Le microcèbe murin (Microcebus murinus) est un primate attirant l’attention de la recherche neuroscientifique. Son anatomie cérébrale est encore mal décrite et ses réseaux cérébraux n'ont jamais été étudiés. Le premier objectif de cette thèse était de développer de nouveaux outils menant à la création d’un atlas numérique 3D du cerveau du microcèbe. Cet atlas est un outil fondamental car pouvant être utilisé pour extraire automatiquement des biomarqueurs cérébraux de diverses neuropathologies. Par la suite, nous avons mis en place des protocoles IRM et informatiques pour analyser la connectivité neuronale du microcèbe murin. Nous avons évalué pour la première fois les réseaux cérébraux de cet animal et révélé que son cerveau est organisé en régions fonctionnelles intégrées dans des réseaux fonctionnels à plus grande échelle. Ces réseaux ont été classés et comparés à des réseaux similaires chez l'homme. Cette comparaison multi-espèces a mis en évidence des règles d'organisation communes mais aussi des divergences. L'imagerie du glutamate par transfert de saturation et par échange chimique (gluCEST) est une méthode permettant de créer des cartes 3D de la distribution du glutamate. Dans une troisième étude, nous avons comparé l’activité neuronale locale, la connectivité fonctionnelle et le contraste gluCEST dans diverses régions du cerveau. Nous avons ainsi mis en évidence différentes associations entre ces trois biomarqueurs. Enfin, l’impact du vieillissement sur la connectivité fonctionnelle, l’activité neuronale locale et le contraste gluCEST a été évalué en comparant deux cohortes de microcèbes murins. / The mouse lemur (Microcebus murinus) is a primate that has attracted attention within neuroscience research. Its cerebral anatomy is still poorly described and its cerebral networks have never been investigated. The first objective of this study was to develop new tools to create a 3D digital atlas of the brain of this model and to use this atlas to automatically follow-up brain characteristics in cohorts of animals. We then implemented protocols to analyze connectivity in mouse lemurs so we could evaluate for the first time the cerebral networks in this species. We revealed that the mouse lemur brain is organised in local functional regions integrated within large scale functional networks. These latter networks were classified and compared to large scale networks in humans. This multispecies comparison highlighted common organization rules but also discrepancies. Additionally, Chemical Exchange Saturation Transfer imaging of glutamate (gluCEST) is a method that allows the creation of 3D maps weighted by the glutamate distribution. In a third study, we compared local neuronal activity, functional connectivity and gluCEST contrast in various brain regions. We highlighted various associations between these three biomarkers. Lastly, the impact of aging on local neuronal activity, functional connectivity and gluCEST has been analyzed by comparing two cohorts of lemurs.

Les virus sont utilisés depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribué à l’avancement des connaissances de même qu’à l’établissement de préceptes importants encore valables aujourd’hui dans le domaine. L’un des défis actuels est de mieux définir les étapes menant à la transition d’une cellule normale à une cellule transformée et c’est sur cette problématique que nous nous sommes penchés. Pour ce faire, nous avons tiré profit de l’utilisation de l’antigène grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable d’induire des tumeurs chez les rongeurs. Cet oncogène viral à lui seul possède des propriétés intéressantes qui suggèrent que, en plus de l’immortalisation, il peut également contribuer aux événements précoces de la carcinogénèse. Ceci repose principalement sur la capacité de PyLT à induire des tumeurs en souris transgéniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggère que des événements supplémentaires sont nécessaires. Ainsi, l’utilisation de PyLT dans un modèle de culture cellulaire permet de disséquer les changements qui lui sont attribuables. Dans un premier temps, l’établissement du profil d'expression génique associé à l'expression de PyLT dans un modèle murin nous a permis de sélectionner un bon nombre de gènes, parmi lesquels figurait Necdin. Nous avons choisi d’étudier Necdin plus en détail puisque peu d’attention était accordée à cette protéine dans le domaine du cancer, malgré que différentes données de la littérature lui suggèrent à la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogéniques. Nous avons démontré que, malgré sa fonction proposée de suppresseur de croissance, l’expression de Necdin n’est pas incompatible avec la prolifération dans la lignée cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que l’inhibition de son expression par shARN confère un avantage prolifératif. Nous avons confirmé que Necdin est un gène cible de p53 induit par différents agents génotoxiques, toutefois son expression peut également être régulée de façon p53-indépendante. De plus, Necdin agit négativement sur l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’activation de p53. Ceci suggère que Necdin est impliqué dans une boucle de régulation négative de la voie de p53 et que l’augmentation anormale de l’expression de Necdin pourrait contribuer à la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53. L’activation de p53 permet l’arrêt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi impliquée dans l’établissement d’un arrêt permanent nommé sénescence. La sénescence est un mécanisme de protection contre l’accumulation de mutations qui peut contribuer à l’initiation du cancer. Vu l’intéressante implication de Necdin dans la régulation de l’activité de p53, nous avons transposé les connaissances acquises du modèle murin à un modèle humain, plus adapté pour l’étude de la sénescence. La caractérisation de l’expression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains à différents passages montre que les jeunes cellules en prolifération active expriment Necdin et que son niveau diminue avec l’établissement de la sénescence réplicative. Le même phénomène est observé lors de la sénescence prématurée provoquée par l’expression d’un oncogène et par l’exposition aux radiations ionisantes. De plus, dans des conditions normales de prolifération, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction n’affecte pas la durée de vie des cellules primaires. Toutefois, en condition de stress génotoxique dû à l’exposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin présentent une radiorésistance accrue de la même façon que lorsque p53 est inactivé directement. Ce résultat en cellules humaines vient appuyer l’effet observé dans les cellules de souris sur l’impact qu’aura le niveau de Necdin sur la réponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a été fait pour aborder de quelle façon nos résultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modèles de cancer chez l’humain. Nous avons caractérisé l’expression de Necdin dans deux types différents de cancer. D’abord, dans le cancer de l’ovaire, le niveau élevé de Necdin dans les tumeurs à faible potentiel de malignité (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de l’ovaire de type séreux suggère que l’expression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui présente généralement un p53 de type sauvage. Son expression est aussi retrouvée dans deux lignées cellulaires du cancer de l’ovaire non-tumorigéniques en xénogreffe de souris, dont l’une possède un p53 fonctionnel. De plus, la caractérisation de Necdin dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate suggère une relation entre son expression et la présence de p53 fonctionnel. Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de l’ovaire, Necdin semble être présent dans les lignées représentant un stade moins avancé de la maladie. L’utilisation de l’oncoprotéine virale PyLT nous a permis de révéler des propriétés intéressantes de Necdin. Nous proposons que dans certains contextes, l’expression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une réponse par p53 appropriée et possiblement en participant à l’augmentation de l’instabilité génomique. La fonction potentiellement oncogénique de Necdin quant à sa relation avec p53 que nous avons révélée requiert davantage d’investigation et les cancers caractérisés ici pourraient constituer de bons modèles à cette fin. / Viruses have been used extensively in cancer research and have contributed greatly to the advancement of knowledge as well as to the establishment of important concepts still valid in the field today. Currently, one of the challenges in cancer research is to better define the individual steps that contribute to the transition of a normal cell to a transformed cell. To address this important issue, we characterized a model system based on the expression of polyomavirus large-T antigen (PyLT), derived from a virus capable of inducing tumors in rodents. Importantly, PyLT is able to induce tumors in transgenic mice, although only after a latent period, suggesting that additional transforming events are necessary. Hence, the PyLT viral oncogene possesses several interesting properties, which suggest that, beside its role in immortalization, PyLT can contribute to the early events of carcinogenesis. Here, we used a cell culture model to dissect the early changes associated with the presence of PyLT. The establishment of a gene expression profile associated with PyLT expression in a mouse cell line model allowed us to select a number of genes whose levels were modulated by the presence of this viral oncogene. Among candidate genes, we chose to further study Necdin in more details because even if only a limited number of reports existed for this protein, there was evidence suggesting that Necdin displays either tumor suppressor or oncogenic functions within different contexts. We demonstrated that, despite the proposed growth suppressor function of Necdin, its expression was not incompatible with the proliferation in the mouse NIH 3T3 cell line and in human IMR90 primary cells. Nonetheless, the inhibition of Necdin expression by shRNA confered a proliferative advantage. We confirmed that Necdin was a p53 target gene inducible by different genotoxic stresses, although its expression was also regulated in a p53-independent manner. Moreover, Necdin acted negatively on cell cycle arrest in response to p53 activation. These results suggest that Necdin is involved in a negative feedback loop of the p53 pathway and that abnormal elevation of Necdin expression could contribute to the disruption of the p53 tumor suppressor pathway. p53 activation allows transitory cell cycle arrest under stress conditions and it is also involved in the establishment of a permanent growth arrest called senescence. Senescence represents a protective mechanism preventing the accumulation of mutations that could contribute to cancer initiation. As our research supports a role for Necdin in the regulation of p53 activity, we transposed the knowledge acquired from our mouse model to a human model more suitable to study senescence. The characterization of Necdin expression in human primary fibroblasts at different passages revealed that Necdin was expressed in actively proliferating young cells and its expression decreased gradually during the establishment of replicative senescence. The same phenomenon was observed during premature senescence induced by both oncogene expression and ionizing radiation exposure. Moreover, in normal growth conditions, Necdin modulation by gain- and loss-of-function assays did not affect the life span of primary cells. However, in a genotoxic stress conditions caused by irradiation, Necdin overexpressing cells presented an increase radioresistance comparable to when p53 was directly inactivated. These results in human cells supports the effect observed in mouse cells relative to the impact of Necdin levels on a p53 response under stress conditions. We initiated preliminary experiments to address whether our results in cell culture could be translated to human cancer models. We characterized Necdin expression in two types of human cancers. First, in ovarian cancer, we observed elevated levels of Necdin expression in low malignant potential serous ovarian cancers (LMP) when compared to aggressive serous ovarian cancers. Our results suggest that Necdin expression was limited to LMPs, which usually present a wild type p53 gene. Necdin expression was also found in two ovarian cancer cell lines, which were both non-tumorigenic in a mouse xenograft assay, and interestingly one of the cell line had a functional p53. Moreover, the characterization of Necdin expression in four prostate cancer cell lines also suggested a relationship between its expression and the presence of functional p53. In prostate cancer, as in ovarian cancer, Necdin expression seems to be detected in cell lines representing less aggressive forms of the disease. The use of the PyLT viral oncoprotein allowed us to reveal interesting properties for Necdin. We propose that, in some contexts, the constitutive expression of Necdin could contribute to cancer promotion by delaying appropriate p53 responses and possibly promoting genomic instability. The potential oncogenic function of Necdin, and its relationship with p53 as revealed by the research described in this dissertation, requires more investigation. Preliminary results suggest that human ovarian and prostate cancers could be good models to address the role of Necdin in carcinogenesis.

La réaction du greffon contre l’hôte (GvHD) est une complication majeure de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (HSCT). Les traitements de prophylaxie contre le développement de la GvHD reposent essentiellement sur l’utilisation d’agents immunosuppresseurs, ce qui contribue à ralentir la reconstitution immunitaire post-greffe et à prolonger la durée de l’état immunosupprimé des patients. Le développement de prophylaxie pour la GvHD à base d’agents immunomodulateurs est ainsi privilégié. À l’aide d’un modèle murin xénogénique chez les souris NOD/scid-IL2rγ-/- (NSG), on a étudié le potentiel immunomodulateur des immunoglobulines intraveineuses (IVIG) dans la prévention de la GvHD, ainsi que leurs effets sur la qualité et la cinétique de la reconstitution immunitaire. On a déterminé qu’un traitement hebdomadaire d’IVIG peut effectivement réduire l’incidence de la GvHD, ainsi que la mortalité qui y est reliée, avec une efficacité similaire à celle obtenue avec la cyclosporine A, un immunosuppresseur couramment utilisé dans la prophylaxie de la GvHD. Par ailleurs, on a déterminé que le mécanisme d’action des IVIG dans la réduction de la GvHD est distinct de celui des immunosuppresseurs. De plus, on a démontré que les IVIG induisent l’expansion et l’activation des cellules NK présentes au sein du greffon, lesquelles sont nécessaires pour l’obtention de l’effet protecteur des IVIG contre le développement de la GvHD, et sont dépendantes de la présence de lymphocytes T activés. Grâce à un modèle murin humanisé, on a également démontré que le traitement hebdomadaire d’IVIG induit un délai transitoire de la reconstitution humorale, ce qui n’affecte toutefois pas la qualité globale de la reconstitution immunitaire. Ces résultats mettent cependant en doute la pertinence de l’utilisation des IVIG dans les protocoles cliniques de prophylaxie de la GvHD, puisque les immunosuppresseurs seront toujours utilisés, et qu’on a démontré que les IVIG ont besoin de lymphocytes T activés afin de prévenir efficacement le développement de la GvHD. / Graft-versus-Host Disease (GvHD) is a major complication following hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Prophylactic treatments for the prevention of GvHD rely mostly on the use of immunosuppressors, which contribute to inhibit the patient’s immune reconstitution and prolong their immunosuppressed state. Development of immunomodulator-based prophylactic treatments is therefore preferred. Using NOD/scid-IL2rγ-/- mice, we developed a xenogeneic mouse model to assess the immunomodulatory potential of intravenous immunoglobulins (IVIG) for the prevention of GvHD, along with assessing their effect on the kinetics and the quality of the immune reconstitution in mice. We determined that weekly IVIG treatments reduced the incidence of GvHD and its related mortality. The effectiveness of IVIG for the prevention of GvHD was similar to that of cyclosporine A, an immunosuppressive drug routinely used for the prophylactic treatment of GvHD. Furthermore, we demonstrated that IVIG has a mechanism of action that is different from that of immunosuppressors. IVIG induce the expansion and activation of NK cells from the graft, which is mandatory for the preventive effect of IVIG on GvHD development. Furthermore, this IVIG-induced expansion and activation of NK cells require the presence of activated T lymphocytes. Using our humanized mouse model, we have also demonstrated that weekly IVIG treatments cause a transient delay of the humoral reconstitution, but do not affect the overall quality of the immune reconstitution. We have demonstrated that activated T lymphocytes are mandatory for the effective expansion and activation of NK cells, which in turn are essential to the IVIG-induced prevention of GvHD, and immunosuppressors will always be part of the prophylactic regimen of GvHD, therefore shining a doubt on the usefulness of adding IVIG to the prophylactic treatments for the prevention of GvHD.

Les virus sont utilisés depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribué à l’avancement des connaissances de même qu’à l’établissement de préceptes importants encore valables aujourd’hui dans le domaine. L’un des défis actuels est de mieux définir les étapes menant à la transition d’une cellule normale à une cellule transformée et c’est sur cette problématique que nous nous sommes penchés. Pour ce faire, nous avons tiré profit de l’utilisation de l’antigène grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable d’induire des tumeurs chez les rongeurs. Cet oncogène viral à lui seul possède des propriétés intéressantes qui suggèrent que, en plus de l’immortalisation, il peut également contribuer aux événements précoces de la carcinogénèse. Ceci repose principalement sur la capacité de PyLT à induire des tumeurs en souris transgéniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggère que des événements supplémentaires sont nécessaires. Ainsi, l’utilisation de PyLT dans un modèle de culture cellulaire permet de disséquer les changements qui lui sont attribuables. Dans un premier temps, l’établissement du profil d'expression génique associé à l'expression de PyLT dans un modèle murin nous a permis de sélectionner un bon nombre de gènes, parmi lesquels figurait Necdin. Nous avons choisi d’étudier Necdin plus en détail puisque peu d’attention était accordée à cette protéine dans le domaine du cancer, malgré que différentes données de la littérature lui suggèrent à la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogéniques. Nous avons démontré que, malgré sa fonction proposée de suppresseur de croissance, l’expression de Necdin n’est pas incompatible avec la prolifération dans la lignée cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que l’inhibition de son expression par shARN confère un avantage prolifératif. Nous avons confirmé que Necdin est un gène cible de p53 induit par différents agents génotoxiques, toutefois son expression peut également être régulée de façon p53-indépendante. De plus, Necdin agit négativement sur l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’activation de p53. Ceci suggère que Necdin est impliqué dans une boucle de régulation négative de la voie de p53 et que l’augmentation anormale de l’expression de Necdin pourrait contribuer à la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53. L’activation de p53 permet l’arrêt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi impliquée dans l’établissement d’un arrêt permanent nommé sénescence. La sénescence est un mécanisme de protection contre l’accumulation de mutations qui peut contribuer à l’initiation du cancer. Vu l’intéressante implication de Necdin dans la régulation de l’activité de p53, nous avons transposé les connaissances acquises du modèle murin à un modèle humain, plus adapté pour l’étude de la sénescence. La caractérisation de l’expression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains à différents passages montre que les jeunes cellules en prolifération active expriment Necdin et que son niveau diminue avec l’établissement de la sénescence réplicative. Le même phénomène est observé lors de la sénescence prématurée provoquée par l’expression d’un oncogène et par l’exposition aux radiations ionisantes. De plus, dans des conditions normales de prolifération, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction n’affecte pas la durée de vie des cellules primaires. Toutefois, en condition de stress génotoxique dû à l’exposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin présentent une radiorésistance accrue de la même façon que lorsque p53 est inactivé directement. Ce résultat en cellules humaines vient appuyer l’effet observé dans les cellules de souris sur l’impact qu’aura le niveau de Necdin sur la réponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a été fait pour aborder de quelle façon nos résultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modèles de cancer chez l’humain. Nous avons caractérisé l’expression de Necdin dans deux types différents de cancer. D’abord, dans le cancer de l’ovaire, le niveau élevé de Necdin dans les tumeurs à faible potentiel de malignité (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de l’ovaire de type séreux suggère que l’expression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui présente généralement un p53 de type sauvage. Son expression est aussi retrouvée dans deux lignées cellulaires du cancer de l’ovaire non-tumorigéniques en xénogreffe de souris, dont l’une possède un p53 fonctionnel. De plus, la caractérisation de Necdin dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate suggère une relation entre son expression et la présence de p53 fonctionnel. Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de l’ovaire, Necdin semble être présent dans les lignées représentant un stade moins avancé de la maladie. L’utilisation de l’oncoprotéine virale PyLT nous a permis de révéler des propriétés intéressantes de Necdin. Nous proposons que dans certains contextes, l’expression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une réponse par p53 appropriée et possiblement en participant à l’augmentation de l’instabilité génomique. La fonction potentiellement oncogénique de Necdin quant à sa relation avec p53 que nous avons révélée requiert davantage d’investigation et les cancers caractérisés ici pourraient constituer de bons modèles à cette fin. / Viruses have been used extensively in cancer research and have contributed greatly to the advancement of knowledge as well as to the establishment of important concepts still valid in the field today. Currently, one of the challenges in cancer research is to better define the individual steps that contribute to the transition of a normal cell to a transformed cell. To address this important issue, we characterized a model system based on the expression of polyomavirus large-T antigen (PyLT), derived from a virus capable of inducing tumors in rodents. Importantly, PyLT is able to induce tumors in transgenic mice, although only after a latent period, suggesting that additional transforming events are necessary. Hence, the PyLT viral oncogene possesses several interesting properties, which suggest that, beside its role in immortalization, PyLT can contribute to the early events of carcinogenesis. Here, we used a cell culture model to dissect the early changes associated with the presence of PyLT. The establishment of a gene expression profile associated with PyLT expression in a mouse cell line model allowed us to select a number of genes whose levels were modulated by the presence of this viral oncogene. Among candidate genes, we chose to further study Necdin in more details because even if only a limited number of reports existed for this protein, there was evidence suggesting that Necdin displays either tumor suppressor or oncogenic functions within different contexts. We demonstrated that, despite the proposed growth suppressor function of Necdin, its expression was not incompatible with the proliferation in the mouse NIH 3T3 cell line and in human IMR90 primary cells. Nonetheless, the inhibition of Necdin expression by shRNA confered a proliferative advantage. We confirmed that Necdin was a p53 target gene inducible by different genotoxic stresses, although its expression was also regulated in a p53-independent manner. Moreover, Necdin acted negatively on cell cycle arrest in response to p53 activation. These results suggest that Necdin is involved in a negative feedback loop of the p53 pathway and that abnormal elevation of Necdin expression could contribute to the disruption of the p53 tumor suppressor pathway. p53 activation allows transitory cell cycle arrest under stress conditions and it is also involved in the establishment of a permanent growth arrest called senescence. Senescence represents a protective mechanism preventing the accumulation of mutations that could contribute to cancer initiation. As our research supports a role for Necdin in the regulation of p53 activity, we transposed the knowledge acquired from our mouse model to a human model more suitable to study senescence. The characterization of Necdin expression in human primary fibroblasts at different passages revealed that Necdin was expressed in actively proliferating young cells and its expression decreased gradually during the establishment of replicative senescence. The same phenomenon was observed during premature senescence induced by both oncogene expression and ionizing radiation exposure. Moreover, in normal growth conditions, Necdin modulation by gain- and loss-of-function assays did not affect the life span of primary cells. However, in a genotoxic stress conditions caused by irradiation, Necdin overexpressing cells presented an increase radioresistance comparable to when p53 was directly inactivated. These results in human cells supports the effect observed in mouse cells relative to the impact of Necdin levels on a p53 response under stress conditions. We initiated preliminary experiments to address whether our results in cell culture could be translated to human cancer models. We characterized Necdin expression in two types of human cancers. First, in ovarian cancer, we observed elevated levels of Necdin expression in low malignant potential serous ovarian cancers (LMP) when compared to aggressive serous ovarian cancers. Our results suggest that Necdin expression was limited to LMPs, which usually present a wild type p53 gene. Necdin expression was also found in two ovarian cancer cell lines, which were both non-tumorigenic in a mouse xenograft assay, and interestingly one of the cell line had a functional p53. Moreover, the characterization of Necdin expression in four prostate cancer cell lines also suggested a relationship between its expression and the presence of functional p53. In prostate cancer, as in ovarian cancer, Necdin expression seems to be detected in cell lines representing less aggressive forms of the disease. The use of the PyLT viral oncoprotein allowed us to reveal interesting properties for Necdin. We propose that, in some contexts, the constitutive expression of Necdin could contribute to cancer promotion by delaying appropriate p53 responses and possibly promoting genomic instability. The potential oncogenic function of Necdin, and its relationship with p53 as revealed by the research described in this dissertation, requires more investigation. Preliminary results suggest that human ovarian and prostate cancers could be good models to address the role of Necdin in carcinogenesis.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La Neuropathie à Axones Géants (NAG) est une maladie neurodégénérative rare et fatale caractérisée par une détérioration du système nerveux central et périphérique, impliquant les fonctions motrices et sensorielles. La détérioration massive du système nerveux est accompagnée d'une désorganisation générale des Filaments Intermédiaires ce qui la différencie de nombreuses maladies neurodégénératives où seuls les neurofilaments(NFs) sont affectés. La protéine déficiente, la gigaxonine, est la sous-unité d'une ubiquitine ligase E3, responsable de la reconnaissance spécifique des substrats MAP1B, MAP1S et TBCB, seuls connus à ce jour.Dans le but d'étudier le rôle de la gigaxonine sur la survie neuronale, la désorganisation du cytosquelette et d'avoir un modèle animal suffisamment fort pour envisager des tests thérapeutiques, j'ai caractérisé un modèle murin de NAG. Pour ce faire, j'ai réalisé une étude comportementale des fonctions motrices et sensorielles ainsi qu'une étude histopathologique. Les souris NAG (129/SvJ) développent un phénotype moteur modéré dès 60 semaines alors que les souris NAG (C57BL/6) présentent un phénotype sensoriel dès 60 semaines. Les données histopathologiques ne présentent pas de mort neuronale mais les NFs sont sévèrement altérés. Les NFs sont plus abondant, leur diamètre est augmenté et leur orientation hétérogène, comme c'est observé chez les patients NAG.Nos résultats montrent que l'absence de gigaxonine induit un phénotype moteur et sensoriel modéré mais par contre reproduit la désorganisation massive des NFs observée chez les patients. Ce modèle va nous permettred'étudier le rôle de la gigaxonine, une ligase E3, sur l'organisation des NFs et ainsi comprendre les processus pathologiques impliqués dans d'autres maladies neurodégénératives caractérisée par une accumulation des NFs et un dysfonctionnement du système ubiquitine-protéasome comme les maladies d'Azheimer, de Parkinson etd'huntington ou la sclérose latérale amyotrophique. / Giant Axonal Neuropathy (GAN) is a rare and fatale neurodegenerative disorder characterized by a deterioration of the peripheral and central nervous system. The broad deterioration of the nervous system is accompanied with a general disorganization of the Intermediate Filaments which makes it different from other neurodegenerative disorders wherein only neurofilaments (NFs) are affected. The defective protein, gigaxonin, is the substrate adaptator of an E3 ubiquitin ligase, in charge of the specific recognition of MAP1B, MAP1S and TBCB. In order to study the role of gigaxonin on neuronal survival, the cytoskeleton disorganization and to have a relevant GAN animal model to evaluate efficacy of GAN treatments, I have characterized a GAN mouse model. I did a motor and sensory behavioural study and an histopathologic study. The GAN mice (129/SvJ) shown mild motordeficits starting at 60 weeks of age while sensory deficits were evidenced in C57BL/6 GAN mice. No apparent neurodegeneration was evidenced in GAN mice, but dysregulation of NFs was massive. NFs were more abundant, they shown the abnormal increased diameter and misorientation that are characteristics of the human pathology. Our results show that gigaxonin depletion induces mild motor and sensory deficits but recapitulates the severe NFs dysregulation seen in patients. Our model will allow us to study the role of the gigaxonin-E3 ligase in organizing NFs and understand the pathological processes engaged in other neurodegenerative disorders characterized by accumulation of NFs and dysfunction of the Ubiquitin Proteasome System, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis, Huntington's, Alzheimer's and Parkinson's diseases.

Les lymphocytes T ?d seraient des effecteurs essentiels dans la réponse immunitaire aux stress induits notamment par les infections et la tumorigénèse. Plusieurs arguments dont leur localisation intra-épithéliale mais aussi leurs capacités effectrices multiples et rapides les caractérisent comme des acteurs primordiaux dans l’immunité anti-tumorale. Mon projet de thèse consistait à examiner le potentiel anti-tumoral des lymphocytes T ?d humains, Vd2 négatifs (neg), dans un contexte in vivo, grâce à l’utilisation d’un modèle murin. Des études antérieures menées au laboratoire démontraient une expansion de lymphocytes T Vd2neg dans la circulation sanguine de transplantés rénaux développant une infection à cytomégalovirus (CMV). Des clones T Vd2neg, isolés de ces patients, présentaient une forte réactivité in vitro contre des cellules infectées par le CMV mais aussi contre des cellules tumorales notamment d’origine colique (comme la lignée HT29). Un ligand commun induit par l’infection à CMV et la transformation tumorale, reconnu par les clones T Vd2neg serait à l’origine de cette double réactivité. La première partie de mon projet s’est concentrée sur l’étude du potentiel anti-tumoral de ces clones T Vd2neg in vivo, qui comprenait leur capacité à atteindre des cellules tumorales d’origines coliques (HT29) et à les lyser. Dans un modèle de xénogreffe dans des souris immunodéficientes, nous avons démontré que les clones TVd2neg, injectés dans le péritoine (i.p) pouvaient retarder la croissance de tumeurs solides HT29 sous-cutanées. D’après nos résultats, cette inhibition du développement tumoral proviendrait d’une action précoce et spécifique des cellules T Vd2neg et impliquerait le récepteur à chimiokine CCR3. Nos données suggèrent donc que des lymphocytes T Vd2neg, réactifs contre le CMV, pourraient migrer in vivo jusqu’au site d’injection des cellules tumorales et inhiber la croissance de la tumeur probablement grâce à leur acticité cytolytique. La deuxième partie de mon projet de thèse proposait d’approfondir l’étude du rôle des lymphocytes T Vd2neg contre les tumeurs coliques. Ainsi nous avons testé, in vivo, l’implication de lymphocytes T Vd1+ humains, une population représentative des épithéliums intestinaux, dans le cancer métastatique colorectal (CMC). Nous avons développé un modèle d’implantation orthotopique de cellules tumorales HT29 dans des souris immunodéficientes, qui mime le développement du CMC chez l’homme. Des tumeurs primaires intra-caecales et des métastases pulmonaires et hépatiques se développent chez les souris. De plus, nous avons pu suivre leur croissance grâce à l’introduction de la luciférase dans les HT29 et à une technique d’imagerie in vivo en bioluminescence. Nos résultats montrent qu’un traitement continu des souris par des injections de lignée T Vd1+ en i.p inhibe le développement des tumeurs primaires et retarde l’apparition des métastases à distance. Ces données soutiennent l’implication des lymphocytes T Vd2neg dans le contrôle des CMC. De façon intéressante, elles mettent en avant une implication anti-métastatique des cellules T Vd2neg. L’ensemble de nos travaux souligne le rôle des cellules T Vd2neg dans la réponse immunitaire contre les cancers colorectaux et étaye leur potentiel d’action lors de la progression des tumeurs vers des métastases, ouvrant ainsi des perspectives pour l’utilisation de ces cellules dans les thérapies des CMC. / Gamma delta (?d) T lymphocytes contribute to host immune competence uniquely especially during stress immune responses to infections and tumors. Because ?d T cells colonize epithelial surfaces, where they can exert rapid and pleiotropic effector functions, they are critical protagonists in anti-cancer response. During my Phd project we explored the anti-tumor potential of Vd2 negatives (neg) ?d T lymphocytes, in vivo using a mouse xenograft tumor model. A few years ago, studies in our laboratory showed an increase of peripheral blood Vd2neg ?d T lymphocytes in allograft recipients infected by cytomegalovirus (CMV). Interestingly, Vd2neg ?d T clones isolated from these patients showed a cytotoxic activity against CMV infected fibroblast in vitro. Moreover, they were able to kill colon cancer cells (HT29) in vitro, in contrast to normal epithelial cells. Cancer cell- as well as CMV infected cell- killing involved T cell receptor (TCR) engagement, independently of major histocompatibility complex (CMH) recognition, probably with a common ligand. The first part of my Phd project was undertaken to evaluate the in vivo tumor reactivity of anti-CMV Vd2neg clones, including their ability to inhibit tumor growth as well as their migratory potential toward colon cancer cells. In immunodeficient mice, we showed that systemic intraperitoneal (i.p) injections with human Vd2neg clones inhibited the growth of HT29 hypodermal tumors xenografts. Furthermore, our results demonstrated that Vd2neg T cells had an early and specific anti-tumor effect, and that such activity could be hampered in vivo using an anti-CCR3 antibody. Our study suggest that Vd2neg T cells with an anti-viral potential are able to reach a tumor site in vivo, and inhibit tumoral growth exercising a cytolytic activity. The second part of my Phd project proposed to get further insights on the role of Vd2neg T cells in the immune surveillance against colon cancer. To this aim, we tested, the involvement of human Vd1+ T lymphocytes, a substantial fraction of T cells in intestinal epithelia, in limiting tumor spread in vivo, using a mouse model of colorectal carcinoma (CRC). We sat up a physiological mouse model of CRC by orthotopic microinjection of HT29 colon cell, which mimics the natural history of human CRC. Indeed, primary colic tumors and pulmonary and hepatic distant metastases grew in mice. Furthermore, bioluminescence imaging was used to follow the outcome of luciferase expressing cancer cells. We showed that systemic treatment with human Vd1+ T lymphocytes could inhibit the growth of intracaecal HT29 tumors and led a substantial reduction of distant metastases. Our results are the first arguing for a crucial role of ?d T cells against CRC, specially in preventing the dissemination of colon cancer cells. Taken together, our results underline the role of of ?d T cells in theimmune response against colorectal cancer. Our findings put forward Vd2neg T cells as attractive candidates for novel anti-tumor immunotherapy protocols.

Même si les traitements thermiques ou la désinfection par les oxydants ont démontré leur efficacité virucide, les mécanismes liés à la perte du caractère infectieux ne sont pas connus. Ceci pose un réel problème d’interprétation de la présence de génome viral en matière de risque infectieux dans les aliments. Ce travail de thèse a pour objectif d’étudier l’évolution des propriétés de surface (charge et hydrophobie) de virus modèles, bactériophage MS2 et norovirus murin, au cours de l’inactivation par la chaleur, l’hypochlorite de sodium et l’ozone. Pour nos deux virus, nous démontrons l’existence d’une température critique au-delà de laquelle la particule virale se déstructure en libérant son génome. Un simple traitement à la RNase permettrait alors de ne détecter que des virus infectieux par biologie moléculaire. Le traitement thermique implique aussi une augmentation de l’hydrophobie soulignant des modifications conformationnelles de la capside. L’hypochlorite de sodium ne modifie que peu les propriétés de surface mais des phénomènes d’oxydation ont lieu au niveau de la capside puisque la charge du bactériophage MS2 est légèrement modifiée. Ces modifications diminuent la résistance thermique du virus. Nous démontrons un effet synergique de l’hypochlorite de sodium et la chaleur sur le bactériophage MS2 (inactivation, RNase et hydrophobie). Quant à l’ozone gazeux, nous soulignons son intérêt pour le traitement virucide des aliments fragiles. Ainsi, ce travail précise les mécanismes d’inactivation des virus et ouvre de nouvelles perspectives tant pour discriminer les virus infectieux et non-infectieux que pour proposer l’exploration de nouveaux traitements technologiques / Although heat treatments or disinfections by oxidants have proven their virucidal efficiencies, mechanisms related to the loss of infectivity are not known. This statement could lead to a misinterpretation of the presence of viral genome on infection risk for humans in food matrices. This thesis aimed to study the evolution of surface properties (charge and hydrophobicity) for model viruses, bacteriophage MS2 and murine norovirus, during the heat, sodium hypochlorite and ozone inactivations. For both viruses, the existence of a critical temperature beyond which the viral particle was disrupted and released its genome was demonstrated. Simple treatment with RNase would then only detect infectious virus by molecular biology. The heat treatment also involved a transient increase in the hydrophobicity which highlighted conformational changes of the viral capsid. Sodium hypochlorite slightly modified the surface properties but oxidation phenomena occurred onto capsid since the bacteriophage MS2 charge has changed a little. These changes decreased the thermal resistance of the virus. Synergistic effects of both sodium hypochlorite and heat were observed on the inactivation of MS2 phages, the sensitivity of their genome to RNases and the increase in hydrophobicity of remaining infectious particles. Regarding gaseous ozone, we underlined its interest in the case of virucidal treatment of fragile food matrices. Therefore, this work specified the virus inactivation mechanisms and opened up new perspectives to discriminate infectious from non-infectious viruses but also to propose the exploration of new technological processes

Le cil primaire est un organite présent à la surface de la plupart des cellules de Vertébrés. Il participe à l’organogénèse en régulant l’activité de voies de signalisation comme la voie Hedgehog. Une dysfonction du cil primaire mène à des maladies rares, sévères et pléiotropiques, les ciliopathies, qui peuvent inclure des défauts cardiaques. Cependant, le rôle que le cil primaire joue dans la morphogénèse cardiaque est encore mal compris. Le projet principal de la thèse porte sur l’étude du rôle du cil primaire des cellules cardiaques dans le développement du cœur. Dans ce but, nous avons utilisé un modèle murin de délétion conditionnelle de Ift20, un gène essentiel pour la ciliogénèse. La délétion est contrôlée par l’allèle Mesp1Cre exprimé dans la plupart des précurseurs précoces cardiaques. A la naissance, les mutants conditionnels présentent des défauts importants de septation des voies efférentes et des chambres cardiaques, les oreillettes et les ventricules. Ces défauts sont similaires à ceux caractérisés dans les mutants de la voie Hedgehog. Nous avons également identifié de nouveaux phénotypes associés à la suppression du cil. Les mutants présentent une augmentation significative de la taille du ventricule droit et des malformations du réseau de vascularisation coronaire. Pour mieux comprendre la cause des défauts de croissance observés à la naissance, nous avons analysé les comportements cellulaires sous-jacents. Aucune différence significative des taux de prolifération, de la taille et de la proportion des types cellulaires n’a été détectée au stade prénatal, suggérant que ces défauts ont une origine développementale plus précoce. Des expériences sont en cours pour déterminer les mécanismes moléculaires des défauts observés. Dans le cadre d’une collaboration avec le laboratoire de Julien Vermot, à Strasbourg, nous avons étudié le rôle du cil primaire dans le développement du proépicarde, un organe précurseur de l’épicarde du cœur mature. Nous avons montré que les embryons mutants Ift20 constitutifs présentent une augmentation significative du volume du proépicarde. Des analyses sont en cours pour identifier les voies de signalisation impliquées dans ce phénotype. Les travaux effectués durant ce projet de thèse ont permis de caractériser de nouveaux rôles du cil primaire dans le développement cardiaque. Nos résultats participent à une meilleure compréhension des ciliopathies et des défauts cardiaques qui leur sont associés. / The primary cilium is an organelle present at the surface of most of Vertebrate cells. It is involved in organogenesis by regulating signalling pathways such as Hedgehog signalling. Primary cilium dysfunction leads to severe, rare and pleiotropic diseases, ciliopathies, which can include cardiac defects. Howevr, the role that the primary cilia plays in cardiac morphogenesis is still poorly understood. The main project of the PhD focuses on the study of the role of primary cilia in cardiac cells during heart development. We have used a mouse mode of conditional deletion of Ift20, a gene essential for ciliogenesis. The deletion is controlled by the Mesp1Cre allele, expressed in the majority of cardiac precursors. At birth, conditional mutants display severe defects in septation of the outflow tract, the atria and the ventricles. These defects are similar to the ones characterized in Hedgehog signalling mutants. We also have identified novel phenotypes linked to cilium suppression. The mutants display a significant increase in the size of the right ventricle and defective coronary vasculature development. To better understand the growh defects observed at birth, we analysed the underlying cell behaviour. No significant differences in the proliferation rates, nor in the size and proportions of different cell types were detected at prenatal stages, suggesting that these defects have an earlier developmental origin. Experiments are underway to determine the molecular mechanisms of the observed defects. In collaboration with the laboratory of Julien Vermot, in Strasbourg, we studied the role of the primary cilium in the development of the proepicardium, a precursor organ of the mature epicardium. We have shown that Ift20 constitutive mutants show a significant increase in proepicardial volume. Analyses are ongoing to identify the signalling pathways involved in this phenotype. The works performed during this PhD project allowed the characterization of new roles for the primary cilium in cardiac development. Our results participate in a better understanding of ciliopathies and their associated cardiac defects.

La dysplasie géléophysique (DG) est une maladie rare qui appartient à la famille des dysplasies acroméliques. Cette pathologie est caractérisée par un retard statural, une brachydactylie, une raideur articulaire, une dysmorphie faciale, une peau épaisse, une atteinte bronchopulmonaire et une surcharge valvulaire cardiaque conduisant le plus souvent à une mort précoce dans les premières années de la vie. Deux modes de transmissions ont été identifiés. Le premier autosomique récessif est dû à des mutations dans le gène ADAMTSL2. Le second, autosomique dominant est dû à un hot-spot de mutations dans les exons 41 et 42 qui codent pour le domaine Transforming Growth Factor (TGF) β-binding protein-like domain 5 (TB5) du gène FBN1. FBN1 et ADAMTSL2 codent pour des protéines sécrétées de la matrice extracellulaire (MEC). FBN1 code pour la fibrilline-1, une composante des microfibrilles qui jouent un rôle dans la biodisponibilité du TGFβ. La protéine ADAMTSL2 fait partie de la famille des ADAMTS mais n’a pas d’activité enzymatique dû à l’absence de domaine catalytique. Sa fonction est encore inconnue. Cependant des partenaires d’ADAMTSL2 ont été identifiés par notre équipe : latent-transforming growth factor beta-binding protein 1 (LTBP1) et FBN1 qui sont directement impliqués dans le stockage de TGFβ. Récemment une autre protéine, FBN2, a aussi été découverte comme partenaire d’ADAMTSL2 (Hubmacher D et. al.). L’objectif de ma thèse était de comprendre le mécanisme physiopathologique de la DG, grâce à l’analyse de modèles murins. Un premier modèle murin pour la forme récessive de la DG appelé CreCMV; Adamtsl2f/f (ou KO) a été généré. L’analyse phénotypique de ces souris a montré un retard statural, des os longs courts, des extrémités courtes. Dans les plaques de croissance des os longs des souris mutantes, nous avons observé une désorganisation des colonnes chondrocytaires associée à une diminution de l’expression du collagène de type 10, marqueur de la différentiation des chondrocytes. L’analyse de la matrice extracellulaire des plaques de croissance a révélé une désorganisation structurale importante. Une diminution de la fibrilline-1 et de LTBP-1 a été observée ainsi qu’une augmentation de l’activation de la voie de signalisation TGFβ au niveau de la plaque de croissance des souris mutantes. Nous avons observé une désorganisation du réseau microfibrillaire sur des cultures de chondrocytes de souris mutantes. Ces résultats nous ont permis de suggérer que la protéine ADAMTSL2 est impliquée dans la structure du réseau microfibrillaire, lieu de stockage du TGFβ et de démontrer un rôle majeur d’ADAMTSL2 dans la régulation de la chondrogenèse. Afin d’étudier la forme dominante de la DG, le modèle FBN1TB5+/- a été généré. Il est issu d’un système knock-in avec une mutation dans l’exon 42 du gène fbn1 qui correspond au domaine TB5 de la fibrilline-1. Nos résultats ont montré une réduction de la taille des souris hétérozygotes et homozygotes en comparaison aux souris sauvages au stade P1 et P30. Au stade P1, nous avons observé des chondrocytes plus larges et une dérégulation des marqueurs de la chondrogenèse au niveau de la plaque de croissance des fémurs des souris hétérozygotes, ainsi que chez les souris homozygotes. De plus, nous avons observé une très forte mortalité des souris homozygotes vers l’âge de 2 ou 3 mois. Nous en avons conclu que des mutations domaine TB5 de la fibrilline étaient liées à un retard statural et donc que FBN1 avait un rôle majeur dans la chondrogenèse. / Geleophysic dysplasia (GD) is a rare disease, which belong to acromelic group. This pathology is characterized by short stature, brachydactyly, joint stiffness, thick skin, facial dimorphism, broncho-pulmonary insufficiency and cardiac disease which lead to an early death in the first years of life. Two mode of inheritance have been identified. The first one, autosomal recessive, is due to mutations in ADAMTSL2 gene. The second, autosomal dominant, is due to hot-spot mutations in exon 41-42 of FBN1 gene, which encode the Transforming Growth Factor (TGF) β-binding protein-like domain 5 (TB5) of the protein. FBN1 and ADAMTSL2 encode secreted proteins of the extracellular matrix (ECM). FBN1 encodes fibrilline-1, component of microfibrillar network, playing a role in the bioavailability of TGF- β. ADAMTSL2 protein belongs to ADAMTS family, but does not have enzymatic activity due to lack of catalytic domain. Its function remains unknown. However, ADAMTSL2 partners have been identified by our team: latent-transforming growth factor beta-binding protein 1 (LTBP1) and FBN1, which are directly implied in storage of TGF-β. Recently, another protein, FBN2, have been identified as an ADAMTSL2 partner (Hubmacher D et. al.). The aim of my study was to understand the physiopathological mechanism of Geleophysic dysplasia by analysing murine models. A first murine model for the GD recessive form, CreCMV; Adamtsl2f/f (KO), have been generated. Phenotypic analysis of these mice showed short stature and shorter long bones and extremities. In long bone growth plate of mutant mice, we observed disorganization of chondrocyte columns, associated with decrease of collagen 10 expression, marker of chondrocyte differentiation. Analysis of ECM in growth plate revealed strong structural disorganization. Decrease of FBN1 and LTBP1 and were observed with an overactivation of TGF-β pathway in growth plate of mutant mice. We observed disorganization of microfibrillar network in chondrocyte cultures of mutant mice. These results suggest that ADAMTSL2 protein is implied in structure of microfibrillar network, where is stored TGF-β, and demonstrate major role of ADAMTSL2 in chondrogenesis. In order to study dominant form of GD, mouse model FBN1TB5+/-, have been generated. The mice were obtained by knock-in system, with mutation in exon 42 of FBN1 gene. Our results showed short stature of heterozygous (HT) and homozygous (Ho) mice compared to wild)type mice, at stage P1 and P30. At stage P1, we observed larger chondrocytes and deregulation of chondrogenesis markers in growth plate of HT and Ho mice. Furthermore, we observed high mortality of Ho mice at 2-3 months. We concluded that mutations in TB5 domain of FBN1 were linked to short stature and thus FBN1 have major role in chondrogenesis.