Cette thèse est dédiée à la conception de synthons entrelacés pour la préparation efficace de machines moléculaires pH-sensible de type rotaxane et de rotaxanes dénués de site de reconnaissance. Bien que la stratégie dirigée par l’effet « template » ait été employée très fréquemment et avec succès à ce jour, elle ne mène dans la plupart des cas qu’à des composés entrelacés qui contiennent les sites d’interactions nécessaires à la reconnaissance préalable des éléments moléculaires à assembler. Pour remédier à cette limitation, une nouvelle voie d’accès directe utilisant des synthons entrelacées pour la préparation de machines moléculaires de type rotaxanes et de rotaxanes dénués de site d’interaction fort a été étudié. Dans un premier temps, des « briques moléculaires » [2]rotaxanes isolables, bien qu’activées, ont été obtenus par une stratégie de glissement. Dans le but de les convertir aisément en machines moléculaires, les paramètres cinétiques et thermodynamiques relatifs au processus d’entrelacement ont été déterminés et ont permis de juger de l’importance de la nature et de l’orientation des pseudo-bouchons sur la cinétique d’entrelacement, ainsi que du rôle primordial du degré de liberté conformationnel de l’axe moléculaire sur la vitesse de formation des rotaxanes. Par la suite, les synthons entrelacées activés sous forme d’ester actif (ester de NHS isolable) sont utilisées dans la préparation de différentes machines moléculaires possédant une station moléculaire principale ammonium et une station moléculaire secondaire triazolium ou amide (secondaire ou tertiaire). D’autres synthons entrelacés qui différent par l’orientation du motif NHS sont utilisé comme transporteurs d’éther couronne pour permettre la préparation de rotaxanes dénués de site d’interaction fort. Enfin, dans la continuité des travaux réalisés au laboratoire sur le contrôle de la conformation chaise d’un mannosyl par une machinerie moléculaire, de nouvelles navettes pH-sensible de type glyco[2]rotaxanes contenant toutes une station moléculaire principale anilinium, et qui différent des machines précédentes par la deuxième station pyridinium, ont été obtenus et étudiés. / This thesis is dedicated to the synthesis of interlocked synthons for the efficient preparation of pH-sensitive rotaxane molecular machines and rotaxanes devoid of recognition site. Although the strategy directed by the "template" effect has been used very frequently and successfully so far, in most cases it only leads to interlocked compounds that contain the interaction sites necessary for prior recognition molecular elements to assemble. To overcome this limitation, a new direct access using interlocked synthons for the preparation of molecular machines of the rotaxane and rotaxane type devoid of strong interaction sites has been studied. Firstly, isolable [2]rotaxane "building block", although activated, were obtained by a slipping strategy. In order to easily convert them into molecular machines, the kinetic and thermodynamic parameters relating to the slipping process were determined and made it possible to judge the importance of the nature and orientation of the pseudo-stopper on the kinetics of slipping, as well as the primordial role of the degree of conformational freedom of the molecular axis on the speed of formation of rotaxanes. Subsequently, the activated ester (NHS isolatable ester) interlocked synthon are used in the preparation of different molecular machines having a main ammonium molecular station and a secondary molecular triazolium or amide station (secondary or tertiary). Other interlocked synthons that differ in the orientation of the NHS motif are used as crown ether transporters to enable the preparation of rotaxanes devoid strong interaction sites. Finally, in the continuity of the work carried out in the laboratory on the control of the chair conformation of a mannosyl by a molecular machinery, new pH-sensitive shuttles of glyco[2]rotaxane containing a main molecular station anilinium, and which different previous machines by the second station pyridinium, were obtained and studied.

La compréhension des processus amenant à la formation d'étoiles depuis la phase dense du milieu interstellaire est possible via l'observation des molécules. Celles--ci nous permettent de contraindre, par l'intermédiaire d'une modélisation de leur émission, les conditions physiques, dynamiques et chimiques présentes dans les nuages au cours des différents stades de l'effondrement. Les milieux sondés lors de ce type d'étude correspondent, pour la plupart des molécules, à des conditions pour lesquelles le peuplement des niveaux d'énergie s'effectue hors équilibre thermodynamique. L'analyse du rayonnement nécessite alors des données de physique microscopique dont la précision influence fortement la description des régions modélisées. C'est dans ce contexte que s'inscrit le travail effectué durant cette thèse: celui-ci a porté, d'une part, sur la détermination de constantes de vitesses de collision pour les molécules N2H+ et H2O et d'autre part, sur l'interprétation de spectres observés pour ces molécules dans des régions de formation d'étoiles. La première de ces molécules, N2H+, constitue un excellent traceur des régions denses des nuages froids et la seconde, H2O, est la troisième espèce moléculaire la plus abondante dans les régions de formation d'étoiles massives ou de faibles masses et constituera le principal objectif du satellite Herschel. Pour la molécule N2H+, des constantes de vitesse de collision concernant la structure hyperfine ont été obtenues pour les niveaux hyperfins associés aux 7 premiers niveaux rotationnels et pour la gamme de température T=5-50 K. Pour cela, la dynamique collisionnelle a été etudiée avec une approche quantique indépendante du temps où la structure hyperfine est introduite via une méthode de recouplage. Ces données ont ensuite été utilisées afin d'interpréter l'émission observée dans un échantillon de nuages pré-protostellaires. En particulier, différentes approches ont été envisagées afin de traiter la résolution des équations d'équilibre statistique ce qui a permis de dégager les influences respectives qu'ont les taux de collision, le couplage radiatif et la structure en densité et température de la source sur les rapports d'intensité des transitions hyperfines associées à la transition j=1-0. Concernant H2O, l'objectif de ce travail est d'une part, de réactualiser les constantes de vitesse de collision du système H2O-H2, en se basant sur une surface d'énergie potentielle (SEP) récemment calculée et dont la précision est supérieure à celle qui a précédemment été utilisée. Ceci a tout d'abord permis une comparaison visant à établir la sensibilité des constantes de vitesse de collision à différents paramètres de la SEP. Ensuite, nous nous sommes intéressés à la détermination des paramètres d'élargissement de raies par collisions, en se basant sur l'approximation d'impact. L'intérêt de cette dernière étude est double: d'une part, ces données sont nécessaires à l'étude des atmosphères planétaires et d'autre part, par l'intermédiaire d'une confrontation entre résultats théoriques et données expérimentales, celle--ci nous donne une estimation de la qualité de la SEP et des données qui en sont issues. Finalement, en parallèle à ce travail, il a été effectué une analyse de l'émission de H2O observée dans la nébuleuse de Kleimann-Low dans Orion. A partir de données obtenues avec le satellite ISO, il a alors été possible de contraindre les conditions physiques de la source ainsi que la répartition spatiale de l'abondance de l'eau.

La Spectrométrie de Masse à source Plasma à Couplage Inductif s'impose, de par ses multiples avantages, dont sa sensibilité et ses temps d'analyse réduits, comme la technique de spectrométrie de masse la plus répandue en analyse inorganique pour déterminer la concentration d'un isotope donné ou mesurer des rapports isotopiques. Le problème des interférences spectroscopiques, inhérent à cette technique, trouve une solution dans l'utilisation de dispositifs de collision-réaction. Une résolution in situ des interférences est en effet rendue possible par l'injection, dans la cellule de collision-réaction, d'un gaz judicieusement choisi. Les étapes de séparation chimiques, habituellement réalisées en amont de la mesure, et très pénalisantes dès lors que les échantillons manipulés sont radioactifs, peuvent ainsi être supprimées. La compréhension de la chimie des interactions « ions-molécules » en phase gazeuse est cependant primordiale pour optimiser l'efficacité de tels dispositifs. Pour cela, une connaissance précise des conditions expérimentales dans la zone de réaction s'avère cruciale, afin de pouvoir interpréter les réactivités observées.<br /><br />Deux ICP-MS de conception différente, l'ICP-MS Quadripolaire X7 (Thermo-Fisher Scientific) et l'ICP-MS Multi-Collection Isoprobe (GV Instruments), sont utilisés dans cette étude. Les conditions expérimentales, existant dans la cellule de collision-réaction de chacun de ces deux instruments, sont déterminées en fonction des paramètres instrumentaux. Cette étude préliminaire est ensuite mise à profit dans le cadre de la résolution de deux interférences, caractéristiques au domaine du nucléaire. Une approche théorique par calculs de chimie quantique permet d'interpréter la formation des oxydes de zirconium, responsable de la suppression de l'ion interférent 90Zr+, suite à l'utilisation d'O2 dans la cellule de collision-réaction pour permettre la mesure du radionucélide 90Sr. Le cas de la réactivité de cinq cations lanthanides (Nd, Sm, Eu, Gd, Dy) avec plusieurs gaz (O2, N2O, CO2, NH3) est par ailleurs étudié expérimentalement. L'efficacité de l'ammoniaque pour résoudre les interférences isobariques Eu/Gd est mise en évidence. Une périodicité de la réactivité sur la série des lanthanides, due à la configuration électronique de l'état fondamental des cations Ln+, est proposée pour expliquer les différences de comportements observées.

Dans cette thèse, nous avons étudié les aspects mécanique et thermodynamique de la recombinaison homologue, un processus crucial de réparation de l'ADN. Des travaux préliminaires d'observation de molécules d'ADN étirées lors de la recombinaison homologue ont mis à jour la complexité de ce processus et la difficulté de l'observer en fluorescence. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique appelée "pinces magnétiques sensibles au couple" nous permettant de maintenir une molécule unique d'ADN avec une force et un couple connus tout en mesurant son état de torsion avec une résolution de quelques degrés. Nous avons ainsi montré de manière directe que la polymérisation de la recombinase hRad51 a lieu par ajout de monomères chacun déroulant l'ADN de 65° en moyenne. Nous avons également été capables de mesurer le couple d'arrêt de la polymérisation. Une modélisation mécano-chimique nous a finalement permis d'évaluer le potentiel chimique de la polymérisation, en bon accord avec les données biochimiques existantes.

Ce travail présente tout d'abord l'étude, à l'échelle de la molécule individuelle, de l'intermédiaire<br />de recombinaison formé par l'échange de simples brins entre deux molécules d'ADN homologues : la<br />jonction de Holliday.<br />Nous montrons tout d'abord qu'il est possible, à partir d'un ADN portant une séquence entièrement<br />palindromique, de former une jonction de Holliday en appliquant une torsion négative. Une fois<br />la jonction formée, la torsion permet également de contrôler de façon directe l'échange des simples brins.<br />Cette technique nous a permis d'accéder expérimentalement, avec une très bonne précision, à la valeur<br />en solution du pas hélicoïdal de l'ADN : 3.61 ± 0.03 nm/tr.<br />Ensuite nous avons étudié, en présence d'ions magnésium, la cinétique de migration de la jonction<br />de Holliday sous l'influence des contraintes mécaniques. Une modélisation simple du comportement<br />de la jonction de Holliday vis-à-vis des contraintes mécaniques a été développée permettant d'expliquer<br />leur influence sur le mécanisme de migration.<br />L'échange des simples brins peut également être catalysé par certaines enzymes. Le travail<br />mécanique développé au cours de cette activité catalytique fait de ces enzymes des moteurs moléculaires.<br />La seconde partie de ce travail porte sur l'étude en molécule unique d'un tel moteur : le complexe RuvAB<br />de la bactérie Escherichia coli.<br />Nous avons tout d'abord caractérisé la migration de jonctions de Holliday individuelles sous<br />l'action du complexe RuvAB. Nous avons notamment montré la très grande processivité du complexe et<br />nous avons pu estimer la vitesse de migration à 37◦C et en présence d'1 mM d'ATP : ∼ 43 paires de<br />bases échangées par seconde.<br />D'autre part, et pour finir, nous avons mis en évidence le rôle catalytique de la sous-unité RuvA<br />dans l'échange des paires de bases au niveau du point de branchement.

Cette thèse s'inscrit dans la recherche des propriétés mécaniques de la fibre de chromatine et de leur rôle. Après un rappel de connaissances sur la chromatine, nous introduisons les techniques de manipulations de molécules uniques en biophysique. Nous esposons ensuite le dispositif de pince optique que nous avons mis en œuvre ainsi que les développements plus récents de manipulations à l'aide d'un champ magnétique rotatif.<br />Nous discutons alors des résultats obtenus sur la transition B-S de l'ADN et tentons de les interpréter en invoquant une différence de comportement sous étirement selon que la séquence est riche en A-T ou en G-C. <br />Les résultats des étirements sur trois principaux types de chromatine sont ensuite présentés : force nécessaire à la rupture d'un nucléosome et longueur d'ADN libérée. En faisant varier les conditions d'étirements (essentiellement concentrations salines et concentrations en chromatine exogène), en modifiant la composition de la fibre de chromatine, nous montrons que le nucléosome n'est pas une entité stable dans les conditions diluées classique des expériences sur molécules uniques. Nous confirmons par ailleurs ce résultats avec des expériences de dilution suivit d'analyse sur gel d'électrophorèse. Les résultats établis après stabilisation nous invitent à poursuivre la discussion du déroulement du nucléosome sous tension à partir d'un modèle existant. Sur la base de ces résultats, nous tentons alors de donner une interprétation du déroulement du nucléosome que nous recadrons dans le contexte de la régulation génétique à l'échelle du nucléofilament.

De nombreuses protéines doivent localiser de courtes séquences-cibles sur de longues molécules d'ADN. Le temps nécessaire à cette localisation est souvent beaucoup plus court que celui qui résulterait d'une diffusion 3D des protéines. Plusieurs mécanismes ont été suggérés pour rendre compte de l'efficacité remarquable du processus de localisation (diffusion 1D le long de l'ADN, sauts...). Cependant, malgré les nombreuses études menées par des biochimistes depuis plus de vingt ans, en particulier sur les enzymes de restriction EcoRI et EcoRV, à ce jour aucune expérience n'a pu trancher définitivement entre les différents mécanismes proposés.<br /><br />Au cours de cette thèse, nous sommes parvenus à observer en microscopie de fluorescence l'interaction entre une enzyme de restriction EcoRV individuelle et une molécule d'ADN. Pour cela, nous avons développé une technique permettant d'étirer les molécules d'ADN au-dessus d'une surface, et nous avons couplé les enzymes EcoRV à des nanocristaux semi-conducteurs, sondes très fluorescentes non sujettes au photoblanchiment. Les enzymes ainsi marquées, toujours actives, sont détectables avec une résolution spatiale de l'ordre de 10 nm et une résolution temporelle de 20 ms.<br /><br />Nous avons observé de nombreux événements d'association/dissociation d'enzymes sur les molécules d'ADN étirées. L'analyse de ces événements nous a permis de mesurer la constante de dissociation des enzymes couplées, de mettre en évidence une diffusion facilitée d'EcoRV le long de l'ADN et d'estimer les caractéristiques de cette diffusion.

Deux études distinctes mettant en oeuvre la détection et l'analyse de signaux spectroscopiques optiques de molécules individuelles- colorants ou molécules organiques- ont été menées.<br />Par microscopie grand champ de fluorescence, l'émission de molécules uniques de pérylène orange insérées dans un film solgel mince, par enregistrement de films d'une large zone de l'échantillon sur laquelle plus d'une centaine d'émetteurs individuels sont détectés, fournit des informations sur cette espèce et la matrice sondée. Pour exploiter les films, un outil logiciel a été développé. Les processus de photoblanchiment, la mobilité moléculaire, la nucléation des molécules excitées sont mis en évidence et discutés. On note une grande richesse des dynamiques temporelles d'émission, mais aussi des spectres qui reflètent notamment la reconformation proposée du pérylène orange excité. Il s'ensuit l'existence de nombreux nanoenvironnements différents dans la matrice poreuse.<br />Par microscopie confocale à balayage, le signal de diffusion Raman exaltée de surface de molécules uniques organique adsorbées sur des agrégats d'argent de morphologie complexe est exploité. Certains objets présentent une exaltation géante, estimée être de plus de 14 ordres de grandeur, ce qui permet l'enregistrement de spectres résolus en seulement une seconde. L'analyse chimique offerte permet de distinguer différentes espèces, et la présence nécessaire sur ces points chauds d'Ag+ est démontrée. Une caractérisation corrélée par microscopie électronique des agrégats actifs repérés met aussi en avant l'existence d'une morphologie privilégiée, avec de nombreuses protubérances de dimension nanométrique et interstices.

L'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique d'imagerie médicale largement répandue dans les milieux hospitaliers pour le diagnostic de pathologies. Elle repose classiquement sur la détection du proton (IRM 1H) et permet de visualiser des tissus en profondeur avec une très bonne résolution temporelle et spatiale. Cependant, cette méthode souffre encore de sa faible sensibilité. Une des solutions consiste en l'introduction et la détection de xénon hyperpolarisé. En effet, le xénon est un gaz non toxique, très sensible à son environnement chimique et adapté pour l'IRM. Cependant, il n'est spécifique d'aucun récepteur biologique et nécessite des molécules particulièrement adaptées pour son encapsulation. La détection de cibles spécifiques se fait par des biosondes constituées de molécules cages fonctionnalisées par une antenne de reconnaissance d'un récepteur spécifique. Le xénon vient s'encapsuler dans cette molécule hôte et permet la localisation de la cible biologique. Parmi les molécules cages répertoriées dans la littérature, les cryptophanes présentent la plus forte affinité connue pour le xénon et sont donc les plus prometteuses. Les cryptophanes sont constitués de deux unités de type cyclotribenzylène reliées entre elles par trois chaînes pontantes. Ils ont été synthétisés pour la première fois par l'équipe d'A. Collet au Collège de France au début des années 1980. L'objectif de cette thèse a été de synthétiser et de fonctionnaliser de nouveaux cryptophanes.

Ce travail porte sur l'étude de la fidélité de la traduction chez les eucaryotes d'un point de vue mécanistique et génomique. Au cours de ma thèse j'ai développé trois approches :Le premier projet porte sur l'étude du rôle du facteur de l'élongation eEF2 dans le maintien du cadre de lecture. La stratégie associe une mutagénèse aléatoire du gène EFT2 à un criblage phénotypique, elle permet d'isoler des mutants capables d'augmenter ou diminuer l'efficacité de recodage d'une séquence de décalage du cadre de lecture en -1.Le second projet décrit la mise au point d'un système de traduction en molécule unique qui permet d'étudier le ribosome eucaryote. La traduction est initiée grâce à l'IRES CrPV qui a pour caractéristique d'être totalement indépendante des facteurs d'initiation et de l'ARNt initiateur. L'élongation de la traduction est détectée grâce au départ d'un oligonucléotide fluorescent qui est décroché par l'activité hélicase du ribosome. Les résultats de ces expériences constituent une preuve de principe démontrant que l'étude de la traduction eucaryote en molécule unique est possible.Le troisième projet est une étude de génomique comparative qui permet de rechercher des événements de recodage ainsi que d'autres événements non-conventionnels de la traduction dans le génome de la levure Saccharomyces cerevisiae. L'approche est basée sur une recherche d'organisations génomiques conservées au sein de 19 génomes de levures. Les gènes candidats sont testés in vivo grâce à un vecteur double rapporteur. Cette étude a permis de mettre en évidence le gène VOA1 qui a été ensuite caractérisé plus en détails.