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An electron microscope study of the conoid and microtubule system of Toxoplasma gondii

Buesching, William John January 1974 (has links)
This document only includes an excerpt of the corresponding thesis or dissertation. To request a digital scan of the full text, please contact the Ruth Lilly Medical Library's Interlibrary Loan Department (rlmlill@iu.edu).
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Alterations in lymphocyte signalling produced by exposure to mercury

Yole, Margaret Jane 03 July 2007
The effects of 1 min 4 hr exposures to mercuric chloride (HgCl2), methyl mercuric chloride (CH3HgCl), p-chloromercuribenzoate (p-CMB) and ethylmercurithiosalicylate (TMS) on cell viability and kinetics of cell death, microtubules, F-actin, CD3 receptor expression, protein tyrosine phosphorylation (PTyr-P), intracellular calcium [Ca2+]i and responses to polarized signals in YAC-1 lymphoma cells were investigated. We hypothesized that immunotoxic effects of HgCl2 (Hg2+) are initiated by global receptor triggering, accompanied by increased protein tyrosine phosphorylation (PTyr-P) and down-regulation of the T-cell receptor (TCR). As a polychloride anion with poor lipid solubility, inorganic Hg2+ may produce effects at the outer cell membrane before significant intracellular accumulation, loss of microtubule integrity (a sensitive target) and activation of cell death through apoptotic pathways. The organomercurial compound p-CMB is likewise thought to penetrate membranes slowly as a result of ionization. In contrast, the highly lipid-soluble organomercurial compounds CH3HgCl and TMS were expected to reduce responses to polarized stimuli only in conjunction with and not prior to loss of microtubule integrity and the onset of necrotic cell death. <p>Two general patterns of effects were observed. In HgCl2-treated YAC-1 cells, inhibition of responses to polarized stimuli preceded loss of microtubules and onset of cell death. Effects on polarized stimuli were preceded by a transient Ca2+ signal; however, this Ca2+ signal appeared abortive, accompanied by a paradoxic decrease in PTyr-P and partial down-regulation of CD3 receptors. Responses to polarised stimuli were inhibited prior to extensive loss of microtubule staining, indicating effects preceded cytosolic Hg2+ accumulation. HgCl2 exposure was followed rapidly by necrotic cell death. <p>Similarly, p-CMB-treated YAC-1 cells failed to respond to polarized stimuli before effects on microtubules or loss of viability, and proceeded rapidly to late apoptosis; however, a transient Ca2+ signal and progressive loss of F-actin preceded effects in all other assays and may account for loss of polarized responses. <p>In CH3HgCl- and TMS-treated YAC-1 cells, CD3 receptor expression, [Ca2+] and PTyr-P were increased immediately, along with loss of microtubules. These reductions preceded inhibition of polarized signaling responses and seemed to indicate a general loss of cellular homeostasis not seen in HgCl2- and p-CMB-treated cells; loss of homeostasis did not necessarily produce simultaneous loss of viability, as TMS-treated cells remained viable for 30 min while CH3HgCl-treated cells became apoptotic within 1 min. Nonetheless, the YAC-1 cells proceeded to cell death more slowly, remaining early apoptotic after 4 hr, when almost all HgCl2- and p-CMB-treated cells were necrotic. These findings indicate the two groups of mercury compounds may alter responses to polarized stimuli and induce cell death by distinct pathways, one involving an apparently abortive signal and the other mediated by much more profound disruption of cellular homeostasis. Within the larger patterns there are further differences between the effects produced by each Hg compound, likely reflecting the combined influence of pharmacokinetic and dynamic factors governing access to and interactions with different cellular targets leading to cell death. These distinct targets may in turn be reflected in the different immune effects produced by these compounds <i>in vivo</i>.
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Alterations in lymphocyte signalling produced by exposure to mercury

Yole, Margaret Jane 03 July 2007 (has links)
The effects of 1 min 4 hr exposures to mercuric chloride (HgCl2), methyl mercuric chloride (CH3HgCl), p-chloromercuribenzoate (p-CMB) and ethylmercurithiosalicylate (TMS) on cell viability and kinetics of cell death, microtubules, F-actin, CD3 receptor expression, protein tyrosine phosphorylation (PTyr-P), intracellular calcium [Ca2+]i and responses to polarized signals in YAC-1 lymphoma cells were investigated. We hypothesized that immunotoxic effects of HgCl2 (Hg2+) are initiated by global receptor triggering, accompanied by increased protein tyrosine phosphorylation (PTyr-P) and down-regulation of the T-cell receptor (TCR). As a polychloride anion with poor lipid solubility, inorganic Hg2+ may produce effects at the outer cell membrane before significant intracellular accumulation, loss of microtubule integrity (a sensitive target) and activation of cell death through apoptotic pathways. The organomercurial compound p-CMB is likewise thought to penetrate membranes slowly as a result of ionization. In contrast, the highly lipid-soluble organomercurial compounds CH3HgCl and TMS were expected to reduce responses to polarized stimuli only in conjunction with and not prior to loss of microtubule integrity and the onset of necrotic cell death. <p>Two general patterns of effects were observed. In HgCl2-treated YAC-1 cells, inhibition of responses to polarized stimuli preceded loss of microtubules and onset of cell death. Effects on polarized stimuli were preceded by a transient Ca2+ signal; however, this Ca2+ signal appeared abortive, accompanied by a paradoxic decrease in PTyr-P and partial down-regulation of CD3 receptors. Responses to polarised stimuli were inhibited prior to extensive loss of microtubule staining, indicating effects preceded cytosolic Hg2+ accumulation. HgCl2 exposure was followed rapidly by necrotic cell death. <p>Similarly, p-CMB-treated YAC-1 cells failed to respond to polarized stimuli before effects on microtubules or loss of viability, and proceeded rapidly to late apoptosis; however, a transient Ca2+ signal and progressive loss of F-actin preceded effects in all other assays and may account for loss of polarized responses. <p>In CH3HgCl- and TMS-treated YAC-1 cells, CD3 receptor expression, [Ca2+] and PTyr-P were increased immediately, along with loss of microtubules. These reductions preceded inhibition of polarized signaling responses and seemed to indicate a general loss of cellular homeostasis not seen in HgCl2- and p-CMB-treated cells; loss of homeostasis did not necessarily produce simultaneous loss of viability, as TMS-treated cells remained viable for 30 min while CH3HgCl-treated cells became apoptotic within 1 min. Nonetheless, the YAC-1 cells proceeded to cell death more slowly, remaining early apoptotic after 4 hr, when almost all HgCl2- and p-CMB-treated cells were necrotic. These findings indicate the two groups of mercury compounds may alter responses to polarized stimuli and induce cell death by distinct pathways, one involving an apparently abortive signal and the other mediated by much more profound disruption of cellular homeostasis. Within the larger patterns there are further differences between the effects produced by each Hg compound, likely reflecting the combined influence of pharmacokinetic and dynamic factors governing access to and interactions with different cellular targets leading to cell death. These distinct targets may in turn be reflected in the different immune effects produced by these compounds <i>in vivo</i>.
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Reversible Immobilisierung von Biopolymeren unter Verwendung synthetischer Polymersysteme

Sekulla, Hagen 31 January 2022 (has links)
Die rasant fortschreitende Digitalisierung in allen Bereichen des täglichen Lebens erzeugt einen immensen Bedarf an Mikrochips. Um diese Mikrochips zu erzeugen, durchlaufen Wafer eine Vielzahl an ressourcenaufwändigen Prozessschritten. In dieser Arbeit werden zwei Ansätze der reversiblen Immobilisierung von Biopolymeren verfolgt, welche als Grundlage für eine alternative Herstellung von Mikrochips fungieren könnten. Zum einen sollte die reversible Immobilisierung von Polyplexen auf Basis von 6HB DNA-Origami und kationischen Polymethacrylaten bzw. Poly(2-oxazolin)en auf strukturierten PDMAEMA-Bürsten nach Nawroth et al.[1],[2] realisiert werden. Zum anderen war die reversible Immobilisierung von Mikrotubuli nach Ionov et al.[3] unter Verwendung eines grafting-from Systems Ziel dieser Arbeit. Für die Immobilisierung von Polyplexen auf Polymerbürsten wurden die Polymere so gestaltet, dass sie mehrere Funktionen erfüllen können. Die Copolymere verfügten über einen kationischen Bereich mit 20 Wiederholeinheiten, welcher zur Anbindung an die 6HB diente, einen hydrophilen Spacer sowie mehrere Funktionalisierungsstellen. Das zuerst untersuchte methacrylische System auf Basis von HEMA stellte sich für den hier vorgesehenen Verwendungszweck als ungeeignet heraus. Für das Poly(2-oxazolin)-System wurden die nach Cesana et al.[4] und Hartlieb et al.[5] synthetisierten aminfunktionalisierten Monomere AmProOx, AmBuOx, AmPentOx und AmDecOx, sowie das nach He et al.[6] synthetisierte MAMeOx verwendet. Die Synthese der verwendeten Monomere konnte optimiert bzw. AmProOx und AmDecOx im Zuge dieser Arbeit erstmalig synthetisiert werden. AmProOx, AmBuOx und AmPentOx konnten mittels LCROP erstmalig in dieser Arbeit mit Benzyltosylat direkt initiiert und homopolymerisiert werden. Diese AmOx-Derivate erlauben als Blockcopolymer mit MeOx eine effektive und gut kontrollierbare Polyplexbildung mit 6HB. Dies wurde mittels GEP und AFM verifiziert. Es zeigte sich, dass MAMeOx ungeeignet war, da es keinen Polyplex mit 6HB bildete. Als mögliche Ursachen sind der zu geringe Abstand zwischen den Aminen in der Seitenkette sowie der zu geringe Abstand zwischen dem Amin in der Seitenkette und dem Rückgrat zu nennen. Die AmOx konnten in einem Triblockcopolymer zusammen mit MeOx bzw. EtOx und PynOx copolymerisiert werden. Über den PynOx-Block ist eine Funktionalisierung mittels Click Chemie möglich.[7] Es konnte gezeigt werden, dass die Polyplexe in ihrer Peripherie vollumfänglich durch die Polymere zusätzlich funktionalisiert werden können. So wurden Fluoreszenzfarbstoffe ebenso wie CRP Initiatoren eingeführt. Die angeschlossene Pfropfungspolymerisation auf Basis der CuCRP zeigte, im Vergleich zur Literatur,8 einen bis zum Zeitpunkt der Erstellung dieser Arbeit unbekannten Zuwachs an Polymerhülle von bis zu 70 nm (240%) innerhalb von 15 min. Eine Immobilisierung der 6HB-POx Polyplexe nach Nawroth et al.[1],[2] auf PDMAEMA-Bürsten zeigte sich als nicht erfolgreich. Es konnte auf den nanostrukturierten PDMAEMA-Bürsten keine Abscheidung der Polyplexe beobachtet werden. In Zukunft könnten die entwickelten Polyplexe durch eine Funktionalisierung der PynOx Einheiten mit Metallisierungskeimen als Nanodrahttemplate verwendet werden. Außerdem ist die Nutzung der POx-DNA-Origami- Polyplexe als formstabile Wirkstofftransportsysteme denkbar, ebenso wie die Verwendung der kationischen POx als Ersatz für Polyethylenimin (PEI)[9]–[11] in der Gentherapie. Für die Immobilisierung von Mikrotubuli Gleit-Assays mit gepfropften PNIPAM-Bürsten auf Grundlage der Publikation von Ionov et al.[3] wurde erstmalig die SI-CuCRP mit PNIPAM auf Gold untersucht. Hierfür wurde zuerst eine geeignete Initiator-SAM ermittelt, wobei die Wahl auf BiB UD-SH fiel, welche eine Schichtdicke von ca. 1,2 nm bei einem Wasserkontaktwinkel von ca. 72° aufwies. Um die ideale PNIPAM Schichtdicke für die Immobilisierung zu ermitteln, wurden mehrere Gradienten mit unterschiedlichen Schichtdicken hergestellt. Als ideale Schichtdicke erwies sich eine Höhe von 10 bis 20 nm PNIPAM im kollabierten Zustand. Die generierten PNIPAM Schichten auf Gold zeigten in den Gleit-Assays ein effektives Verhalten bezüglich der Immobilisierung der Mikrotubuli. Dies zeigte sich dadurch, dass im gequollenen Zustand unterhalb der LCST der PNIPAM-Bürsten die Mikrotubuli von der Oberfläche gelöst wurden. Oberhalb der LCST konnten sich die Mikrotubuli frei auf der Oberfläche bewegen. Gleiches konnte auf im Anschluss präparierten UV-strukturierten Proben nachvollzogen werden. Die Mikrotubuli waren nicht in der Lage, sich unterhalb der LCST auf den PNIPAM-Strukturen zu bewegen, jedoch auf Bereichen ohne PNIPAM. Oberhalb der LCST war es den Mikrotubuli wieder möglich, sich frei zu bewegen. Das entwickelte System für die reversible Immobilisierung von Mikrotubuli könnte im nächsten Schritt auf die von Nicolau et al.[12] entwickelten Arrays übertragen werden. [1] Nawroth, J. F.; Neisser, C.; Erbe, A.; Jordan, R. Nanoscale 2016, 8 (14), 7513–7522. [2] Nawroth, J. F. Synthese nanostrukturierter Polymerbürsten zur reversiblen Immobilisierung von DNA Origami, Dissertation, TU Dresden, 2017. [3] Ionov, L.; Stamm, M.; Diez, S. Nano Lett. 2006, 6 (9), 1982–1987. [4] Cesana, S.; Auernheimer, J.; Jordan, R.; Kessler, H.; Nuyken, O. Macromol. Chem. Phys. 2006, 207 (2), 183–192. [5] Hartlieb, M.; Pretzel, D.; Kempe, K.; Fritzsche, C.; Paulus, R. M.; Gottschaldt, M.; Schubert, U. S. Soft Matter 2013, 9 (18), 4693–4704. [6] He, Z.; Miao, L.; Jordan, R.; S-Manickam, D.; Luxenhofer, R.; Kabanov, A. V. Macromol. Biosci. 2015, 15 (7), 1004–1020. [7] Luxenhofer, R.; Jordan, R. Macromolecules 2006, 39 (10), 3509–3516. [8] Tokura, Y.; Jiang, Y.; Welle, A.; Stenzel, M. H.; Krzemien, K. M.; Michaelis, J.; Berger, R.; Barner-Kowollik, C.; Wu, Y.; Weil, T. Angew. Chemie - Int. Ed. 2016, 55 (19), 5692–5697. 9Boussif, O.; LezoualC’H, F.; Zanta, M. A.; Mergny, M. D.; Scherman, D.; Demeneix, B.; Behr, J. P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995, 92 (16), 7297–7301. [10] Horbinski, C.; Stachowiak, M. K.; Higgins, D.; Finnegan, S. G. BMC Neurosci. 2001, 2. [11] Dodds, E.; Piper, T. A.; Murphy, S. J.; Dickson, G. J. Neurochem. 1999, 72 (5), 2105–2112. [12] Nicolau, D. V; Lard, M.; Korten, T.; van Delft, F. C. M. J. M.; Persson, M.; Bengtsson, E.; Månsson, A.; Diez, S.; Linke, H.; Nicolau, D. V. Proc. Natl. Acad. Sci. 2016, 113 (10), 2591–2596.:Inhaltsverzeichnis Danksagung I Abkürzungsverzeichnis III 1. Einleitung 1 2. Grundlagen 3 2.1. DNA-Origami 3 2.2. Mikrotubuli als Nanoroboter 9 2.3. Poly(2-oxazolin)e 14 2.3.1. 2-Substituierte 2-Oxazoline 14 2.3.2. Lebende kationische ringöffnende Polymerisation 15 2.4. Oberflächenmodifikation mit Polymerbürsten 18 2.4.1. Selbstorganisierende Monoschichten 18 2.4.2. Polymerbürsten 19 2.4.3. Pfropfungspolymerisatonsarten 22 2.4.5. Thermoresponsive Polymerbürsten 27 2.5. Rasterkraftmikroskopie 29 3. Motivation 31 4. Ergebnisse und Diskussion 33 4.1. Kationische Bürsten auf Polymethacrylatbasis 33 4.1.1. Synthese der kationischen Copolymere 34 4.1.2. Funktionalisierung mit BiBB 38 4.1.3. Pfropfungspolymerisation 40 4.1.4. Polyplexbildung mit kationischen Polymethacrylaten 43 4.2. Synthese von 2-Oxazolinen mit Aminofunktionalität 45 4.3. Kationische Poly(2-oxazolin)e zur DNA-Origami-Komplexierung 50 4.3.1. Kinetik der Homopolymerisation der AmOx-Monomere 50 4.3.2. Erprobung der Click-Reaktion und der Pfropfung 53 4.3.3. Poly(2-oxazolin)e mit Aminfunktionalität zur Stabilisierung von DNA-Origami 59 4.3.4. Poly(2-oxazolin)e mit BiB-Typ Endfunktionalisierung 65 4.3.5. Kationische Poly(2-oxazolin)e für die Funktionalisierung von Polyplexen 69 4.3.6. Pfropfungspolymerisation auf immobilisierten Polyplexen 72 4.3.7. Pfropfungspolymerisation auf DNA-Origami in Lösung 74 4.3.8. Polyplex-gestütztes, gerichtetes Assemblieren von DNA-Origami 77 4.4. Reversible Immobilisierung von Mikrotubuli durch Polymerbürsten 81 4.4.1. Oberflächenmodifizierung 81 4.4.2. Mikrotubuli-Gleit-Assays auf PNIPAM-Gradienten 84 4.4.3. Mikrotubuli-Gleit-Assays auf strukturierten PNIPAM-Bürsten 89 5. Zusammenfassung und Ausblick 92 6. Experimentalteil 96 6.1. Geräte 96 6.2. Verbrauchsgüter 99 6.2.1. Chemikalien 99 6.2.2. 6-Helixbündel 6HB 99 6.2.3. Wafer 99 6.3. Synthese der Initiatoren 100 6.3.1. Benzyltosylat BnOTs 100 7.3.2. 2-Azidoethyl-2-bromoisobutyrat 100 6.4. Synthese der Monomere 103 6.4.1. Allgemeine Synthesevorschrift der AmOx Monomere 103 6.4.2. 2-(N-Methyl)aminomethyl-2-oxazolin MAMeOx 106 6.5. Polymersynthese 108 6.5.2. Homopolymerisation der AmOx Monomere 113 6.5.3. P(MeOx-grad-PynOx) P1 115 6.5.4. P(MAMeOx-co-MeOx-grad-PynOx) P2Boc 115 6.5.5. Synthese der P(AmOx-co-MeOx) 116 6.5.6. Allgemeine Synthesevorschrift der LCROP mit BiB-OH Terminierung 118 6.5.7. Allgemeine Synthesevorschrift der CuCRP mit einem POx-Makroinitiator 122 6.5.8. P(AmProOx-co-MeOx-grad-PynOx) P6Boc 126 6.5.10. P(AmPentOx-co-EtOx-grad-PynOx) P8Boc 128 6.6. Polymeranaloge Funktionalisierung 129 6.6.1. Allgemeine Bedingung der Funktionalisierung der HEMA-Gruppen mit BiBB 129 6.6.2. Pfropfungspolymerisation an PMETAC10-BiB mit HEMA 132 6.6.3. Allgemeine Vorschrift der Abspaltung der Boc-Schutzgruppe 133 6.6.4. Allgemeine Bedingungen der Huisgen 1,3-dipolaren kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition 137 6.6.5. Pfropfungspolymerisation an P1-BiB 141 6.6.6. Pfropfungspolymerisation an P2Boc-BiB 142 6.7. DNA-Origami-Polyplexe 143 6.7.1. Polyplexbildung 143 6.7.2. Präparation für AFM-Messung 143 6.7.3. Oberflächenbasierte Pfropfungspolymerisation 144 6.7.4. Lösungsbasierte Pfropfungspolymerisation 144 6.7.5. Polyplexabscheidung auf nanostrukturierten PDMAEMA Bürsten 144 6.8. Oberflächenmodifikation 145 6.8.1. Präparation der SiO2-Wafer mit PF-SAM 145 6.8.2. Selbst-initiierende Photopfropfung und Photopolymerisation SIPGP 145 6.8.3. Präparation Au-Wafer mit Thiol-SAM 145 6.8.4. UV-Lithografie 146 6.8.5. SI-CuCRP 146 6.9. Gleit-Assays 147 7. Quellen 149

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