Abstract Finding the genetic causes leading to phenotypes of mitochondrial diseases is challenging because of heterogeneity of the disorders and variety of the underlying biochemical defects. In adults, many of the manifestations of mitochondrial diseases cannot be distinguished from the neurodegenerative processes associated with old age. A single mutation or mutations within the same gene can result in a broad range of disorders. Conversely, clinically similar, monogenic disorders may be caused by genes which are governing entirely different cellular pathways. This study investigated the genetic etiology underlying certain symptoms which are characteristic for mitochondrial syndromes, or mimics of the mitochondrial ones. In the first project, we presented the contribution of genetic variation in the Wolfram Syndrome 1 gene to the risk of diabetes mellitus and sensorineural hearing impairment. We also estimated the frequency of a rare pathogenic variation in WFS1. The second project detected a link between the complex phenotype of age-related hearing impairment and the WFS1 gene. Monogenic forms of ARHI are extremely rare and we succeeded in recognizing one Mendelian form of the trait. The third project confirmed the Mitofusin 2 gene causality in the outlier phenotype of Charcot-Marie-Tooth disease. The fourth project described a Finnish family with two affected siblings with adult-onset ataxia, diabetes mellitus, and hypergonadotropic hypogonadism. The found novel mutation in mtDNA, m.8561C>G, was located in the overlapping region of two mitochondrial genes and resulted in an impaired assembly and dysfunctional energy production of mitochondrial ATP synthase. This thesis expands our knowledge about complex neurological phenotypes and identifies not only some causative genes but also outlier phenotypes, which should be noted in clinical practice. / Tiivistelmä Perintötekijät mitokondriaalisten ja niiden kaltaisten tautien taustalla ovat vaikeasti tunnistettavissa. Tautien kirjo on valtava, ja niihin johtavat biokemialliset syyt ovat moninaisia. Aikuisten mitokondriotaudit voivat jäädä diagnosoimatta, koska oireet voivat peittyä vanhenemiseen liittyviin neurodegeneratiivisiin prosesseihin. Sama mutaatio tai eri mutaatiot samassa geenissä voivat johtaa kliinisesti täysin erilaisiin ilmiasuihin. Toisaalta, kliinisesti samankaltaiset taudit voivat olla geneettisesti ja solubiologiallisesti kirjavia. Tässä tutkimuksessa selvitetään geneettistä etiologiaa tiettyjen mitokondriaalisille ja niiden kaltaisille taudeille tyypillisten oireiden taustalla. Ensimmäisessä osajulkaisussa tunnistetaan geneettisiä riskivariantteja Wolfram Syndrome 1 -geenissä diabeteksen ja kuulonaleneman taustalta. Lisäksi tutkimuksessa estimoidaan harvinaisen tautia aiheuttavan variaation määrää kyseisessä geenissä. Toinen projekti esittelee suomalaisen perheen, jossa myöhään alkaneen kuulonaleneman, ikäkuulon, geneettinen syy paljastuu WFS1-geenistä, jota ei aiemmin ole liitetty kyseiseen ilmiasuun. Yhden geenin aiheuttamat ikäkuulotapaukset ovat todella harvinaisia, koska ikäkuulo on monimutkainen kokonaisuus, johon ympäristötekijöillä on suuri vaikutus. Kolmas osajulkaisu kuvaa potilastapauksia, joiden ilmiasu on epätyypillinen Charcot-Marie-Toothin neuropatia. Tautigeeni on tunnettu Mitofusin 2, mutta sen aiheuttaman taudinkuvat ovat yleensä vakavampia ja varhain alkaneita. Viimeinen osajulkaisu kuvaa suomalaisen perheen, jonka kahden oireisen sisaruksen taustalta löytyy mitokondriaalisen DNA:n uusi mutaatio, joka sijaitsee kahden geenin alueella muuttaen niiden molempien lopputuotetta. Mutaation, m.8561C>G, osoitetaan vaikuttavan mitokondriaalisen ATP-syntaasin rakentumiseen ja energiatuotantoon. Tämä väitöskirja laajentaa geneettistä tietoisuutta neurologisten tautien taustalla ja esittelee uusia geneettisiä syitä ja ilmiasuja, jotka tulisi huomioida kliinisessä työssä terveydenhuollossa.

Abstract Mitochondrial DNA depletion and deletions are related to mutations in the nuclear genes responsible for replication and maintenance of mitochondrial DNA (mtDNA). The POLG1 gene encodes the enzyme responsible for replication of mtDNA. A particular feature of the POLG1 mutations is an increased risk of acute liver failure (ALF) upon exposure to sodium valproate (VPA), but the pathomechanism is not resolved. The present work studies the molecular genetic aetiology and clinical phenotypes associated with mtDNA depletion and deletion. Another objective was an investigation of clinical phenotypes in POLG1 mutations and disentangling the pathomechanism of VPA-induced ALF in POLG1 mutations. Mitochondrial toxicity of VPA was examined using HepG2 cells as an experimental in vitro model. In this work, mtDNA depletion was associated with severe neonatal-onset encephalopathy. Furthermore, mtDNA depletion was found in muscle dystrophy as a secondary finding to muscle degradation. Multiple mitochondrial DNA deletions were found in two patients with Kearns-Sayre syndrome suggesting a genetic origin of the disease. POLG1 p.R722H mutation has been previously reported as a neutral polymorphism, but we found evidence suggesting that POLG1 p.R722H could be a pathogenic mutation in a homozygous or compound heterozygous state. We identified retrospectively five patients, who required liver transplant after VPA-induced ALF. All five patients harboured POLG1 mutations supporting the evidence of POLG1 mutations as a risk factor for VPA-induced ALF. Previously, patients with POLG1 mutations have been considered unsuitable for liver transplantation, but we found that homozygous POLG1 mutations and adolescent or adult-onset disease predicted a good outcome following liver transplantation. In vitro studies on HepG2 cells showed that VPA disturbs mitochondrial respiration. Our results expand the phenotypes and molecular genetic features in mitochondrial DNA depletion and deletion syndromes. We found evidence that POLG1 mutations are not a contraindication for liver transplantation; rather, mutation status and age at onset affect survival. This finding should be taken in consideration in the treatment of VPA-induced ALF. Furthermore, our findings indicate that sodium valproate is toxic to mitochondria and should be avoided in patients with mitochondrial disease. / Tiivistelmä Mitokondrion DNA:n (mtDNA) kahdentumisesta ja ylläpidosta vastaavien tuman geenien mutaatiot voivat johtaa mtDNA:n määrän vähenemiseen (depleetioon) ja katkoksiin (deleetioihin). MtDNA:n kahdentumisesta vastaavaa entsyymiä koodaa tuman POLG1-geeni. POLG1-mutaatioihin liittyy kohonnut riski sairastua natriumvalproaatin (VPA) aiheuttamaan akuuttiin maksavaurioon. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mtDNA:n depleetion ja deleetioiden molekyyligeneettistä etiologiaa ja kliinisiä taudinkuvia. Tutkimuksessa selvitettiin myös POLG1-mutaatioihin liittyviä taudinkuvia ja POLG1-mutaatioihin liittyvän akuutin maksavaurion patomekanismia. VPA:n vaikutusta mitokondrioiden toimintaan tutkittiin in vitro HepG2-solumallissa. Tutkimuksessa todettiin mtDNA:n depleetion liittyvän vaikeaan varhain alkavaan aivosairauteen. Depleetio todettiin myös sekundaarisena merosiini-negatiivisessa lihasdystrofiassa. Kahdella Kearns-Sayren syndroomaa sairastavalla potilaalla todettiin multippelit mtDNA:n deleetiot, mikä viittaa syndrooman geneettisen alkuperään. POLG1 p.R722H-mutaatiota on aiemmin pidetty neutraalina polymorfiana, mutta tutkimuksen tulokset viittasivat siihen, että homotsygoottisena tai yhdistelmäheterotsygoottisena mutaatio on tautia aiheuttava. Helsingin yliopistollisen sairaalan elinsiirtorekisteristä tunnistettiin retrospektiivisesti viisi potilasta, jotka olivat saaneet maksansiirteen VPA:n aiheuttaman maksavaurion vuoksi. Kaikilla viidellä potilaalla todettiin POLG1-geenin mutaatio, mikä vahvistaa käsitystä geenin yhteydestä VPA:n aiheuttamaan maksavaurioon. POLG1-mutaatioita on pidetty vasta-aiheena maksansiirrolle, mutta tutkimuksessa todettiin homotsygoottisena esiintyvän POLG1-mutaation ja nuoruusiällä tai varhaisella aikuisiällä alkaneen taudin liittyvän parempaan maksansiirron jälkeiseen ennusteeseen. HepG2-solumallilla tehdyt tutkimukset osoittivat VPA:n haittaavan mitokondrioiden solyhengitystä. Tutkimuksen tulokset tuovat lisätietoa mtDNA:n depleetioon ja deleetioihin liittyvistä taudinkuvista ja molekyyligeneettisestä taustasta. POLG1-mutaatiot eivät ole ehdoton vasta-aihe maksansiirrolle; potilaan geneettinen status ja ikä taudin alkamishetkellä vaikuttavat ennusteeseen, mikä tulisi huomioida potilaiden hoidossa. Tulokset myös osoittivat VPA:n olevan mitokondriotoksinen lääke, jonka käyttöä tulisi välttää mitokondriotautipotilaiden hoidossa.

Abstract NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) is one of the largest enzymes in mammals. Seven (ND1-ND6 and ND4L) of its 45 subunits are encoded in mitochondrial DNA, mutations of which are usually behind mitochondrial diseases such as Leber hereditary optic neuropathy (LHON) and MELAS-syndrome. The rest of the genes are located in the nucleus. Bacterial homologs of complex I (NDH-1) consist of only 13–14 subunits, comprising the catalytic core of the enzyme. These complexes are simpler but perform a similar function. Escherichia coli NDH-1 was employed here to generate amino acid replacements at conserved sites in NuoH, NuoJ and NuoK, counterparts of ND1, ND6 and ND4L, to elucidate their role in complex I. Consequences of homologous amino acid substitutions brought about by ND1-affecting LHON/MELAS-overlap syndrome-associated m.3376G>A and m.3865A>G mutations and the ND6-affecting m.14498T>C substitution associated with LHON were also studied to validate their pathogenicity. Effects of the site-directed mutations were evaluated on the basis of enzyme activity, inhibitor sensitivity and growth phenotype. Highly conserved glutamate-residues 36 and 72 within transmembrane helices of NuoK in positions similar to proton translocating transmembrane proteins were found essential for electron transfer to ubiquinone and growth on medium necessitating normal proton transfer by NDH-1. NuoH and NuoJ replacements at sites corresponding to targets of m.3376G>A and m.14498T>C decreased ubiquinone reductase activity and altered the ubiquinone binding site, while the counterpart of m.3865A>G was without a major effect. Other NuoH and NuoJ mutations studied also affected the interactions of ubiquinone and inhibitors with NDH-1. The results corroborate the pathogenicity of the m.14498T>C and m.3376G>A mutations and demonstrate that the overlap syndrome-associated modification affects complex I in a pattern which appears to combine the effects of separate mutations responsible for LHON and MELAS. Change in ubiquinone binding affinity is a likely pathomechanism of all LHON-associated mutations. Effects of the NuoH, NuoJ and NuoK subunit substitutions also indicate that ND1 and ND6 subunits contribute to the ubiquinone-interacting site of complex I and the site is located in the vicinity of the membrane surface, while ND4L is likely involved in proton pumping activity of the enzyme. / Tiivistelmä 45 alayksiköstä muodostuva NADH-ubikinoni oksidoreduktaasi (kompleksi I) on nisäkkäiden suurimpia entsyymejä. Sen mitokondriaalisessa DNA:ssa koodattujen alayksiköiden ND1-ND6 ja ND4L geeneihin liittyvät mutaatiot ovat yleisiä mitokondriosairauksien, kuten Leberin perinnöllisen näköhermoatrofian (LHON) ja MELAS-oireyhtymän, syitä. Bakteerien vastaava entsyymi (NDH-1) koostuu vain 13–14 alayksiköstä. Tästä huolimatta sen katalysoima reaktio on samankaltainen kuin kompleksi I:n. NDH-1:n katsotaankin edustavan entsyymin katalyyttistä ydintä. Tässä työssä tutkittiin ND1, ND6 ja ND4L alayksiköiden tehtävää kompleksi I:ssä niiden Escherichia coli bakteerissa olevien vastineiden (NuoH, NuoJ ja NuoK) kohdennetun mutageneesin avulla. Samaa lähestymistapaa käytettiin LHON/MELAS-oireyhtymässä todettujen ND1 alayksikön mutaatioiden, m.3376G>A ja m.3865A>G, ja LHON:ssa havaitun ND6:n m.14498T>C mutaation aiheuttamien aminohappomuutosten seurauksien selvittämiseen. Tehtyjen mutaatioiden vaikutuksia arvioitiin entsyymiaktiivisuus-mittauksin ja kasvukokein. NuoK:n solukalvon läpäisevissä rakenteissa olevien kahden glutamaatti-aminohappotähteen sijainti muistuttaa protoneita kalvon läpi kuljettavissa proteiineissa todettua. NuoK:n glutamaattien havaittiinkin olevan tärkeitä elektronien ja protonien kuljetukselle kompleksi I:ssä. m.3376G>A ja m.14498T>C mutaatioiden aiheuttamien aminohappomuutosten vastineet NDH-1:ssä alensivat NDH-1:n elektroninsiirtoaktiivisuutta ja heikensivät ubikinonin sitoutumista, kun taas m.3865A>G mutaatiolla ei ollut vaikutusta. Muut NuoH ja NuoJ alayksiköihin tehdyt aminohappovaihdokset johtivat huonontuneeseen ubikinonin ja kompleksi I:n inhibiittoreiden sitoutumiseen. Saadut tulokset vahvistavat m.3376G>A ja m.14498T>C mutaatioiden patogeenisyyden. Ne myös osoittavat, että LHON/MELAS-oireyhtymään liitetyn mutaation biokemiallisissa vaikutuksissa yhdistyvät sekä LHON:ssa että MELAS-oireyhtymässä todettujen mutaatioiden seuraukset. Esitetyt tulokset tukevat näkemystä siitä, että ubikinonin ja kompleksi I:n välisessä vuorovaikutuksessa tapahtuva muutos on kaikille LHON:aan liitetyille mutaatioille yhteinen vaikutusmekanismi. NuoH:n, NuoJ:n ja NuoK:n kohdennetusta mutageneesista saatujen tulosten perusteella ND1 ja ND6 alayksiköt ovat osa ubikinonin sitoutumispaikkaa entsyymikompleksissa, kun taas ND4L osallistuu protoninkuljetukseen.