La manipulation des membranes des cellules en suspension ou dans des tissus au moyen d’impulsions électriques constitue un sujet de recherche majeur au cœur du bio-électromagnétisme. A ce jour les impulsions de quelques microsecondes voire millisecondes ont été principalement étudiées. Elles n’affectent que la membrane plasmique des cellules. Les impulsions nanosecondes de fort niveau de champ (de l’ordre de quelques MV/m) ouvrent la voie vers la manipulation des organelles intra-cellulaires. En outre, elles constituent un nouvel outil pour l’étude des mécanismes de la perméabilisation. Les travaux de cette thèse ont été principalement consacrés aux effets des impulsions de 10 ns sur la membrane plasmique. Des protocoles expérimentaux permettant d’appliquer de façon reproductible et contrôlée les impulsions sur des objets vivants ont été définis. Des moyens de mesure (D-dot et B-dot) adaptés aux hautes tensions et hautes fréquences ont été développés et mis en œuvre, permettant un contrôle en temps réel des impulsions délivrées.Différentes approches ont permis de mettre en évidence la perméabilisation des cellules par des impulsions de 10 ns. Ces techniques regroupent notamment le suivi de bio-impédance dans les tissus et l’internalisation de molécules cytotoxiques non perméantes dans des cellules en suspension et in vivo sur des tumeurs. Les expériences conduites ont permis de mettre en évidence la plus grande efficacité des basses fréquences de répétition dans la perméabilisation d’un tissu végétal (la pomme de terre). De plus l’influence de la conductivité du milieu extracellulaire sur le niveau de perméabilisation a été investiguée. Ces expériences ont permis de mettre en évidence l’importance de la dynamique d’établissement et de relaxation de la différence de potentiel transmembranaire dans l’efficacité de la perméabilisation.Enfin un microscope CARS (Coherent Anti-stokes Raman Scattering) plein-champ a été développé. Sa conception a été pensée en vue de l’étude des effets des impulsions ultra-courtes sur le vivant à l’échelle moléculaire. A ce jour il permet d’obtenir des images de cellules en CARS en 3 ns. / New devices for the controlled application of nanosecond electrical pulses and the detection of their effects on cells. New findings and hypotheses on the parameters controlling the electropermeabilization of biological cells.Abstract:Manipulation of the membranes of cells in suspension or in tissues with electrical pulses is a major research topic in bio-electromagnetism. Until recently the effects of pulses of a few microseconds or milliseconds have mainly been studied. Such pulses only affect the cell plasma membrane. Pulses of a few nanoseconds with high field strength (of the order of a few MV /m) might lead to intracellular organelles manipulation. In addition, they represent a new tool to study the mechanisms of permeabilization.This thesis was mainly devoted to the effects of pulses of 10 ns on the plasma membrane. Experimental protocols to apply controlled and reproducible pulses on living objects have been defined. Measurement means (D-dot and B-dot) adapted to high voltages and high frequencies have been developed and implemented thus allowing for accurate and real-time monitoring of the pulses applied on the biological samples.Different approaches have been used to highlight the permeabilization of biological cells by pulses of 10 ns. The techniques used include the monitoring of bio-impedance in tissues and the internalization of non-permeant cytotoxic molecules in cells in suspension and in vivo in tumors. The conducted experiments allowed to demonstrate the high efficiency of low repetition rates in permeabilizing potato tissue. The influence of the conductivity of the extracellular medium on the efficiency of the permeabilization was also investigated. These experiments highlighted the important role played by the dynamic of the establishment and relaxation of the transmembrane potential difference.Finally a wide-field CARS microscope (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) was developed. It has been designed to study the effects of ultra-short pulses on biological cells at the molecular level. It already enables to obtain images of cells in 3 ns.

Le processus de diffusion ``CARS'' (Coherent anti-Stokes Raman scattering) est une technique de spectroscopie qui donne accès à une information sur les modes vibrationnels intramoléculaires de l'échantillon étudié. L'introduction de ce processus de diffusion en microscopie a été pour la première fois proposée en 1982. Elle a été par la suite mise en œuvre dans une configuration colinéaire en 1999. La génération du signal en microscopie CARS a dès lors été étudiée sur des exemples simples. Dans ce mémoire de thèse, nous étendons l'analyse du signal en microscopie CARS en utilisant un formalisme purement vectoriel. En particulier, nous introduisons dans cette étude le coefficient de dépolarisation Raman du mode vibrationnel étudié et analysons son influence sur les diagrammes de rayonnement en champ lointain du signal CARS. Dans une seconde partie, nous nous intéressons à la génération du signal CARS au voisinage d'interfaces transverses et axiales. D'une part, nous présentons une méthode très simple pour obtenir des spectres CARS affranchis de tout fond non-résonant (c'est-à-dire similaires à des spectres Raman purs) au voisinage d'interfaces transverses, en utilisant une excitation conventionnelle. D'autre part, nous présentons une étude expérimentale et théorique de la modification du contraste d'une interface axiale en fonction du désaccord spectral des lasers d'excitation autour d'une résonance vibrationnelle. Ces effets sont intrinsèquement liés à la nature à la fois cohérente et résonante du processus de diffusion CARS. Enfin, dans le but de d'augmenter la sensibilité de la microscopie CARS, nous proposons de générer le signal CARS au voisinage d'une structure résonante. A cet effet, nous menons des études théorique et expérimentale de la génération du signal CARS dans une cavité Fabry-Perot. Nous démontrons des effets intéressants pour des applications en microscopie CARS, qui incluent une exaltation du signal, une augmentation de sa directivité ainsi qu'une symétrisation des signaux générés en avant et en arrière de l'objet émetteur. Cette dernière étude illustre l'influence de l'environnement électromagnétique sur la génération de lumière.

La manipulation des membranes des cellules en suspension ou dans des tissus au moyen d'impulsions électriques constitue un sujet de recherche majeur au cœur du bio-électromagnétisme. A ce jour les impulsions de quelques microsecondes voire millisecondes ont été principalement étudiées. Elles n'affectent que la membrane plasmique des cellules. Les impulsions nanosecondes de fort niveau de champ (de l'ordre de quelques MV/m) ouvrent la voie vers la manipulation des organelles intra-cellulaires. En outre, elles constituent un nouvel outil pour l'étude des mécanismes de la perméabilisation. Les travaux de cette thèse ont été principalement consacrés aux effets des impulsions de 10 ns sur la membrane plasmique. Des protocoles expérimentaux permettant d'appliquer de façon reproductible et contrôlée les impulsions sur des objets vivants ont été définis. Des moyens de mesure (D-dot et B-dot) adaptés aux hautes tensions et hautes fréquences ont été développés et mis en œuvre, permettant un contrôle en temps réel des impulsions délivrées.Différentes approches ont permis de mettre en évidence la perméabilisation des cellules par des impulsions de 10 ns. Ces techniques regroupent notamment le suivi de bio-impédance dans les tissus et l'internalisation de molécules cytotoxiques non perméantes dans des cellules en suspension et in vivo sur des tumeurs. Les expériences conduites ont permis de mettre en évidence la plus grande efficacité des basses fréquences de répétition dans la perméabilisation d'un tissu végétal (la pomme de terre). De plus l'influence de la conductivité du milieu extracellulaire sur le niveau de perméabilisation a été investiguée. Ces expériences ont permis de mettre en évidence l'importance de la dynamique d'établissement et de relaxation de la différence de potentiel transmembranaire dans l'efficacité de la perméabilisation.Enfin un microscope CARS (Coherent Anti-stokes Raman Scattering) plein-champ a été développé. Sa conception a été pensée en vue de l'étude des effets des impulsions ultra-courtes sur le vivant à l'échelle moléculaire. A ce jour il permet d'obtenir des images de cellules en CARS en 3 ns.