC, CCSW1 et CCLP1, de 5 pièces d'hépatectomie ac leur partie tumorale et non tumorale,ainsi que de foie normal de neuropathie amyloïde. Les sérums de 13 patients atteints de CC et un pool de 10 sujets sains ont été testés sur ces immunoblot.La comparaison informatique des profils des protéines immunomarquées par les sérums des patients comparés aux profils des contrôles a permis de définir des spots immunoréactifs d'intérêt.Ces spots d'intérêt marqués par plus d'1/3 de sérums ont été ensuite identifiés par spectrométrie de masse de type Orbitrap®.Ainsi, nous avons identifié 10 protéines d'intérêt de CCSW1,11 protéines de CCLP1, 9 de la partie tumorale des foies, 14 des parties non-tumoral et 16 protéines appartenant au foie normal.Une extrême variabilité était observée selon les sérums pour un même Ag.Différents profils de réactivité étaient observés sur le même extrait antigénique en fonction des sérums testés, et pour un même sérum selon l'extrait antigénique utilisé.Il en résulte qu'un AC d'intérêt donné ne peut être considéré comme biomarqueur de CC que pour une faible proportion de patients.Pr cette raison, il faut envisager la combinaison de plusieurs anticorps pour avoir un test avec une sensibilité et une spécificité utilisable en clinique. Les protéines identifiées ont été classées par bio-informatique (logiciel Panther®) selon la description des gènes et de leurs produits selon une ontologie commune à toutes les espèces : fonctions moléculaires effectuées, processus biologiques assurés et localisation subcellulaire.Dans cette classification, 2 profils d'immunoréactivité se distinguent. La grande majorité des protéines cibles d'intérêt avec une fonction catalytique étaient présentes dans le foie normal ou dans les parties non tumorales des exérèses. L'autre profil était celui des protéines-cibles avec une fonction de protéines structurale et étaient présentes dans les lignées cellulaires tumorales ainsi que des parties tumorales des hépatectomies. Les protéines identifiées avec une activité catalytique étaient:l'alpha-énolase, le fructose biphosphate aldolase B et la glyceraldedyde 3-phosphate déshydrogénase, toutes troisréactives avec+de 50% des sérums de CC. Les protéines de structure identifiées par+de 60% des sérums de CC provenaient des lignées cellulaires et des tissus tumoraux.Il s'agissait de la vimentine, des prélamines A / C, de l'annexine A2 et de l'actine.Enfin, la sérotranferrine, protéines de transport, est reconnues par 100% des sérums CC en utilisant comme antigène des tissus tumoraux.Une sensibilité importante et une spécificité élevée sont des caractéristiques princeps d'un Ac pour pouvoir l'utiliser comme biomarqueur.La plupart des auto-Ac détectés dans cette étude avaient déjà été rapportées dans d'autres cancers et maladies auto-immunes. Pour trouver des protéines antigéniques spécifiques du CC, une combinaison de plusieurs semble nécessaire afin de permettre le développement de nouveaux biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic des CC.En conclusion, les biomarqueurs potentiels proposés dans cette étude doivent être testés en différentes combinaisons avec un panel en nb significatif de patients et en utilisant le substrat antigénique le plus approprié comme défini au cours de cette étude. / Cholangiocarcinoma (CC) is a rare but fatal primary liver cancer and accounts for an estimated 15% of primary liver cancer worldwide. It is associated with high mortality due to the lack of established diagnostic approaches. Autoantibodies can be used clinically as diagnostic markers for early cancer detection of cholangiocarcinoma. Studies, indicating the presence of auto-antibodies (AAbs) in CC have not been reported yet. No immunological biomarker, correlated to the disease, has been identified. The objective of our study was to identify cellular proteins from liver tissues (tumoral and non tumoral) and cholangiocarcinoma cell lines which could be recognized by antibody of CC patients. We used serological proteome analysis (SERPA) technique which leads us to suggest some molecules as potential biomarkers for the early diagnosis of CC. Proteins from different origins were 2DE separated: CCSW1 and CCLP1 tumor cell lines, five different samples of hepatectomies for CC with respect to their tumoral and non-tumoral counterparts and a normal liver from amyloid neuropathy. Sera from 13 CC patients and a pool of 10 healthy subjects were probed on immunoblot performed with these different separations. Comparison of immunoblotting patterns given by patient’s sera compared to patterns given by controls allowed to define immunoreactive spots of interest and those reacting with more than one-third of sera were identified by orbitrap type mass spectrometry. In this way we identified 10, 11, 9, 14 and 16 proteins from CCSW1, CCLP1, tumor part, non-tumor counterpart and normal liver antigenic extracts respectively. Different patterns of reactivity were observed according to sera on the same antigenic extract, and for a same serum, according to the antigenic extract, even though few common patterns were also observed. This widespread of reactivity is not unusual and reported earlier in several studies of this sort. It is indicated that a single AAb have an ability to identify only a small proportion of patient. For this reason, several antibodies in combination must be used to ensure sensitivity and specificity of assays used in the daily clinic.Identified proteins were then categorized by gene ontology analysis by which they fall into three main groups; biological process and molecular functions, protein class and molecular pathway and cellular component, according to the Panther classification. By Gene Ontology classification, two different patterns of targeted antigens were observed. The vast majority of targeted-proteins with catalytic activity were found in normal liver or non-tumor specimens. The second pattern was mainly represented by targeted proteins categorized as structural proteins extracted from CC cell lines and tumor tissues. Proteins identified with catalytic activity were: alpha-enolase, fructose biphosphate aldolase B and glyceraldedyde 3-phosphate dehydrogenase; which were reactive with more than 50% of CC sera. Proteins identified with structural activity, and detected with high rates by using cell lines and tumor tissues, were: vimentin, prelamine A/C, annexin A2 and actin; reactivity of each protein was higher than 62% with CC sera. Serotranferrin, identified under the category of transfer/carrier proteins, recognized by 100% of CC sera by using tumor tissues.High sensitivity and specificity is a prime requisite of AAbs that might be used as CC biomarkers for CC diagnosis. Most of the AAbs detected in this study had previously been reported in other cancers and auto-immune disorders. Hence it is essential to prove the specificity of antigenic proteins, a combination of various antigens therefore needs to be tested to enable the development of new biomarkers for the diagnosis and prognosis of CC.In conclusion, the proposed potential biomarkers need to be tested in a variety of different combinations with a panel of significant number of patients and using the most appropriate substrate defined during this study.

Le cholangiocarcinome (CC) est une tumeur maligne au pronostic péjoratif dont le traitement repose sur la résection chirurgicale. Il représente 3 % de l’ensemble des cancers digestifs et il est la deuxième tumeur primitive du foie, en fréquence, derrière le carcinome hépatocellulaire. L’âge moyen est de 70 ans avec une prédominance masculine. On distingue actuellement les cholangiocarcinomes intra et extra-hépatiques. La survie est inférieure à 5% à 5 ans tous stades confondues. 60 à 70 % sont des tumeurs de la convergence des canaux biliaires appelées également tumeurs de Klatskin.Le but de ce travail était de répondre aux interrogations persistantes concernant le cholangiocarcinome péri-hilaire (CCPH) en appliquant différentes méthodes statistiques sur différentes bases de données et revue de la littérature.Les trois axes principaux de ce travail s’articulent selon la temporalité de prise en charge, du diagnostic aux suites post-opératoires en passant par la mise en condition préopératoire.Le premier axe repose sur une base de données locale (registre de cancer digestif du Calvados). Les résultats montrent que le CCPH constitue seulement un tiers des cholangiocarcinomes dans la population générale, que son taux d’incidence est stable avec néanmoins une diminution d’incidence, bien que non-significative, chez les femmes ayant un CCPH et que le sexe féminin est un facteur pronostic négatif pour la survie à 5 ans. Le deuxième axe concernait la prise en charge préopératoire des patients, notamment l’optimisation préopératoire du foie restant par le drainage biliaire. Ce travail repose sur deux méta-analyses. Il a permis de mettre en évidence la supériorité de la voie radiologique sur la voie endoscopique concernant les complications liées à la procédure mais en revanche, l’absence de différence significative sur la morbi-mortalité post-résection hépatique, la survie à 5 ans, la survie sans récidive et le taux de dissémination liée à la procédure quand les procédures sont étudiées en intention de traiter. Nos résultats suggèrent qu’un mauvais choix de voie d’abord pour réaliser le drainage biliaire conduit à des échecs répétés qui influencent la récidive tumorale et donc la survie. Le troisième axe s’intéressait aux facteurs pronostiques de morbi-mortalité immédiates post-résection hépatique à partir d’une base de données Européenne (base de l’association Française de chirurgie). Les résultats montrent que la surface corporelle ≥ 1.82 m², l’hyperbilirubinémie > 50 µmol/l et la résection hépatique droite sont des facteurs prédictifs indépendants influençant la mortalité post-opératoire à 30 jours. / Cholangiocarcinoma (CC) is a malignant tumor with a poor prognosis. Its treatment is based on surgical resection. It accounts for 3% of all digestive cancers and is the second primary tumor of the liver, in frequency, after hepatocellular carcinoma. The average age is 70 years old with male predominance. At present intra and extrahepatic cholangiocarcinomas are distinguished. Survival rate is less than 5% at 5 years in all stages. 60 to 70% are tumors of the biliary convergence also called Klatskin tumors.The aim of this work was to answer persistent questions about peri-hilar cholangiocarcinoma (PHCC) by applying different statistical methods on different databases and review of the literature.The three main axes of this work are articulated according to the temporality of management, from the diagnosis to the postoperative follow-up, going through the preoperative setting.The first axis is based on a local database (registry of digestive cancer of Calvados). The results show that PHCC accounts for only one third of cholangiocarcinomas in the general population, that its incidence rate is stable with a decrease in incidence, although not significant, in women having PHCC and that female gender is a negative prognostic factor for 5-year survival. The second axis concerned the preoperative management of patients, including preoperative optimization of the remaining liver by biliary drainage. This work is based on two Meta-analyzes. It made it possible to highlight the superiority of the radiological way in the endoscopic way concerning the complications related to the procedure but on the other hand, the absence of significant difference on the morbi-mortality post hepatic resection, the survival at 5 years, the recurrence free survival and the rate of dissemination related to the procedure when the procedures are studied in intent to treat. Our results suggest that a poor choice of pathway for achieving biliary drainage leads to repeated failures that influence tumor recurrence and thus survival. The third axis was concerned with the prognostic factors of immediate morbidity and mortality after hepatic resection from a European database (base of the French association of surgery). The results show that body surface area ≥ 1.82 m², hyperbilirubinemia > 50 μmol / l and right hepatic resection are independent predictors influencing post-operative mortality at 30 days.