Abstract The purpose of this study was to determine the prevalence and aetiology of childhood hearing impairment (HI) in northern Finland and to evaluate the presence of additional disabilities among hearing impaired children. Such data would be valuable in guiding examinations and rehabilitation. Study I consisted of 214 children with mild to profound HI ascertained prior to age 10 years. They belonged to the birth cohort spanning the years 1993–2002. The clinical data were collected from the patient records of the Oulu University Hospital. In studies II–III, mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) and in the WFS1 gene were determined in children with unknown aetiology of HI. Study IV is a prospective follow-up study examining the hearing of children with m.1555A>G mutation in mtDNA. The prevalence of childhood HI was 2.3/1000 live births. Genetic causes were the most common (47%) aetiology of HI, while 16% of cases were acquired and 36% were unknown. Almost 40% of 214 children had one or more additional disabilities that adversely influenced their development or learning. The frequency of additional disabilities was not associated with the severity of HI. Children with acquired HI had additional disabilities more often (66%) than children with genetic or unknown aetiology of HI (44%). Molecular analysis revealed that mutations in mtDNA and WFS1 are rare causes of childhood HI. Three rare variants and the novel p.Gly831Ser variant were found in WFS1. The p.Gly831Ser variant may be a new member to the group of heterozygous WFS1 mutations that lead to HI. One child harboured the pathogenic m.1555A>G mutation in MT-RNR1. In addition, eight rare variants and 13 polymorphisms were found in MT-RNR1 or in MT-RNR2. Evaluation of m.990T>C suggested that this transition is a pathogenic rather than a neutral variant. During a 7.8 year follow up of 19 children with m.1555A>G, HI was ascertained in 10 children (age range, 2.1–13.2 years at the end of the follow-up). Distinct phenotypes of HI were identified. Environmental factors contributing to the phenotype variation were not recognized. Because these children generally pass the newborn hearing screening, it is important to follow over time the hearing of children in families with the m.1555A>G mutation. / Tiivistelmä Tämän työn tavoitteena oli tutkia lapsuusiän kuulovikojen esiintyvyyttä ja etiologiaa pohjoissuomalaisilla lapsilla sekä selvittää kuulovikaisilla lapsilla esiintyviä muita oireita. Tieto kuulovian etiologiasta ja mahdollisista muista oireista auttaa tutkimusten ja kuntoutuksen suunnittelussa. Tutkimukseen osallistuvat lapset olivat syntyneet Pohjois-Suomessa vuosina 1993–2002. Osatyössä I kerättiin sairauskertomustiedot niistä lapsista, joiden kuulovika oli todettu ennen kymmenen vuoden ikää. Osatöissä II ja III määritettiin mitokondrion DNA:n ja tuman WFS1-geenin muutoksia lapsilla, joiden kuulovian etiologia oli tuntematon. Osatyössä IV seurattiin lasten kuuloa suvussa, jossa on todettu mitokondrion DNA:n mutaatio m.1555A>G. Lapsuusiän kuulovikojen esiintyvyys oli 2,3 tuhatta vastasyntynyttä kohden. Kuulovian yleisin syy oli perinnöllinen (47 %). Hankinnaisia kuulovikoja oli 16 % ja etiologialtaan tuntemattomia 36 %. Lähes 40 %:lla 214 lapsesta oli kuulovian lisäksi yksi tai useampi muu oire, jonka arvioitiin vaikuttaneen haitallisesti lapsen kehitykseen tai oppimiseen. Muiden oireiden esiintyminen ei riippunut kuulovian vaikeusasteesta. Hankinnaiseksi luokiteltuihin kuulovikoihin liittyi enemmän muita oireita (66 %) kuin niihin kuulovikoihin, joiden syy oli perinnöllinen tai tuntematon (44 %). Pohjoissuomalaisilla lapsilla mitokondrion DNA:n ja WFS1-geenin muutokset olivat harvinaisia kuulovian syitä. WFS1-geenissä todettiin kolme aikaisemmin tunnettua harvinaista ja yksi uusi geenimuutos. Tämän p.Gly831Ser-mutaation arvioitiin olevan heterotsygoottisena kuulovikaa aiheuttava muutos. Yhdellä lapsella todettiin mitokondrion DNA:n patogeeninen mutaatio m.1555A>G. Lisäksi MT-RNR1- ja MT-RNR2-geeneissä todettiin 13 polymorfiaa, jotka kuuluvat normaaliin vaihteluun ja kahdeksan harvinaista muutosta, joista m.990T>C-muutos on todennäköisesti kuulovikaa aiheuttava. Seurantatutkimukseen osallistui 19 lasta, joilla oli m.1555A>G-mutaatio. Seuranta kesti 7,8 vuotta, ja sen aikana ilmaantui kuulovika 10 lapselle, joiden ikä tutkimuksen loppuessa oli 2,1–13,2 vuotta. Todetut kuuloviat olivat keskenään erilaisia. Vaihtelua selittäviä ympäristötekijöitä ei todettu. Lasten kuuloa on tärkeää seurata perheissä, joissa on m.1555A>G-mutaatio, koska lapset yleensä läpäisevät vastasyntyneen kuulonseulontatutkimuksen ja mahdollinen kuulovika kehittyy myöhemmin.

Abstract Mitochondrial DNA depletion and deletions are related to mutations in the nuclear genes responsible for replication and maintenance of mitochondrial DNA (mtDNA). The POLG1 gene encodes the enzyme responsible for replication of mtDNA. A particular feature of the POLG1 mutations is an increased risk of acute liver failure (ALF) upon exposure to sodium valproate (VPA), but the pathomechanism is not resolved. The present work studies the molecular genetic aetiology and clinical phenotypes associated with mtDNA depletion and deletion. Another objective was an investigation of clinical phenotypes in POLG1 mutations and disentangling the pathomechanism of VPA-induced ALF in POLG1 mutations. Mitochondrial toxicity of VPA was examined using HepG2 cells as an experimental in vitro model. In this work, mtDNA depletion was associated with severe neonatal-onset encephalopathy. Furthermore, mtDNA depletion was found in muscle dystrophy as a secondary finding to muscle degradation. Multiple mitochondrial DNA deletions were found in two patients with Kearns-Sayre syndrome suggesting a genetic origin of the disease. POLG1 p.R722H mutation has been previously reported as a neutral polymorphism, but we found evidence suggesting that POLG1 p.R722H could be a pathogenic mutation in a homozygous or compound heterozygous state. We identified retrospectively five patients, who required liver transplant after VPA-induced ALF. All five patients harboured POLG1 mutations supporting the evidence of POLG1 mutations as a risk factor for VPA-induced ALF. Previously, patients with POLG1 mutations have been considered unsuitable for liver transplantation, but we found that homozygous POLG1 mutations and adolescent or adult-onset disease predicted a good outcome following liver transplantation. In vitro studies on HepG2 cells showed that VPA disturbs mitochondrial respiration. Our results expand the phenotypes and molecular genetic features in mitochondrial DNA depletion and deletion syndromes. We found evidence that POLG1 mutations are not a contraindication for liver transplantation; rather, mutation status and age at onset affect survival. This finding should be taken in consideration in the treatment of VPA-induced ALF. Furthermore, our findings indicate that sodium valproate is toxic to mitochondria and should be avoided in patients with mitochondrial disease. / Tiivistelmä Mitokondrion DNA:n (mtDNA) kahdentumisesta ja ylläpidosta vastaavien tuman geenien mutaatiot voivat johtaa mtDNA:n määrän vähenemiseen (depleetioon) ja katkoksiin (deleetioihin). MtDNA:n kahdentumisesta vastaavaa entsyymiä koodaa tuman POLG1-geeni. POLG1-mutaatioihin liittyy kohonnut riski sairastua natriumvalproaatin (VPA) aiheuttamaan akuuttiin maksavaurioon. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mtDNA:n depleetion ja deleetioiden molekyyligeneettistä etiologiaa ja kliinisiä taudinkuvia. Tutkimuksessa selvitettiin myös POLG1-mutaatioihin liittyviä taudinkuvia ja POLG1-mutaatioihin liittyvän akuutin maksavaurion patomekanismia. VPA:n vaikutusta mitokondrioiden toimintaan tutkittiin in vitro HepG2-solumallissa. Tutkimuksessa todettiin mtDNA:n depleetion liittyvän vaikeaan varhain alkavaan aivosairauteen. Depleetio todettiin myös sekundaarisena merosiini-negatiivisessa lihasdystrofiassa. Kahdella Kearns-Sayren syndroomaa sairastavalla potilaalla todettiin multippelit mtDNA:n deleetiot, mikä viittaa syndrooman geneettisen alkuperään. POLG1 p.R722H-mutaatiota on aiemmin pidetty neutraalina polymorfiana, mutta tutkimuksen tulokset viittasivat siihen, että homotsygoottisena tai yhdistelmäheterotsygoottisena mutaatio on tautia aiheuttava. Helsingin yliopistollisen sairaalan elinsiirtorekisteristä tunnistettiin retrospektiivisesti viisi potilasta, jotka olivat saaneet maksansiirteen VPA:n aiheuttaman maksavaurion vuoksi. Kaikilla viidellä potilaalla todettiin POLG1-geenin mutaatio, mikä vahvistaa käsitystä geenin yhteydestä VPA:n aiheuttamaan maksavaurioon. POLG1-mutaatioita on pidetty vasta-aiheena maksansiirrolle, mutta tutkimuksessa todettiin homotsygoottisena esiintyvän POLG1-mutaation ja nuoruusiällä tai varhaisella aikuisiällä alkaneen taudin liittyvän parempaan maksansiirron jälkeiseen ennusteeseen. HepG2-solumallilla tehdyt tutkimukset osoittivat VPA:n haittaavan mitokondrioiden solyhengitystä. Tutkimuksen tulokset tuovat lisätietoa mtDNA:n depleetioon ja deleetioihin liittyvistä taudinkuvista ja molekyyligeneettisestä taustasta. POLG1-mutaatiot eivät ole ehdoton vasta-aihe maksansiirrolle; potilaan geneettinen status ja ikä taudin alkamishetkellä vaikuttavat ennusteeseen, mikä tulisi huomioida potilaiden hoidossa. Tulokset myös osoittivat VPA:n olevan mitokondriotoksinen lääke, jonka käyttöä tulisi välttää mitokondriotautipotilaiden hoidossa.

Abstract NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) is one of the largest enzymes in mammals. Seven (ND1-ND6 and ND4L) of its 45 subunits are encoded in mitochondrial DNA, mutations of which are usually behind mitochondrial diseases such as Leber hereditary optic neuropathy (LHON) and MELAS-syndrome. The rest of the genes are located in the nucleus. Bacterial homologs of complex I (NDH-1) consist of only 13–14 subunits, comprising the catalytic core of the enzyme. These complexes are simpler but perform a similar function. Escherichia coli NDH-1 was employed here to generate amino acid replacements at conserved sites in NuoH, NuoJ and NuoK, counterparts of ND1, ND6 and ND4L, to elucidate their role in complex I. Consequences of homologous amino acid substitutions brought about by ND1-affecting LHON/MELAS-overlap syndrome-associated m.3376G>A and m.3865A>G mutations and the ND6-affecting m.14498T>C substitution associated with LHON were also studied to validate their pathogenicity. Effects of the site-directed mutations were evaluated on the basis of enzyme activity, inhibitor sensitivity and growth phenotype. Highly conserved glutamate-residues 36 and 72 within transmembrane helices of NuoK in positions similar to proton translocating transmembrane proteins were found essential for electron transfer to ubiquinone and growth on medium necessitating normal proton transfer by NDH-1. NuoH and NuoJ replacements at sites corresponding to targets of m.3376G>A and m.14498T>C decreased ubiquinone reductase activity and altered the ubiquinone binding site, while the counterpart of m.3865A>G was without a major effect. Other NuoH and NuoJ mutations studied also affected the interactions of ubiquinone and inhibitors with NDH-1. The results corroborate the pathogenicity of the m.14498T>C and m.3376G>A mutations and demonstrate that the overlap syndrome-associated modification affects complex I in a pattern which appears to combine the effects of separate mutations responsible for LHON and MELAS. Change in ubiquinone binding affinity is a likely pathomechanism of all LHON-associated mutations. Effects of the NuoH, NuoJ and NuoK subunit substitutions also indicate that ND1 and ND6 subunits contribute to the ubiquinone-interacting site of complex I and the site is located in the vicinity of the membrane surface, while ND4L is likely involved in proton pumping activity of the enzyme. / Tiivistelmä 45 alayksiköstä muodostuva NADH-ubikinoni oksidoreduktaasi (kompleksi I) on nisäkkäiden suurimpia entsyymejä. Sen mitokondriaalisessa DNA:ssa koodattujen alayksiköiden ND1-ND6 ja ND4L geeneihin liittyvät mutaatiot ovat yleisiä mitokondriosairauksien, kuten Leberin perinnöllisen näköhermoatrofian (LHON) ja MELAS-oireyhtymän, syitä. Bakteerien vastaava entsyymi (NDH-1) koostuu vain 13–14 alayksiköstä. Tästä huolimatta sen katalysoima reaktio on samankaltainen kuin kompleksi I:n. NDH-1:n katsotaankin edustavan entsyymin katalyyttistä ydintä. Tässä työssä tutkittiin ND1, ND6 ja ND4L alayksiköiden tehtävää kompleksi I:ssä niiden Escherichia coli bakteerissa olevien vastineiden (NuoH, NuoJ ja NuoK) kohdennetun mutageneesin avulla. Samaa lähestymistapaa käytettiin LHON/MELAS-oireyhtymässä todettujen ND1 alayksikön mutaatioiden, m.3376G>A ja m.3865A>G, ja LHON:ssa havaitun ND6:n m.14498T>C mutaation aiheuttamien aminohappomuutosten seurauksien selvittämiseen. Tehtyjen mutaatioiden vaikutuksia arvioitiin entsyymiaktiivisuus-mittauksin ja kasvukokein. NuoK:n solukalvon läpäisevissä rakenteissa olevien kahden glutamaatti-aminohappotähteen sijainti muistuttaa protoneita kalvon läpi kuljettavissa proteiineissa todettua. NuoK:n glutamaattien havaittiinkin olevan tärkeitä elektronien ja protonien kuljetukselle kompleksi I:ssä. m.3376G>A ja m.14498T>C mutaatioiden aiheuttamien aminohappomuutosten vastineet NDH-1:ssä alensivat NDH-1:n elektroninsiirtoaktiivisuutta ja heikensivät ubikinonin sitoutumista, kun taas m.3865A>G mutaatiolla ei ollut vaikutusta. Muut NuoH ja NuoJ alayksiköihin tehdyt aminohappovaihdokset johtivat huonontuneeseen ubikinonin ja kompleksi I:n inhibiittoreiden sitoutumiseen. Saadut tulokset vahvistavat m.3376G>A ja m.14498T>C mutaatioiden patogeenisyyden. Ne myös osoittavat, että LHON/MELAS-oireyhtymään liitetyn mutaation biokemiallisissa vaikutuksissa yhdistyvät sekä LHON:ssa että MELAS-oireyhtymässä todettujen mutaatioiden seuraukset. Esitetyt tulokset tukevat näkemystä siitä, että ubikinonin ja kompleksi I:n välisessä vuorovaikutuksessa tapahtuva muutos on kaikille LHON:aan liitetyille mutaatioille yhteinen vaikutusmekanismi. NuoH:n, NuoJ:n ja NuoK:n kohdennetusta mutageneesista saatujen tulosten perusteella ND1 ja ND6 alayksiköt ovat osa ubikinonin sitoutumispaikkaa entsyymikompleksissa, kun taas ND4L osallistuu protoninkuljetukseen.