Introdução: A sepse é a maior causa de morbidade e mortalidade em pacientes queimados, uma vez que profundas alterações ocorrem na farmacocinética de agentes antimicrobianos prescritos para o controle das infecções. Além disso, pacientes queimados podem apresentar quadro de infecção por germes da comunidade, numa fase precoce de internação na UTI, e devem receber antimicrobianos que diferem daqueles indicados na sepse. Na vigência de infecção fúngica, o quadro se torna ainda mais grave para os pacientes queimados de prolongada internação e imunocomprometidos. Objetivo: Realizar o monitoramento plasmático de oito antimicrobianos largamente prescritos na UTI, a investigação da farmacocinética e a modelagem PK-PD para o ajuste do regime de dose e controle das infecções em pacientes queimados. Casuística: Investigaram-se 32 pacientes queimados internados na UTI/Unidade de Queimados - Divisão de Cirurgia Plástica do HC FMUSP, portadores de infecção recebendo pela via sistêmica sete antimicrobianos e um antifúngico. Métodos- Etapa Clinica: Os pacientes receberam os antimicrobianos geralmente em associação para o controle das infecções seguindo as recomendações da CCIH do hospital relativas ao regime de dose empírica inicial do controle de infecção na UTI de Queimados, na fase precoce e tardia da internação. Realizou-se o monitoramento plasmático do fluconazol, para a infecção fúngica, e dos sete antimicrobianos mais prescritos na UTI para os germes da comunidade e hospitalares (cefepime, ciprofloxacino, imipenem, oxacilina, piperacilina, sulfametoxazol e vancomicina) através das coletas de amostras sanguíneas de pico (termino da infusão) e vale (imediatamente antes da dose subseqüente). Complementarmente, a critério Clínico, foram colhidas amostras seriadas de sangue (pico, 1ª, 2ª, 4ª, 6ª e vale), totalizando seis coletas, para investigação da farmacocinética do agente que requereu ajuste de dose e individualização de terapia no paciente queimado. As coletas de sangue foram realizadas através de cateter venoso (2mL/coleta em tubos contendo EDTA sódico) pelo médico intensivista de plantão na UTI; o plasma foi obtido pela centrifugação para análise do fármaco de interesse ou então armazenado no congelador (-80o C) até o ensaio. Métodos - Etapa Analítica: Previamente à realização da Etapa Clínica, foi realizado no Laboratório o desenvolvimento, validação e otimização de método bioanalítico para quantificação dos oito antimicrobianos no plasma. Preferencialmente, as análises foram realizadas no dia da coleta de sangue do paciente, e o \"Laudo de Exame\" contendo os resultados foi expedido no mesmo dia ou na manhã do dia subseqüente possibilitando a intervenção precoce da Equipe Clínica e se necessária a substituição do regime empírico pela terapia individualizada dose ajustada. Métodos- Etapa estatística: A estatística propriamente dita foi realizada pelo tratamento estatístico com utilização do software GraphPad Instat 4.0., GraphPad Prism 4.0, pela utilização de testes paramétricos e não paramétricos. A modelagem farmacocinética foi realizada através da aplicação do software NonCompartmental Analysis, PK Solutions 2.0, aos pares de dados (C vs T) para cada antimicrobiano. Adicionalmente, aplicou-se o software GraphPad Prism 4.0 para a modelagem PK-PD, ferramenta importante na tomada de decisão relativa à alteração do regime empírico dos antimicrobianos. Resultados: Os pacientes queimados incluídos no protocolo eram adultos de ambos os sexos 23F/9M, 39,6 anos, 69,5 kg, 33,9% SCQ, e os agentes da queimadura foram para 27 pacientes/ térmico-fogo e para três pacientes/trauma elétrico; a lesão inalatória foi registrada em 11/32 pacientes. Foram realizados 303 seguimentos farmacoterapêuticos com a emissão de laudos de exame para os antimicrobianos prescritos aos pacientes nas fases precoce e tardia da internação. O ajuste de dose foi requerido para a vancomicina em 88% das solicitações de exame, cefepime (65%), sulfametozaxol (52%), fluconazol (74%) e imipenem (19%). Registrou-se alta variabilidade na farmacocinética para todos os antimicrobianos investigados. Adicionalmente, registrou-se alteração significativa dos parâmetros farmacocinéticos do imipenem, fluconazol, sulfametoxazol e vancomicina nos seguimentos de pacientes queimados com disfunção renal dialítica relativamente aqueles em que se registrou função renal preservada. A modelagem PK-PD para os diversos antimicrobianos se baseou nos parâmetros de predição de eficácia recomendados tais como o intervalo de tempo em que a concentração plasmática permaneceu acima da concentração inibitória mínima (%Δ T> CIM) para o cefepime, imipenem, oxacilina e piperacilina, ASCss0-24/CIM + Cssmax/CIM para o ciprofloxacino, ASCss0-24/CIM para o fluconazol e para a vancomicina e ASCss0-24/CIM +%Δ T> CIM para a sulfametoxazol. Conclusões: Registrou-se alta variabilidade na farmacocinética dos agentes investigados e a modelagem PK-PD justificou plenamente a substituição da terapia empírica inicial pela dose ajustada para a cobertura dos germes sensíveis, daqueles apresentando sensibilidade dose dependente ao antimicrobiano, além daqueles com alto CIM, pouco sensíveis as doses usuais. Finalmente, a modelagem PK-PD mostrou-se definitiva e ferramenta indispensável na manutenção desses agentes no arsenal terapêutico, garantindo terapia eficaz ao paciente queimado, evitando a emergência bacteriana e o desenvolvimento de resistência. / Introduction: Sepsis is a main cause of morbidity and mortality in burn patients, once pharmacokinetics of antimicrobials prescribed for the control of infections are significantly altered in those patients. In addition, burn patients in the ICU, initially can present infections by community microbial and must receive different antimicrobials than those prescribed for sepsis. On the other hand, burn immunocompromized patients with prolonged staying in the ICU, re-incidence of sepsis and fungal infection requires an effective antifungal agent that must be associated to the antimicrobials prescription. Objective: Therapeutic plasma monitoring of eight antimicrobials largely prescribed to burn patients from the ICU, Pharmacokinetic and PK-PD modeling for dose adjustment and for the control of infections. Study design: Thirty two burn inpatients with infections from the ICU Burns- Division of Plastic Surgery of Clinics Hospital Medical School University of Sao Paulo received systemically antimicrobials/ antifungal agents. Methods - Clinical Procedures: In general burn patients received several antimicrobial agents as recommended by the Control of Hospital Infection Committee as empirical dose at the beginning of therapy and also afterwards in the ICU. The control of infections by community microbials or yet by hospital microbials, and also for fungal infection, was performed by drug plasma monitoring of cefepime, ciprofloxacin, imipenem, oxacillin, piperacillin, sulphamethoxazole, vancomycin and fluconazole after blood sample collection at the peak and at the trough. Complementary, usually by clinical criteria, six blood sample collections were performed at time dose interval (end of drug infusion, 1st, 2nd, 4th, 6th and at the trough) for pharmacokinetic purposes, dose adjustment and individualization of drug therapy for burn patients. Blood sample collection was done by the physician from the ICU by venous catheter (2mL/each into blood collection tubes sodium EDTA); plasma obtained by centrifugation of blood tubes were analyzed in the same day or in a deep freezer to storage (-80o C) until assay. Methods - Analytical Procedures: Previously to the clinical study, in the Laboratory School of Pharmaceutical Sciences was performed the development, validation and optimization of bioanalytical methods for drug plasma monitoring of eight antimicrobial/antifungal agents by HPLC-UV. Drug measurements were performed on the day of blood collection and data were preferentially informed to the physician at the same day or at the early morning of the following day to facilitate the therapeutic intervention and changes on the morning prescription to guarantee drug efficacy. Methods Statistics Procedures: Descriptive statistics was performed by applying the software GraphPad Instat v 4.0., GraphPad Prism v.4.0 by parametric and non parametric tests. Pharmacokinetics was estimated by applying the software NonCompartmental Analysis, PK Solutions 2.0, to data (C vs T) for each antimicrobial agent. Additionally, the software GraphPad Prism v 4.0 was applied to PK-PD modeling, an important tool related to dilemma decision about changes on empirical dose of an antimicrobial agent and obviously helps the physician in the rationalization of drug therapy in severe burns. Results: Burn patients included in the protocol were of both genders 23F/9M, 39.6 yrs, 69.5 kg, 33.9% TBSA; agents of the accident were fire/ alcohol for 27 patients and electrical trauma for three patients; inhalation injury were described for 11/32 patients. Approximately 1500 drug plasma measurements for all antimicrobials prescribed to burn patients for the control of infection in the ICU were performed totalizing 303 follow up for pharmacokinetic purposes during the period in the ICU for 32 burn patients. Dose adjustment was required in 88% of vancomycin prescription, 65% for cefepime, 52% for sulphamethoxazole, 74% for fluconazole e 19% for imipenem. High pharmacokinetic variability was registered for all agents investigated. In addition, significant changes on pharmacokinetic parameters were described for imipenem, fluconazole, sulphamethoxazole and vancomycin for burn patients with dialytic renal dysfunction compared to those with renal function preserved. PK-PD modeling applied to antimicrobials investigated in the present study was based on predictive parameters recommended like time interval to maintain drug plasma concentration higher than the minimum effective concentration (%Δ T> MIC) for cefepime and also for imipenem, oxacillin and piperacillin; AUCss0-24/MIC plus Cssmax/MIC for ciprofloxacin, AUCss0-24/MIC for fluconazole and vancomycin, and finally, AUCss0-24/MIC plus %Δ T> MIC for sulphamethoxazole. Conclusions: High pharmacokinetic variability was obtained for all investigated agents. PK-PD modeling applied could justify definitively the antimicrobial therapy dose adjustment instead the empirical dose regimen. Then, drug efficacy was guaranteed against susceptible microbial, spreading to susceptible to antimicrobial dose dependent and also those presenting high value for MIC related to microbial resistance to empiric dose regimen. In conclusion, it was demonstrated that PK-PD modeling of antimicrobials with basis on predictive drug efficacy parameter is definitively an important tool to preserve and safeguard these agents for the control of severe infection in burn patients, to avoid the bacterial emergency and microbial resistance.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi estabelecer modelo farmacocinéticofarmacodinâmico (modelo PK/PD) para descrever o perfil temporal do efeito bactericida do levofloxacino e do gatifloxacino contra Streptococcus pneumoniae. Método: Para alcançar este objetivo as seguintes etapas foram realizadas: i) foram validadas metodologias analíticas de SPE-HPLC para o gatifloxacino e HPLC para o levofloxacino e o gatifloxacino para quantificação destes em amostras de plasma, microdialisado tecidual e caldo de cultura; ii) foi avaliada a farmacocinética do gatifloxacino em roedores nas doses de 6 e 12 mg/kg via oral e 6 mg/kg via intravenosa (i.v.) e a biodisponibilidade oral foi determinada; iii) foram estabelecidas as condições ideais para microdiálise do gatifloxacino e as taxas de recuperação in vitro, por diálise (EE), retrodiálise (RD) e fluxo líquido zero (NNF) e in vivo, em tecido pulmonar e muscular, por retrodiálise e fluxo líquido zero. Essas recuperações foram utilizadas para determinar a penetração pulmonar do gatifloxacino após a administração i.v. bolus de 6 mg/kg a ratos Wistar sadios; iv) foram simuladas as concentrações livres pulmonares esperadas para humanos após tratamento com diferentes regimes de dosagem para o levofloxacino e o gatifloxacino em modelo de infecção in vitro frente a Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619. Simulações de concentrações constantes múltiplas do MIC de cada fármaco também foram realizadas. As curvas de morte bacteriana por tempo obtidas foram modeladas com modelo PK/PD de Emax modificado, com auxílio do programa Scientist® v 2.01. Resultados e Conclusões: i) Os métodos analíticos por SPE-HPLC e HPLC para quantificação do gatifloxacino e do levofloxacino foram validados. As curvas foram lineares na faixa de 20 a 600 ng/mL para plasma e microdialisado tecidual de gatifloxacino e na faixa de 250 a 6000 ng/mL para caldo de cultura para ambos os fármacos, com r > 0,99, independente do método desenvolvido. Em plasma e microdialisado, a exatidão foi ≥ 94,3 %. A recuperação do gatifloxacino dos cartuchos de extração em fase sólida variou entre 95,6 e 99,7 %. A precisão não excedeu 5,8 % do CV. Em caldo de cultura, a exatidão foi ≥ 92,0 % e 93,4 % para o gatifloxacino e o levofloxacino, respectivamente. A precisão não excedeu 3,2 % e 4,2 % do CV para o levofloxacino e o gatifloxacino, respectivamente; ii) A avaliação farmacocinética demonstrou que os modelos abertos de dois compartimentos e de um compartimento com absorção de primeira ordem descreveram adequadamente os perfis plasmáticos após administração do gatifloxacino pelas vias i.v. e oral nas doses de 6 e 12 mg/kg, com CL de 0,9 ± 0,2 e 1,0 ± 0,3 L/h/kg, t½ de 3,3 ± 0,8 e 3,7 ± 0,3 h e Vd de 2,8 ± 0,4 e 3,1 ± 1,0 L/kg, respectivamente. Os parâmetros determinados por abordagem compartimental e não compartimental não diferiram significativamente para as duas vias investigadas (α = 0,05). A ASC0-∞ foi de 4,1 ± 1,6 e 6,6 ± 1,3 μg.h/mL após administração oral e i.v. das doses de 12 e 6 mg/kg, respectivamente, levando a uma biodisponibilidade de 31%. A constante de velocidade de absorção foi alta (5,0 ± 1,8 h-1) e a farmacocinética mostrou-se linear na faixa de doses investigada; iii) A recuperação das sondas de microdiálise in vitro por EE e RD para 80, 160 e 400 ng/mL de gatifloxacino foi de 33,5 ± 1,3%, 33,1 ± 1,2%, 31,8 ± 2,7% e 31,4 ± 2,6%, 33,1 ± 2,2%, 30,6 ± 3,3%, respectivamente. In vivo a recuperação por RD no músculo esquelético e pulmão de ratos Wistar foi de 29,1 ± 1,0% e 30,7 ± 1,4%, respectivamente. A recuperação por NNF in vitro e in vivo foi de 30,9 ± 2,9% e 29,0 ± 0,8%, respectivamente. Desse modo, concluiu-se que a recuperação foi constante e independente do método ou meio utilizado. Os perfis de concentração livre no músculo, pulmão e plasma de ratos Wistar foram virtualmente superpostos após dose de 6 mg/kg i.v., resultando em ASC similares de 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL e 3805 ± 577 ng.h/mL, respectivamente (α = 0,05). O fator de distribuição tecidual foi de 1,02 e 1,08 para músculo e pulmão, respectivamente; iv) O modelo PK/PD empregado foi capaz de descrever o efeito do levofloxacino e do gatifloxacino contra o Streptococcus pneumoniae in vitro para todas as simulações investigadas. O EC50 médio para o levofloxacino (3,57 ± 2,16 mg/L) foi significativamente maior que o do gatifloxacino (0,95 ± 0,56 mg/L) quando regimes de doses múltiplas foram simulados. O mesmo foi observado para concentrações constantes, sendo o EC50,levofloxacino = 2,75 ± 0,45 mg/L e EC50,gatifloxacino = 1,03 ± 0,52 mg/L. O kmax foi estatisticamente semelhante para ambos os fármacos independente se foram simuladas concentrações flutuantes (kmax,levofloxacino = 0,40 ± 0,19 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,48 ± 0,15 h-1) ou concentrações constantes (kmax,levofloxacino = 0,34 ± 0,06 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,39 ± 0,23 h-1). Nenhum dos índices PK/PD foi capaz de prever o desfecho da infecção para todas as situações investigadas. O modelo PK/PD desenvolvido permitiu a comparação entre as duas fluorquinolonas e de diferentes posologias para cada fármaco, podendo ser utilizado para simular o efeito temporal de regimes de dosagem alternativos bem como para otimização da posologia desses fármacos para o tratamento da pneumonia adquirida na comunidade. / Objective: The aim of this work was to establish a pharmacokinetic-pharmacodynamic model (PK/PD model) to describe the profile of bactericidal effect over time of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae. Method: To achieve this goal the following steps were carried out: i) an analytical method of SPE-HPLC to quantify gatifloxacin in plasma and tissue microdialysates, and an HPLC method for measuring levofloxacin and gatifloxacin in culture broth samples were developed and validated; ii) the pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents after intravenous (6 mg/kg) and oral (6 and 12 mg/kg) administration was assessed as well as the oral bioavailability of the drug was determined; iii) microdialysis conditions for gatifloxacin were established and the recovery rates in vitro by dialysis (EE), retrodialysis (RD) and no-net-flux (NNF), and in vivo in lung and skeletal muscle tissue by RD and NNF were determined. Gatifloxacin tissue penetration in lung after intravenous administration (6 mg/kg) to healthy Wistar rats was determined; iv) levofloxacin and gatifloxacin free lung concentrations expected in humans following different dosing regimens of the drugs were simulated using Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619 in vitro model of infection. The effect of constant concentrations multiples of MIC were also investigated. The time-kill curves obtained were modeled using an Emax modified model using Scientist® v. 2.01 software. Results and Conclusions: i) The analytical methods by SPE-HPLC and HPLC for quantifying gatifloxacin and levofloxacin were validated. Calibration curves were linear between 20-600 ng/mL for gatifloxacin in plasma and tissue microdialysate samples and between 250-6000 ng/mL for broth media for both drugs, with r > 0.99 independently of the method considered. The accuracy was ≥ 94.3 % for plasma and microdialysate. Gatifloxacin recovery from the solid phase extraction cartridges ranged from 95.6 to 99.7%. The precision did not exceed 5.8% of the CV. In broth media the accuracy was ≥ 92.0% and 94.3% for gatifloxacin and levofloxacin, respectively. The precision did not exceed 3.2% and 4.2% of the CV for levofloxacin and gatifloxacin, respectively; ii) Gatifloxacin experimental plasma profiles in rats were adequately fitted to a two-compartment model after intravenous and to a one compartment model with first order absorption after oral dosing. The total clearance (0.9 ± 0.2 and 1.0 ± 0.3 L/h/kg), the terminal half-life (3.3 ± 0.8 and 3.7 ± 0.3 h) and the apparent volume of distribution (2.8 ± 0.4 and 3.1 ± 1.0 L/kg) were statistically similar (α = 0.05) after i.v. and oral administration, by both model independent and compartmental approaches. The area under the curve was reduced after oral dosing (4.1 ± 1.6 μg.h/mL) in comparison to i.v. dosing (6.6 ± 1.3 μg.h/mL) leading to an oral bioavailability of 31%. The absorption was fast, with a constant rate of 5.0 ± 1.8 h-1. The results evidenced the linear pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents in the dose range investigated; iii) Microdialysis recoveries determined in vitro by EE and RD at 80, 160 and 400 ng/mL resulted in 33.5 ± 1.3%, 33.1 ± 1.2%, 31.8 ± 2.7% and 31.4 ± 2.6%, 33.1 ± 2.2%, 30.6 ± 3.3%, respectively. In vivo recovery by RD in Wistar rat’s skeletal muscle and lung were 29.1 ± 1.0% and 30.7 ± 1.4%, respectively. Recoveries by no-net-flux in vitro and in vivo resulted in recoveries of 30.9 ± 2.9% and 29.0 ± 0.8%, respectively. In this way, it was shown that gatifloxacin recovery was constant and independent of the method or media used. Free skeletal muscle, lung and plasma profiles were virtually superimposed after i.v. administration of gatifloxacin 6 mg/kg dose resulting in similar area under the curve of 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL and 3805 ± 577 ng.h/mL, respectively (α = 0.05). The tissue distribution factors were determined to be 1.02 and 1.08 for muscle and lung, respectively; iv) The PK/PD model used was able to describe the effect of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae in vitro for all the regimens investigated. Levofloxacin EC50 (3.57 ± 2.16 mg/L) was higher than gatifloxacin (0.95 ± 0.56 mg/L) when multiple dosing regimens where simulated. Using constant concentrations, levofloxacin EC50 was also higher than gatifloxacin (EC50,levofloxacin = 2.75 ± 0.45 mg/L; EC50,gatifloxacin = 1.03 ± 0.52 mg/L). The kmax was statistically similar for both drugs independent of whether fluctuating (kmax,levofloxacin = 0.40 ± 0.19 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.48 ± 0.15 h-1) or constant concentrations (kmax,levofloxacin = 0.34 ± 0.06 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.39 ± 0.23 h-1) were simulated. None of the PK/PD indices was capable of predicting the infection outcome for all the situations investigated. The PK/PD model developed allowed not only the comparison between the fluoroquinolones effect but also the comparison of different dosing regimes for the same drug and can be used for simulating alternative regimens and optimizing therapy of these drugs to treat community-acquired pneumonia.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito bactericida in vitro das fluoroquinolonas levofloxacino (LEV) e moxifloxacino (MXF)contra Escherichia coli, baseando-se em dados in vivo de concentração livre prostática. Métodos: Ratos Wistar machos foram utilizados nos experimentos in vivo para determinação da farmacocinética plasmática e prostática do LEV (7 mg/kg) e MXF (6 e 12 mg/kg) após dose i.v. bolus. As concentrações livres prostáticas foram determinadas por microdiálise. A coleta das amostras de plasma e dialisado de tecido foi realizada simultaneamente nos animais previamente anestesiados com uretano para determinação do fator de distribuição tecidual (fT). Para a quantificação do LEV e MXF nas amostras de plasma e dialisado, métodos analíticos foram validados. Análise farmacocinética não-compartimental e modelagem compartimental dos dados foram realizadas utilizando o WinNonlin® e NONMEM® v. 6, respectivamente. Os experimentos de farmacodinâmica in vitro foram executados utilizando sistema composto de caldo de cultura Mueller-Hinton no qual a bactéria teste (Escherichia coli ATCC 25922) foi exposta a concentrações constantes e flutuantes dos antimicrobianos. O número de colônias bacterianas viáveis (CFU/mL) foi determinado em função do tempo e utilizado como parâmetro farmacodinâmico para construção das curvas de morte bacteriana (time-kill curves). Nos experimentos de time-kill curves estáticos, concentrações baseadas em múltiplos da MIC na faixa de 0.008–2 mg/L foram utilizadas, enquanto que no dinâmico a meia-vida de eliminação do LEV em humanos foi simulada no sistema in vitro através de diluição constante do caldo de cultura. Resultados e Discussão: Um método analítico por HPLC-fluorescência foi desenvolvido e validado para a quantificação do MXF nas amostras biológicas. Método analítico também foi validado para quantificação do LEV nas amostras. Os perfis plasmáticos e teciduais das duas fluoroquinolonas foram modelados simultaneamente utilizando modelo de três compartimentos considerando transporte linear (difusão passiva) e saturável (cinética de Michaelis-Menten). O modelo, que foi o mais adequado para descrever os dados experimentais, sugere a presença de transportadores de efluxo na próstata. A penetração prostática média do MXF foi significativamente maior que a do LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) e foi independente da dose. Em ratos, não foi observada diferença na meia-vida plasmática média entre LEV (5.0 h) e MXF (4.9 h), embora a meia-vida tecidual foi ligeiramente maior para o MXF (3.3 vs. 2.3 h). Usando a abordagem populacional de modelagem PK/PD, modelo de Emax sigmoidal foi utilizado para descrever o efeito das duas quinolonas frente a E. coli tanto nos experimentos de concentração estática quanto dinâmica. A comparação dos parâmetros PK/PD estimados mostrou que o MXF apresenta potência superior ao LEV contra a cepa através da comparação dos valores de EC50, embora ambos tenham apresentado eficácia comparável (Emax de 1.85 e 1.83 h-1 para MXF e LEV, respectivamente). Para o LEV, os esquemas posológicos de 500 mg q12 h e 1000 mg q24 h apresentaram maior eficácia no período de 24 h, pois promoveram a inibição completa do recrescimento bacteriano observado nos outros dois regimes de dose testados. Conclusões: A correlação dos dados de farmacocinéticain vivo com os experimentos de farmacodinâmica in vitro, seguida da construção do modelo PK/PD de efeito máximo, possibilitou explorar a relação do efeito antimicrobiano em função do tempo baseada em concentrações livres esperadas na prostatite. / Objective: The aim of this study was to develop a pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model to describe the in vitro bactericidal effect of the fluoroquinolones levofloxacin (LEV) and moxifloxacin (MXF) against Escherichia coli based on free concentrations in prostate tissue measured in vivo. Methods: Pharmacokinetic experiments were conducted in male Wistar rats for the determination of plasma and free prostate concentrations of LEV (7 mg/kg) and MXF (6 and 12 mg/kg) after i.v. bolus administration. Blood and tissue dialysate samples were collected simultaneously in the group of rats previously anesthetized with urethane to determine the tissue distribution factor (fT). To quantify MXF and LEV in plasma and dialysate samples obtained after administration of the quinolones, analytical methods based on HPLC-fluorescence were developed and validated accordingly. Non-compartmental analysis and compartmental PK modeling of the data was performed in WinNonlin® and NONMEM® v. 6, respectively. The in vitro pharmacodynamic experiments were executed by using a system composed of Mueller-Hinton growth medium in which the test bacterial strain (Escherichia coli ATCC 25922) was exposed to constant and fluctuating antimicrobial concentrations. The number of viable colony-forming units (CFU/mL) was determined as a function of time and used as the pharmacodynamic parameter for construction of bacterial time-kill curves. In the static time-kill curves, concentrations in the range of 0.008-2 mg/L were tested based on multiples of the MIC, whereas in the dynamic time-kill curves the half-life of LEV in humans was simulated in the in vitro system by stepwise dilution of the growth medium. Results and Discussion: An HPLC-fluorescence method was developed and fully validated to quantify MXF in biological fluids. A method was also validated to determine LEV in the samples. Plasma and prostate concentrations of both drugs were simultaneously fitted using a three-compartment model considering linear (passive diffusion) and saturable transport (Michaelis-Menten kinetics), suggesting the presence of efflux transporters in the prostate. The average tissue penetration of MXF in the prostate was significantly higher than that of LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) and was independent of the dose. In rats, differences in average plasma half-life between plasma LEV (5.0 h) and MXF (4.9 h) were not observed, even though the tissue half-life was slightly longer for MXF (3.3 vs. 2.3 h). Using a population PK/PD modeling approach, a sigmoidal Emax model was used to describe the effect of the two quinolones against E. coli both in the static as well as in the dynamic time-kill curves. Comparison of the PK/PD parameter estimates showed that the in vitro potency of MXF is higher than LEV against the strain tested as shown by EC50 values, but both presented equivalent efficacy (Emax of 1.85 and 1.83 h-1 for MXF and LEV, respectively). For LEV, the dosing regimens of 500 mg q12 h and 1,000 mg q24 h showed overall greater efficacy over the 24 h period as they resulted in complete inhibition of bacterial regrowth observed in the other two dosing regimens tested. Conclusions: The correlation of in vivo pharmacokinetic data with in vitro pharmacodynamic experiments, followed by the development of an Emax PK/PD model, allowed determining the relationship between the bactericidal effect as a function of time based on free tissue concentrations expected in the site of infection.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi estabelecer modelo farmacocinéticofarmacodinâmico (modelo PK/PD) para descrever o perfil temporal do efeito bactericida do levofloxacino e do gatifloxacino contra Streptococcus pneumoniae. Método: Para alcançar este objetivo as seguintes etapas foram realizadas: i) foram validadas metodologias analíticas de SPE-HPLC para o gatifloxacino e HPLC para o levofloxacino e o gatifloxacino para quantificação destes em amostras de plasma, microdialisado tecidual e caldo de cultura; ii) foi avaliada a farmacocinética do gatifloxacino em roedores nas doses de 6 e 12 mg/kg via oral e 6 mg/kg via intravenosa (i.v.) e a biodisponibilidade oral foi determinada; iii) foram estabelecidas as condições ideais para microdiálise do gatifloxacino e as taxas de recuperação in vitro, por diálise (EE), retrodiálise (RD) e fluxo líquido zero (NNF) e in vivo, em tecido pulmonar e muscular, por retrodiálise e fluxo líquido zero. Essas recuperações foram utilizadas para determinar a penetração pulmonar do gatifloxacino após a administração i.v. bolus de 6 mg/kg a ratos Wistar sadios; iv) foram simuladas as concentrações livres pulmonares esperadas para humanos após tratamento com diferentes regimes de dosagem para o levofloxacino e o gatifloxacino em modelo de infecção in vitro frente a Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619. Simulações de concentrações constantes múltiplas do MIC de cada fármaco também foram realizadas. As curvas de morte bacteriana por tempo obtidas foram modeladas com modelo PK/PD de Emax modificado, com auxílio do programa Scientist® v 2.01. Resultados e Conclusões: i) Os métodos analíticos por SPE-HPLC e HPLC para quantificação do gatifloxacino e do levofloxacino foram validados. As curvas foram lineares na faixa de 20 a 600 ng/mL para plasma e microdialisado tecidual de gatifloxacino e na faixa de 250 a 6000 ng/mL para caldo de cultura para ambos os fármacos, com r > 0,99, independente do método desenvolvido. Em plasma e microdialisado, a exatidão foi ≥ 94,3 %. A recuperação do gatifloxacino dos cartuchos de extração em fase sólida variou entre 95,6 e 99,7 %. A precisão não excedeu 5,8 % do CV. Em caldo de cultura, a exatidão foi ≥ 92,0 % e 93,4 % para o gatifloxacino e o levofloxacino, respectivamente. A precisão não excedeu 3,2 % e 4,2 % do CV para o levofloxacino e o gatifloxacino, respectivamente; ii) A avaliação farmacocinética demonstrou que os modelos abertos de dois compartimentos e de um compartimento com absorção de primeira ordem descreveram adequadamente os perfis plasmáticos após administração do gatifloxacino pelas vias i.v. e oral nas doses de 6 e 12 mg/kg, com CL de 0,9 ± 0,2 e 1,0 ± 0,3 L/h/kg, t½ de 3,3 ± 0,8 e 3,7 ± 0,3 h e Vd de 2,8 ± 0,4 e 3,1 ± 1,0 L/kg, respectivamente. Os parâmetros determinados por abordagem compartimental e não compartimental não diferiram significativamente para as duas vias investigadas (α = 0,05). A ASC0-∞ foi de 4,1 ± 1,6 e 6,6 ± 1,3 μg.h/mL após administração oral e i.v. das doses de 12 e 6 mg/kg, respectivamente, levando a uma biodisponibilidade de 31%. A constante de velocidade de absorção foi alta (5,0 ± 1,8 h-1) e a farmacocinética mostrou-se linear na faixa de doses investigada; iii) A recuperação das sondas de microdiálise in vitro por EE e RD para 80, 160 e 400 ng/mL de gatifloxacino foi de 33,5 ± 1,3%, 33,1 ± 1,2%, 31,8 ± 2,7% e 31,4 ± 2,6%, 33,1 ± 2,2%, 30,6 ± 3,3%, respectivamente. In vivo a recuperação por RD no músculo esquelético e pulmão de ratos Wistar foi de 29,1 ± 1,0% e 30,7 ± 1,4%, respectivamente. A recuperação por NNF in vitro e in vivo foi de 30,9 ± 2,9% e 29,0 ± 0,8%, respectivamente. Desse modo, concluiu-se que a recuperação foi constante e independente do método ou meio utilizado. Os perfis de concentração livre no músculo, pulmão e plasma de ratos Wistar foram virtualmente superpostos após dose de 6 mg/kg i.v., resultando em ASC similares de 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL e 3805 ± 577 ng.h/mL, respectivamente (α = 0,05). O fator de distribuição tecidual foi de 1,02 e 1,08 para músculo e pulmão, respectivamente; iv) O modelo PK/PD empregado foi capaz de descrever o efeito do levofloxacino e do gatifloxacino contra o Streptococcus pneumoniae in vitro para todas as simulações investigadas. O EC50 médio para o levofloxacino (3,57 ± 2,16 mg/L) foi significativamente maior que o do gatifloxacino (0,95 ± 0,56 mg/L) quando regimes de doses múltiplas foram simulados. O mesmo foi observado para concentrações constantes, sendo o EC50,levofloxacino = 2,75 ± 0,45 mg/L e EC50,gatifloxacino = 1,03 ± 0,52 mg/L. O kmax foi estatisticamente semelhante para ambos os fármacos independente se foram simuladas concentrações flutuantes (kmax,levofloxacino = 0,40 ± 0,19 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,48 ± 0,15 h-1) ou concentrações constantes (kmax,levofloxacino = 0,34 ± 0,06 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,39 ± 0,23 h-1). Nenhum dos índices PK/PD foi capaz de prever o desfecho da infecção para todas as situações investigadas. O modelo PK/PD desenvolvido permitiu a comparação entre as duas fluorquinolonas e de diferentes posologias para cada fármaco, podendo ser utilizado para simular o efeito temporal de regimes de dosagem alternativos bem como para otimização da posologia desses fármacos para o tratamento da pneumonia adquirida na comunidade. / Objective: The aim of this work was to establish a pharmacokinetic-pharmacodynamic model (PK/PD model) to describe the profile of bactericidal effect over time of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae. Method: To achieve this goal the following steps were carried out: i) an analytical method of SPE-HPLC to quantify gatifloxacin in plasma and tissue microdialysates, and an HPLC method for measuring levofloxacin and gatifloxacin in culture broth samples were developed and validated; ii) the pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents after intravenous (6 mg/kg) and oral (6 and 12 mg/kg) administration was assessed as well as the oral bioavailability of the drug was determined; iii) microdialysis conditions for gatifloxacin were established and the recovery rates in vitro by dialysis (EE), retrodialysis (RD) and no-net-flux (NNF), and in vivo in lung and skeletal muscle tissue by RD and NNF were determined. Gatifloxacin tissue penetration in lung after intravenous administration (6 mg/kg) to healthy Wistar rats was determined; iv) levofloxacin and gatifloxacin free lung concentrations expected in humans following different dosing regimens of the drugs were simulated using Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619 in vitro model of infection. The effect of constant concentrations multiples of MIC were also investigated. The time-kill curves obtained were modeled using an Emax modified model using Scientist® v. 2.01 software. Results and Conclusions: i) The analytical methods by SPE-HPLC and HPLC for quantifying gatifloxacin and levofloxacin were validated. Calibration curves were linear between 20-600 ng/mL for gatifloxacin in plasma and tissue microdialysate samples and between 250-6000 ng/mL for broth media for both drugs, with r > 0.99 independently of the method considered. The accuracy was ≥ 94.3 % for plasma and microdialysate. Gatifloxacin recovery from the solid phase extraction cartridges ranged from 95.6 to 99.7%. The precision did not exceed 5.8% of the CV. In broth media the accuracy was ≥ 92.0% and 94.3% for gatifloxacin and levofloxacin, respectively. The precision did not exceed 3.2% and 4.2% of the CV for levofloxacin and gatifloxacin, respectively; ii) Gatifloxacin experimental plasma profiles in rats were adequately fitted to a two-compartment model after intravenous and to a one compartment model with first order absorption after oral dosing. The total clearance (0.9 ± 0.2 and 1.0 ± 0.3 L/h/kg), the terminal half-life (3.3 ± 0.8 and 3.7 ± 0.3 h) and the apparent volume of distribution (2.8 ± 0.4 and 3.1 ± 1.0 L/kg) were statistically similar (α = 0.05) after i.v. and oral administration, by both model independent and compartmental approaches. The area under the curve was reduced after oral dosing (4.1 ± 1.6 μg.h/mL) in comparison to i.v. dosing (6.6 ± 1.3 μg.h/mL) leading to an oral bioavailability of 31%. The absorption was fast, with a constant rate of 5.0 ± 1.8 h-1. The results evidenced the linear pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents in the dose range investigated; iii) Microdialysis recoveries determined in vitro by EE and RD at 80, 160 and 400 ng/mL resulted in 33.5 ± 1.3%, 33.1 ± 1.2%, 31.8 ± 2.7% and 31.4 ± 2.6%, 33.1 ± 2.2%, 30.6 ± 3.3%, respectively. In vivo recovery by RD in Wistar rat’s skeletal muscle and lung were 29.1 ± 1.0% and 30.7 ± 1.4%, respectively. Recoveries by no-net-flux in vitro and in vivo resulted in recoveries of 30.9 ± 2.9% and 29.0 ± 0.8%, respectively. In this way, it was shown that gatifloxacin recovery was constant and independent of the method or media used. Free skeletal muscle, lung and plasma profiles were virtually superimposed after i.v. administration of gatifloxacin 6 mg/kg dose resulting in similar area under the curve of 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL and 3805 ± 577 ng.h/mL, respectively (α = 0.05). The tissue distribution factors were determined to be 1.02 and 1.08 for muscle and lung, respectively; iv) The PK/PD model used was able to describe the effect of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae in vitro for all the regimens investigated. Levofloxacin EC50 (3.57 ± 2.16 mg/L) was higher than gatifloxacin (0.95 ± 0.56 mg/L) when multiple dosing regimens where simulated. Using constant concentrations, levofloxacin EC50 was also higher than gatifloxacin (EC50,levofloxacin = 2.75 ± 0.45 mg/L; EC50,gatifloxacin = 1.03 ± 0.52 mg/L). The kmax was statistically similar for both drugs independent of whether fluctuating (kmax,levofloxacin = 0.40 ± 0.19 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.48 ± 0.15 h-1) or constant concentrations (kmax,levofloxacin = 0.34 ± 0.06 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.39 ± 0.23 h-1) were simulated. None of the PK/PD indices was capable of predicting the infection outcome for all the situations investigated. The PK/PD model developed allowed not only the comparison between the fluoroquinolones effect but also the comparison of different dosing regimes for the same drug and can be used for simulating alternative regimens and optimizing therapy of these drugs to treat community-acquired pneumonia.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito bactericida in vitro das fluoroquinolonas levofloxacino (LEV) e moxifloxacino (MXF)contra Escherichia coli, baseando-se em dados in vivo de concentração livre prostática. Métodos: Ratos Wistar machos foram utilizados nos experimentos in vivo para determinação da farmacocinética plasmática e prostática do LEV (7 mg/kg) e MXF (6 e 12 mg/kg) após dose i.v. bolus. As concentrações livres prostáticas foram determinadas por microdiálise. A coleta das amostras de plasma e dialisado de tecido foi realizada simultaneamente nos animais previamente anestesiados com uretano para determinação do fator de distribuição tecidual (fT). Para a quantificação do LEV e MXF nas amostras de plasma e dialisado, métodos analíticos foram validados. Análise farmacocinética não-compartimental e modelagem compartimental dos dados foram realizadas utilizando o WinNonlin® e NONMEM® v. 6, respectivamente. Os experimentos de farmacodinâmica in vitro foram executados utilizando sistema composto de caldo de cultura Mueller-Hinton no qual a bactéria teste (Escherichia coli ATCC 25922) foi exposta a concentrações constantes e flutuantes dos antimicrobianos. O número de colônias bacterianas viáveis (CFU/mL) foi determinado em função do tempo e utilizado como parâmetro farmacodinâmico para construção das curvas de morte bacteriana (time-kill curves). Nos experimentos de time-kill curves estáticos, concentrações baseadas em múltiplos da MIC na faixa de 0.008–2 mg/L foram utilizadas, enquanto que no dinâmico a meia-vida de eliminação do LEV em humanos foi simulada no sistema in vitro através de diluição constante do caldo de cultura. Resultados e Discussão: Um método analítico por HPLC-fluorescência foi desenvolvido e validado para a quantificação do MXF nas amostras biológicas. Método analítico também foi validado para quantificação do LEV nas amostras. Os perfis plasmáticos e teciduais das duas fluoroquinolonas foram modelados simultaneamente utilizando modelo de três compartimentos considerando transporte linear (difusão passiva) e saturável (cinética de Michaelis-Menten). O modelo, que foi o mais adequado para descrever os dados experimentais, sugere a presença de transportadores de efluxo na próstata. A penetração prostática média do MXF foi significativamente maior que a do LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) e foi independente da dose. Em ratos, não foi observada diferença na meia-vida plasmática média entre LEV (5.0 h) e MXF (4.9 h), embora a meia-vida tecidual foi ligeiramente maior para o MXF (3.3 vs. 2.3 h). Usando a abordagem populacional de modelagem PK/PD, modelo de Emax sigmoidal foi utilizado para descrever o efeito das duas quinolonas frente a E. coli tanto nos experimentos de concentração estática quanto dinâmica. A comparação dos parâmetros PK/PD estimados mostrou que o MXF apresenta potência superior ao LEV contra a cepa através da comparação dos valores de EC50, embora ambos tenham apresentado eficácia comparável (Emax de 1.85 e 1.83 h-1 para MXF e LEV, respectivamente). Para o LEV, os esquemas posológicos de 500 mg q12 h e 1000 mg q24 h apresentaram maior eficácia no período de 24 h, pois promoveram a inibição completa do recrescimento bacteriano observado nos outros dois regimes de dose testados. Conclusões: A correlação dos dados de farmacocinéticain vivo com os experimentos de farmacodinâmica in vitro, seguida da construção do modelo PK/PD de efeito máximo, possibilitou explorar a relação do efeito antimicrobiano em função do tempo baseada em concentrações livres esperadas na prostatite. / Objective: The aim of this study was to develop a pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model to describe the in vitro bactericidal effect of the fluoroquinolones levofloxacin (LEV) and moxifloxacin (MXF) against Escherichia coli based on free concentrations in prostate tissue measured in vivo. Methods: Pharmacokinetic experiments were conducted in male Wistar rats for the determination of plasma and free prostate concentrations of LEV (7 mg/kg) and MXF (6 and 12 mg/kg) after i.v. bolus administration. Blood and tissue dialysate samples were collected simultaneously in the group of rats previously anesthetized with urethane to determine the tissue distribution factor (fT). To quantify MXF and LEV in plasma and dialysate samples obtained after administration of the quinolones, analytical methods based on HPLC-fluorescence were developed and validated accordingly. Non-compartmental analysis and compartmental PK modeling of the data was performed in WinNonlin® and NONMEM® v. 6, respectively. The in vitro pharmacodynamic experiments were executed by using a system composed of Mueller-Hinton growth medium in which the test bacterial strain (Escherichia coli ATCC 25922) was exposed to constant and fluctuating antimicrobial concentrations. The number of viable colony-forming units (CFU/mL) was determined as a function of time and used as the pharmacodynamic parameter for construction of bacterial time-kill curves. In the static time-kill curves, concentrations in the range of 0.008-2 mg/L were tested based on multiples of the MIC, whereas in the dynamic time-kill curves the half-life of LEV in humans was simulated in the in vitro system by stepwise dilution of the growth medium. Results and Discussion: An HPLC-fluorescence method was developed and fully validated to quantify MXF in biological fluids. A method was also validated to determine LEV in the samples. Plasma and prostate concentrations of both drugs were simultaneously fitted using a three-compartment model considering linear (passive diffusion) and saturable transport (Michaelis-Menten kinetics), suggesting the presence of efflux transporters in the prostate. The average tissue penetration of MXF in the prostate was significantly higher than that of LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) and was independent of the dose. In rats, differences in average plasma half-life between plasma LEV (5.0 h) and MXF (4.9 h) were not observed, even though the tissue half-life was slightly longer for MXF (3.3 vs. 2.3 h). Using a population PK/PD modeling approach, a sigmoidal Emax model was used to describe the effect of the two quinolones against E. coli both in the static as well as in the dynamic time-kill curves. Comparison of the PK/PD parameter estimates showed that the in vitro potency of MXF is higher than LEV against the strain tested as shown by EC50 values, but both presented equivalent efficacy (Emax of 1.85 and 1.83 h-1 for MXF and LEV, respectively). For LEV, the dosing regimens of 500 mg q12 h and 1,000 mg q24 h showed overall greater efficacy over the 24 h period as they resulted in complete inhibition of bacterial regrowth observed in the other two dosing regimens tested. Conclusions: The correlation of in vivo pharmacokinetic data with in vitro pharmacodynamic experiments, followed by the development of an Emax PK/PD model, allowed determining the relationship between the bactericidal effect as a function of time based on free tissue concentrations expected in the site of infection.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi estabelecer modelo farmacocinéticofarmacodinâmico (modelo PK/PD) para descrever o perfil temporal do efeito bactericida do levofloxacino e do gatifloxacino contra Streptococcus pneumoniae. Método: Para alcançar este objetivo as seguintes etapas foram realizadas: i) foram validadas metodologias analíticas de SPE-HPLC para o gatifloxacino e HPLC para o levofloxacino e o gatifloxacino para quantificação destes em amostras de plasma, microdialisado tecidual e caldo de cultura; ii) foi avaliada a farmacocinética do gatifloxacino em roedores nas doses de 6 e 12 mg/kg via oral e 6 mg/kg via intravenosa (i.v.) e a biodisponibilidade oral foi determinada; iii) foram estabelecidas as condições ideais para microdiálise do gatifloxacino e as taxas de recuperação in vitro, por diálise (EE), retrodiálise (RD) e fluxo líquido zero (NNF) e in vivo, em tecido pulmonar e muscular, por retrodiálise e fluxo líquido zero. Essas recuperações foram utilizadas para determinar a penetração pulmonar do gatifloxacino após a administração i.v. bolus de 6 mg/kg a ratos Wistar sadios; iv) foram simuladas as concentrações livres pulmonares esperadas para humanos após tratamento com diferentes regimes de dosagem para o levofloxacino e o gatifloxacino em modelo de infecção in vitro frente a Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619. Simulações de concentrações constantes múltiplas do MIC de cada fármaco também foram realizadas. As curvas de morte bacteriana por tempo obtidas foram modeladas com modelo PK/PD de Emax modificado, com auxílio do programa Scientist® v 2.01. Resultados e Conclusões: i) Os métodos analíticos por SPE-HPLC e HPLC para quantificação do gatifloxacino e do levofloxacino foram validados. As curvas foram lineares na faixa de 20 a 600 ng/mL para plasma e microdialisado tecidual de gatifloxacino e na faixa de 250 a 6000 ng/mL para caldo de cultura para ambos os fármacos, com r > 0,99, independente do método desenvolvido. Em plasma e microdialisado, a exatidão foi ≥ 94,3 %. A recuperação do gatifloxacino dos cartuchos de extração em fase sólida variou entre 95,6 e 99,7 %. A precisão não excedeu 5,8 % do CV. Em caldo de cultura, a exatidão foi ≥ 92,0 % e 93,4 % para o gatifloxacino e o levofloxacino, respectivamente. A precisão não excedeu 3,2 % e 4,2 % do CV para o levofloxacino e o gatifloxacino, respectivamente; ii) A avaliação farmacocinética demonstrou que os modelos abertos de dois compartimentos e de um compartimento com absorção de primeira ordem descreveram adequadamente os perfis plasmáticos após administração do gatifloxacino pelas vias i.v. e oral nas doses de 6 e 12 mg/kg, com CL de 0,9 ± 0,2 e 1,0 ± 0,3 L/h/kg, t½ de 3,3 ± 0,8 e 3,7 ± 0,3 h e Vd de 2,8 ± 0,4 e 3,1 ± 1,0 L/kg, respectivamente. Os parâmetros determinados por abordagem compartimental e não compartimental não diferiram significativamente para as duas vias investigadas (α = 0,05). A ASC0-∞ foi de 4,1 ± 1,6 e 6,6 ± 1,3 μg.h/mL após administração oral e i.v. das doses de 12 e 6 mg/kg, respectivamente, levando a uma biodisponibilidade de 31%. A constante de velocidade de absorção foi alta (5,0 ± 1,8 h-1) e a farmacocinética mostrou-se linear na faixa de doses investigada; iii) A recuperação das sondas de microdiálise in vitro por EE e RD para 80, 160 e 400 ng/mL de gatifloxacino foi de 33,5 ± 1,3%, 33,1 ± 1,2%, 31,8 ± 2,7% e 31,4 ± 2,6%, 33,1 ± 2,2%, 30,6 ± 3,3%, respectivamente. In vivo a recuperação por RD no músculo esquelético e pulmão de ratos Wistar foi de 29,1 ± 1,0% e 30,7 ± 1,4%, respectivamente. A recuperação por NNF in vitro e in vivo foi de 30,9 ± 2,9% e 29,0 ± 0,8%, respectivamente. Desse modo, concluiu-se que a recuperação foi constante e independente do método ou meio utilizado. Os perfis de concentração livre no músculo, pulmão e plasma de ratos Wistar foram virtualmente superpostos após dose de 6 mg/kg i.v., resultando em ASC similares de 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL e 3805 ± 577 ng.h/mL, respectivamente (α = 0,05). O fator de distribuição tecidual foi de 1,02 e 1,08 para músculo e pulmão, respectivamente; iv) O modelo PK/PD empregado foi capaz de descrever o efeito do levofloxacino e do gatifloxacino contra o Streptococcus pneumoniae in vitro para todas as simulações investigadas. O EC50 médio para o levofloxacino (3,57 ± 2,16 mg/L) foi significativamente maior que o do gatifloxacino (0,95 ± 0,56 mg/L) quando regimes de doses múltiplas foram simulados. O mesmo foi observado para concentrações constantes, sendo o EC50,levofloxacino = 2,75 ± 0,45 mg/L e EC50,gatifloxacino = 1,03 ± 0,52 mg/L. O kmax foi estatisticamente semelhante para ambos os fármacos independente se foram simuladas concentrações flutuantes (kmax,levofloxacino = 0,40 ± 0,19 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,48 ± 0,15 h-1) ou concentrações constantes (kmax,levofloxacino = 0,34 ± 0,06 h-1; kmax,gatifloxacino = 0,39 ± 0,23 h-1). Nenhum dos índices PK/PD foi capaz de prever o desfecho da infecção para todas as situações investigadas. O modelo PK/PD desenvolvido permitiu a comparação entre as duas fluorquinolonas e de diferentes posologias para cada fármaco, podendo ser utilizado para simular o efeito temporal de regimes de dosagem alternativos bem como para otimização da posologia desses fármacos para o tratamento da pneumonia adquirida na comunidade. / Objective: The aim of this work was to establish a pharmacokinetic-pharmacodynamic model (PK/PD model) to describe the profile of bactericidal effect over time of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae. Method: To achieve this goal the following steps were carried out: i) an analytical method of SPE-HPLC to quantify gatifloxacin in plasma and tissue microdialysates, and an HPLC method for measuring levofloxacin and gatifloxacin in culture broth samples were developed and validated; ii) the pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents after intravenous (6 mg/kg) and oral (6 and 12 mg/kg) administration was assessed as well as the oral bioavailability of the drug was determined; iii) microdialysis conditions for gatifloxacin were established and the recovery rates in vitro by dialysis (EE), retrodialysis (RD) and no-net-flux (NNF), and in vivo in lung and skeletal muscle tissue by RD and NNF were determined. Gatifloxacin tissue penetration in lung after intravenous administration (6 mg/kg) to healthy Wistar rats was determined; iv) levofloxacin and gatifloxacin free lung concentrations expected in humans following different dosing regimens of the drugs were simulated using Streptococcus pneumoniae ATCC® 49619 in vitro model of infection. The effect of constant concentrations multiples of MIC were also investigated. The time-kill curves obtained were modeled using an Emax modified model using Scientist® v. 2.01 software. Results and Conclusions: i) The analytical methods by SPE-HPLC and HPLC for quantifying gatifloxacin and levofloxacin were validated. Calibration curves were linear between 20-600 ng/mL for gatifloxacin in plasma and tissue microdialysate samples and between 250-6000 ng/mL for broth media for both drugs, with r > 0.99 independently of the method considered. The accuracy was ≥ 94.3 % for plasma and microdialysate. Gatifloxacin recovery from the solid phase extraction cartridges ranged from 95.6 to 99.7%. The precision did not exceed 5.8% of the CV. In broth media the accuracy was ≥ 92.0% and 94.3% for gatifloxacin and levofloxacin, respectively. The precision did not exceed 3.2% and 4.2% of the CV for levofloxacin and gatifloxacin, respectively; ii) Gatifloxacin experimental plasma profiles in rats were adequately fitted to a two-compartment model after intravenous and to a one compartment model with first order absorption after oral dosing. The total clearance (0.9 ± 0.2 and 1.0 ± 0.3 L/h/kg), the terminal half-life (3.3 ± 0.8 and 3.7 ± 0.3 h) and the apparent volume of distribution (2.8 ± 0.4 and 3.1 ± 1.0 L/kg) were statistically similar (α = 0.05) after i.v. and oral administration, by both model independent and compartmental approaches. The area under the curve was reduced after oral dosing (4.1 ± 1.6 μg.h/mL) in comparison to i.v. dosing (6.6 ± 1.3 μg.h/mL) leading to an oral bioavailability of 31%. The absorption was fast, with a constant rate of 5.0 ± 1.8 h-1. The results evidenced the linear pharmacokinetics of gatifloxacin in rodents in the dose range investigated; iii) Microdialysis recoveries determined in vitro by EE and RD at 80, 160 and 400 ng/mL resulted in 33.5 ± 1.3%, 33.1 ± 1.2%, 31.8 ± 2.7% and 31.4 ± 2.6%, 33.1 ± 2.2%, 30.6 ± 3.3%, respectively. In vivo recovery by RD in Wistar rat’s skeletal muscle and lung were 29.1 ± 1.0% and 30.7 ± 1.4%, respectively. Recoveries by no-net-flux in vitro and in vivo resulted in recoveries of 30.9 ± 2.9% and 29.0 ± 0.8%, respectively. In this way, it was shown that gatifloxacin recovery was constant and independent of the method or media used. Free skeletal muscle, lung and plasma profiles were virtually superimposed after i.v. administration of gatifloxacin 6 mg/kg dose resulting in similar area under the curve of 3888 ± 734 ng.h/mL, 4138 ± 1071 ng.h/mL and 3805 ± 577 ng.h/mL, respectively (α = 0.05). The tissue distribution factors were determined to be 1.02 and 1.08 for muscle and lung, respectively; iv) The PK/PD model used was able to describe the effect of levofloxacin and gatifloxacin against Streptococcus pneumoniae in vitro for all the regimens investigated. Levofloxacin EC50 (3.57 ± 2.16 mg/L) was higher than gatifloxacin (0.95 ± 0.56 mg/L) when multiple dosing regimens where simulated. Using constant concentrations, levofloxacin EC50 was also higher than gatifloxacin (EC50,levofloxacin = 2.75 ± 0.45 mg/L; EC50,gatifloxacin = 1.03 ± 0.52 mg/L). The kmax was statistically similar for both drugs independent of whether fluctuating (kmax,levofloxacin = 0.40 ± 0.19 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.48 ± 0.15 h-1) or constant concentrations (kmax,levofloxacin = 0.34 ± 0.06 h-1; kmax,gatifloxacin = 0.39 ± 0.23 h-1) were simulated. None of the PK/PD indices was capable of predicting the infection outcome for all the situations investigated. The PK/PD model developed allowed not only the comparison between the fluoroquinolones effect but also the comparison of different dosing regimes for the same drug and can be used for simulating alternative regimens and optimizing therapy of these drugs to treat community-acquired pneumonia.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito bactericida in vitro das fluoroquinolonas levofloxacino (LEV) e moxifloxacino (MXF)contra Escherichia coli, baseando-se em dados in vivo de concentração livre prostática. Métodos: Ratos Wistar machos foram utilizados nos experimentos in vivo para determinação da farmacocinética plasmática e prostática do LEV (7 mg/kg) e MXF (6 e 12 mg/kg) após dose i.v. bolus. As concentrações livres prostáticas foram determinadas por microdiálise. A coleta das amostras de plasma e dialisado de tecido foi realizada simultaneamente nos animais previamente anestesiados com uretano para determinação do fator de distribuição tecidual (fT). Para a quantificação do LEV e MXF nas amostras de plasma e dialisado, métodos analíticos foram validados. Análise farmacocinética não-compartimental e modelagem compartimental dos dados foram realizadas utilizando o WinNonlin® e NONMEM® v. 6, respectivamente. Os experimentos de farmacodinâmica in vitro foram executados utilizando sistema composto de caldo de cultura Mueller-Hinton no qual a bactéria teste (Escherichia coli ATCC 25922) foi exposta a concentrações constantes e flutuantes dos antimicrobianos. O número de colônias bacterianas viáveis (CFU/mL) foi determinado em função do tempo e utilizado como parâmetro farmacodinâmico para construção das curvas de morte bacteriana (time-kill curves). Nos experimentos de time-kill curves estáticos, concentrações baseadas em múltiplos da MIC na faixa de 0.008–2 mg/L foram utilizadas, enquanto que no dinâmico a meia-vida de eliminação do LEV em humanos foi simulada no sistema in vitro através de diluição constante do caldo de cultura. Resultados e Discussão: Um método analítico por HPLC-fluorescência foi desenvolvido e validado para a quantificação do MXF nas amostras biológicas. Método analítico também foi validado para quantificação do LEV nas amostras. Os perfis plasmáticos e teciduais das duas fluoroquinolonas foram modelados simultaneamente utilizando modelo de três compartimentos considerando transporte linear (difusão passiva) e saturável (cinética de Michaelis-Menten). O modelo, que foi o mais adequado para descrever os dados experimentais, sugere a presença de transportadores de efluxo na próstata. A penetração prostática média do MXF foi significativamente maior que a do LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) e foi independente da dose. Em ratos, não foi observada diferença na meia-vida plasmática média entre LEV (5.0 h) e MXF (4.9 h), embora a meia-vida tecidual foi ligeiramente maior para o MXF (3.3 vs. 2.3 h). Usando a abordagem populacional de modelagem PK/PD, modelo de Emax sigmoidal foi utilizado para descrever o efeito das duas quinolonas frente a E. coli tanto nos experimentos de concentração estática quanto dinâmica. A comparação dos parâmetros PK/PD estimados mostrou que o MXF apresenta potência superior ao LEV contra a cepa através da comparação dos valores de EC50, embora ambos tenham apresentado eficácia comparável (Emax de 1.85 e 1.83 h-1 para MXF e LEV, respectivamente). Para o LEV, os esquemas posológicos de 500 mg q12 h e 1000 mg q24 h apresentaram maior eficácia no período de 24 h, pois promoveram a inibição completa do recrescimento bacteriano observado nos outros dois regimes de dose testados. Conclusões: A correlação dos dados de farmacocinéticain vivo com os experimentos de farmacodinâmica in vitro, seguida da construção do modelo PK/PD de efeito máximo, possibilitou explorar a relação do efeito antimicrobiano em função do tempo baseada em concentrações livres esperadas na prostatite. / Objective: The aim of this study was to develop a pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model to describe the in vitro bactericidal effect of the fluoroquinolones levofloxacin (LEV) and moxifloxacin (MXF) against Escherichia coli based on free concentrations in prostate tissue measured in vivo. Methods: Pharmacokinetic experiments were conducted in male Wistar rats for the determination of plasma and free prostate concentrations of LEV (7 mg/kg) and MXF (6 and 12 mg/kg) after i.v. bolus administration. Blood and tissue dialysate samples were collected simultaneously in the group of rats previously anesthetized with urethane to determine the tissue distribution factor (fT). To quantify MXF and LEV in plasma and dialysate samples obtained after administration of the quinolones, analytical methods based on HPLC-fluorescence were developed and validated accordingly. Non-compartmental analysis and compartmental PK modeling of the data was performed in WinNonlin® and NONMEM® v. 6, respectively. The in vitro pharmacodynamic experiments were executed by using a system composed of Mueller-Hinton growth medium in which the test bacterial strain (Escherichia coli ATCC 25922) was exposed to constant and fluctuating antimicrobial concentrations. The number of viable colony-forming units (CFU/mL) was determined as a function of time and used as the pharmacodynamic parameter for construction of bacterial time-kill curves. In the static time-kill curves, concentrations in the range of 0.008-2 mg/L were tested based on multiples of the MIC, whereas in the dynamic time-kill curves the half-life of LEV in humans was simulated in the in vitro system by stepwise dilution of the growth medium. Results and Discussion: An HPLC-fluorescence method was developed and fully validated to quantify MXF in biological fluids. A method was also validated to determine LEV in the samples. Plasma and prostate concentrations of both drugs were simultaneously fitted using a three-compartment model considering linear (passive diffusion) and saturable transport (Michaelis-Menten kinetics), suggesting the presence of efflux transporters in the prostate. The average tissue penetration of MXF in the prostate was significantly higher than that of LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) and was independent of the dose. In rats, differences in average plasma half-life between plasma LEV (5.0 h) and MXF (4.9 h) were not observed, even though the tissue half-life was slightly longer for MXF (3.3 vs. 2.3 h). Using a population PK/PD modeling approach, a sigmoidal Emax model was used to describe the effect of the two quinolones against E. coli both in the static as well as in the dynamic time-kill curves. Comparison of the PK/PD parameter estimates showed that the in vitro potency of MXF is higher than LEV against the strain tested as shown by EC50 values, but both presented equivalent efficacy (Emax of 1.85 and 1.83 h-1 for MXF and LEV, respectively). For LEV, the dosing regimens of 500 mg q12 h and 1,000 mg q24 h showed overall greater efficacy over the 24 h period as they resulted in complete inhibition of bacterial regrowth observed in the other two dosing regimens tested. Conclusions: The correlation of in vivo pharmacokinetic data with in vitro pharmacodynamic experiments, followed by the development of an Emax PK/PD model, allowed determining the relationship between the bactericidal effect as a function of time based on free tissue concentrations expected in the site of infection.

Introdução: A sepse é a maior causa de morbidade e mortalidade em pacientes queimados, uma vez que profundas alterações ocorrem na farmacocinética de agentes antimicrobianos prescritos para o controle das infecções. Além disso, pacientes queimados podem apresentar quadro de infecção por germes da comunidade, numa fase precoce de internação na UTI, e devem receber antimicrobianos que diferem daqueles indicados na sepse. Na vigência de infecção fúngica, o quadro se torna ainda mais grave para os pacientes queimados de prolongada internação e imunocomprometidos. Objetivo: Realizar o monitoramento plasmático de oito antimicrobianos largamente prescritos na UTI, a investigação da farmacocinética e a modelagem PK-PD para o ajuste do regime de dose e controle das infecções em pacientes queimados. Casuística: Investigaram-se 32 pacientes queimados internados na UTI/Unidade de Queimados - Divisão de Cirurgia Plástica do HC FMUSP, portadores de infecção recebendo pela via sistêmica sete antimicrobianos e um antifúngico. Métodos- Etapa Clinica: Os pacientes receberam os antimicrobianos geralmente em associação para o controle das infecções seguindo as recomendações da CCIH do hospital relativas ao regime de dose empírica inicial do controle de infecção na UTI de Queimados, na fase precoce e tardia da internação. Realizou-se o monitoramento plasmático do fluconazol, para a infecção fúngica, e dos sete antimicrobianos mais prescritos na UTI para os germes da comunidade e hospitalares (cefepime, ciprofloxacino, imipenem, oxacilina, piperacilina, sulfametoxazol e vancomicina) através das coletas de amostras sanguíneas de pico (termino da infusão) e vale (imediatamente antes da dose subseqüente). Complementarmente, a critério Clínico, foram colhidas amostras seriadas de sangue (pico, 1ª, 2ª, 4ª, 6ª e vale), totalizando seis coletas, para investigação da farmacocinética do agente que requereu ajuste de dose e individualização de terapia no paciente queimado. As coletas de sangue foram realizadas através de cateter venoso (2mL/coleta em tubos contendo EDTA sódico) pelo médico intensivista de plantão na UTI; o plasma foi obtido pela centrifugação para análise do fármaco de interesse ou então armazenado no congelador (-80o C) até o ensaio. Métodos - Etapa Analítica: Previamente à realização da Etapa Clínica, foi realizado no Laboratório o desenvolvimento, validação e otimização de método bioanalítico para quantificação dos oito antimicrobianos no plasma. Preferencialmente, as análises foram realizadas no dia da coleta de sangue do paciente, e o \"Laudo de Exame\" contendo os resultados foi expedido no mesmo dia ou na manhã do dia subseqüente possibilitando a intervenção precoce da Equipe Clínica e se necessária a substituição do regime empírico pela terapia individualizada dose ajustada. Métodos- Etapa estatística: A estatística propriamente dita foi realizada pelo tratamento estatístico com utilização do software GraphPad Instat 4.0., GraphPad Prism 4.0, pela utilização de testes paramétricos e não paramétricos. A modelagem farmacocinética foi realizada através da aplicação do software NonCompartmental Analysis, PK Solutions 2.0, aos pares de dados (C vs T) para cada antimicrobiano. Adicionalmente, aplicou-se o software GraphPad Prism 4.0 para a modelagem PK-PD, ferramenta importante na tomada de decisão relativa à alteração do regime empírico dos antimicrobianos. Resultados: Os pacientes queimados incluídos no protocolo eram adultos de ambos os sexos 23F/9M, 39,6 anos, 69,5 kg, 33,9% SCQ, e os agentes da queimadura foram para 27 pacientes/ térmico-fogo e para três pacientes/trauma elétrico; a lesão inalatória foi registrada em 11/32 pacientes. Foram realizados 303 seguimentos farmacoterapêuticos com a emissão de laudos de exame para os antimicrobianos prescritos aos pacientes nas fases precoce e tardia da internação. O ajuste de dose foi requerido para a vancomicina em 88% das solicitações de exame, cefepime (65%), sulfametozaxol (52%), fluconazol (74%) e imipenem (19%). Registrou-se alta variabilidade na farmacocinética para todos os antimicrobianos investigados. Adicionalmente, registrou-se alteração significativa dos parâmetros farmacocinéticos do imipenem, fluconazol, sulfametoxazol e vancomicina nos seguimentos de pacientes queimados com disfunção renal dialítica relativamente aqueles em que se registrou função renal preservada. A modelagem PK-PD para os diversos antimicrobianos se baseou nos parâmetros de predição de eficácia recomendados tais como o intervalo de tempo em que a concentração plasmática permaneceu acima da concentração inibitória mínima (%Δ T> CIM) para o cefepime, imipenem, oxacilina e piperacilina, ASCss0-24/CIM + Cssmax/CIM para o ciprofloxacino, ASCss0-24/CIM para o fluconazol e para a vancomicina e ASCss0-24/CIM +%Δ T> CIM para a sulfametoxazol. Conclusões: Registrou-se alta variabilidade na farmacocinética dos agentes investigados e a modelagem PK-PD justificou plenamente a substituição da terapia empírica inicial pela dose ajustada para a cobertura dos germes sensíveis, daqueles apresentando sensibilidade dose dependente ao antimicrobiano, além daqueles com alto CIM, pouco sensíveis as doses usuais. Finalmente, a modelagem PK-PD mostrou-se definitiva e ferramenta indispensável na manutenção desses agentes no arsenal terapêutico, garantindo terapia eficaz ao paciente queimado, evitando a emergência bacteriana e o desenvolvimento de resistência. / Introduction: Sepsis is a main cause of morbidity and mortality in burn patients, once pharmacokinetics of antimicrobials prescribed for the control of infections are significantly altered in those patients. In addition, burn patients in the ICU, initially can present infections by community microbial and must receive different antimicrobials than those prescribed for sepsis. On the other hand, burn immunocompromized patients with prolonged staying in the ICU, re-incidence of sepsis and fungal infection requires an effective antifungal agent that must be associated to the antimicrobials prescription. Objective: Therapeutic plasma monitoring of eight antimicrobials largely prescribed to burn patients from the ICU, Pharmacokinetic and PK-PD modeling for dose adjustment and for the control of infections. Study design: Thirty two burn inpatients with infections from the ICU Burns- Division of Plastic Surgery of Clinics Hospital Medical School University of Sao Paulo received systemically antimicrobials/ antifungal agents. Methods - Clinical Procedures: In general burn patients received several antimicrobial agents as recommended by the Control of Hospital Infection Committee as empirical dose at the beginning of therapy and also afterwards in the ICU. The control of infections by community microbials or yet by hospital microbials, and also for fungal infection, was performed by drug plasma monitoring of cefepime, ciprofloxacin, imipenem, oxacillin, piperacillin, sulphamethoxazole, vancomycin and fluconazole after blood sample collection at the peak and at the trough. Complementary, usually by clinical criteria, six blood sample collections were performed at time dose interval (end of drug infusion, 1st, 2nd, 4th, 6th and at the trough) for pharmacokinetic purposes, dose adjustment and individualization of drug therapy for burn patients. Blood sample collection was done by the physician from the ICU by venous catheter (2mL/each into blood collection tubes sodium EDTA); plasma obtained by centrifugation of blood tubes were analyzed in the same day or in a deep freezer to storage (-80o C) until assay. Methods - Analytical Procedures: Previously to the clinical study, in the Laboratory School of Pharmaceutical Sciences was performed the development, validation and optimization of bioanalytical methods for drug plasma monitoring of eight antimicrobial/antifungal agents by HPLC-UV. Drug measurements were performed on the day of blood collection and data were preferentially informed to the physician at the same day or at the early morning of the following day to facilitate the therapeutic intervention and changes on the morning prescription to guarantee drug efficacy. Methods Statistics Procedures: Descriptive statistics was performed by applying the software GraphPad Instat v 4.0., GraphPad Prism v.4.0 by parametric and non parametric tests. Pharmacokinetics was estimated by applying the software NonCompartmental Analysis, PK Solutions 2.0, to data (C vs T) for each antimicrobial agent. Additionally, the software GraphPad Prism v 4.0 was applied to PK-PD modeling, an important tool related to dilemma decision about changes on empirical dose of an antimicrobial agent and obviously helps the physician in the rationalization of drug therapy in severe burns. Results: Burn patients included in the protocol were of both genders 23F/9M, 39.6 yrs, 69.5 kg, 33.9% TBSA; agents of the accident were fire/ alcohol for 27 patients and electrical trauma for three patients; inhalation injury were described for 11/32 patients. Approximately 1500 drug plasma measurements for all antimicrobials prescribed to burn patients for the control of infection in the ICU were performed totalizing 303 follow up for pharmacokinetic purposes during the period in the ICU for 32 burn patients. Dose adjustment was required in 88% of vancomycin prescription, 65% for cefepime, 52% for sulphamethoxazole, 74% for fluconazole e 19% for imipenem. High pharmacokinetic variability was registered for all agents investigated. In addition, significant changes on pharmacokinetic parameters were described for imipenem, fluconazole, sulphamethoxazole and vancomycin for burn patients with dialytic renal dysfunction compared to those with renal function preserved. PK-PD modeling applied to antimicrobials investigated in the present study was based on predictive parameters recommended like time interval to maintain drug plasma concentration higher than the minimum effective concentration (%Δ T> MIC) for cefepime and also for imipenem, oxacillin and piperacillin; AUCss0-24/MIC plus Cssmax/MIC for ciprofloxacin, AUCss0-24/MIC for fluconazole and vancomycin, and finally, AUCss0-24/MIC plus %Δ T> MIC for sulphamethoxazole. Conclusions: High pharmacokinetic variability was obtained for all investigated agents. PK-PD modeling applied could justify definitively the antimicrobial therapy dose adjustment instead the empirical dose regimen. Then, drug efficacy was guaranteed against susceptible microbial, spreading to susceptible to antimicrobial dose dependent and also those presenting high value for MIC related to microbial resistance to empiric dose regimen. In conclusion, it was demonstrated that PK-PD modeling of antimicrobials with basis on predictive drug efficacy parameter is definitively an important tool to preserve and safeguard these agents for the control of severe infection in burn patients, to avoid the bacterial emergency and microbial resistance.