A tuberculose (TB) é uma séria doença infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis, e constitui um importante problema de saúde pública em todo o mundo. Novas drogas e vacinas de segunda geração são urgentemente necessárias para o controle da TB, mas a complexa biologia de M. tuberculosis tem dificultado o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. A manipulação genética de M. tuberculosis também é complicada, mas, atualmente, técnicas novas e mais eficientes de troca alélica permitem o estudo detalhado de diversos genes micobacterianos. No presente trabalho, os genes da corismato mutase (CM) e fosforilase de nucleosídeos purínicos (PNP) de M. tuberculosis e Mycobacterium smegmatis foram estudados. A CM catalisa a conversão de corismato em prefenato na rota de biossíntese dos aminoácidos aromáticos fenilalanina e tirosina em bactérias, fungos e plantas. Dois genes de CMs monofuncionais (aroQ e *aroQ) foram identificados, clonados, expressos e bioquimicamente caracterizados em ambas as espécies de micobactérias. Esses genes também foram investigados usando uma metodologia de recombinação homóloga e ensaios de atividade promotora. Os resultados indicam que os genes aroQ são provavelmente essenciais ao crescimento in vitro de M. tuberculosis e M. smegmatis, enquanto uma linhagem mutante para o gene *aroQ de M. smegmatis pôde ser obtida. A PNP catalisa a interconversão e reciclagem de bases, nucleosídeos e nucleotídeos purínicos na via de salvamento das purinas. A construção de mutantes para o gene deoD (que codifica a PNP) de M. tuberculosis e M. smegmatis, usando um método eficiente de troca alélica em duas etapas, não foi possível. Assim, sugere-se que, nas condições testadas, o gene deoD seja essencial ao crescimento in vitro dessas micobactérias. A identificação de genes essenciais é de fundamental importância, pois indica tanto a relevância biológica dos mesmos como, no caso de M. tuberculosis, que seus produtos constituem alvos moleculares interessantes para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. / Tuberculosis (TB), a serious infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, still remains a public health problem in the world. New drugs and second generation vaccines are urgently required to control TB, but the complex biology of M. tuberculosis has hindered the development of novel therapeutic tools. Genetic manipulation of M. tuberculosis is also difficult, but currently new, more efficient gene replacement techniques have allowed detailed studies of many mycobacterial genes. In the present work, the chorismate mutase (CM) and purine nucleoside phosphorylase (PNP) genes from M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis were studied. CM catalyzes the rearrangement of chorismate to prephenate in the biosynthetic pathway that forms phenylalanine and tyrosine in bacteria, fungi, and plants. Two monofunctional CM genes (aroQ and *aroQ) were identified, cloned, expressed, and biochemically characterized in both mycobacteria. Those genes were also investigated by homologous recombination methods and promoter activity assays. AroQ genes seem to be essential for the growth of M. tuberculosis and M. smegmatis, while an *aroQ mutant strain could be generated in M. smegmatis. PNP promotes the interconversion and recycling of purine bases, nucleosides, and nucleotides in the purine salvage pathway. Construction of deoD (which codes for PNP) deletion mutants of M. tuberculosis and M. smegmatis using an efficient two-step gene replacement technique was not possible. Thus, it is suggested that deoD is also essential for mycobacterial growth under the conditions tested. The identification of essential genes is of great importance, both because it indicates their biological significance, and because, with pathogens like M. tuberculosis, these may also indicate attractive molecular targets for the development of new antimycobacterial drugs.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-16Bitstream added on 2014-06-13T20:16:30Z : No. of bitstreams: 1 souza_pc_me_arafcf.pdf: 1133784 bytes, checksum: 02f70c3dafbe0953dabe3934d0e053a7 (MD5) / A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa que tem como principal patógeno o Mycobacterium tuberculosis e continua sendo um importante problema de saúde pública mundial, exigindo o desenvolvimento de estratégias para o seu controle. Em 2011 foram notificados 8,7 milhões de casos da doença no mundo. Ao longo dos anos o cenário da doença não tem se mostrado otimista, devido ao aumento de número de casos de TB multi resistente a fármacos (TB-MDR) e o surgimento de cepas de resistência estendida (TB-XDR). A pesquisa de novos fármacos, em um contexto geral, apresenta-se como um enorme desafio científico para a era moderna. Neste sentido, a Química Inorgânica Medicinal tem se mostrado uma ferramenta bastante promissora. Este trabalho objetivou a caracterização da atividade anti- M. tuberculosis intra e extracelular e a citotoxicidade de 158 compostos de coordenação com metais. A citotoxicidade usando linhagens celulares de macrófago (J774A.1) e células epiteliais (VERO) também foi investigada. Diante Os resultados demonstraram que 16 compostos apresentaram uma alta seletividade, ou seja, alta atividade contra o bacilo da tuberculose e baixa citotoxicidade frente às linhagens testadas. Quatro desses 16 compostos selecionados foram analisados quanto a atividade intracelular; dos quais 2 compostos de coordenação de Co (cobalto) mostraram-se promissores quanto a esta atividade. Com base nos resultados encontrados mais estudos serão realizados a fim de garantir a eficácia e segurança desses novos compostos de coordenação candidatos à fármacos para tratamento da tuberculose / Not available

A tuberculose (TB) é uma séria doença infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis, e constitui um importante problema de saúde pública em todo o mundo. Novas drogas e vacinas de segunda geração são urgentemente necessárias para o controle da TB, mas a complexa biologia de M. tuberculosis tem dificultado o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. A manipulação genética de M. tuberculosis também é complicada, mas, atualmente, técnicas novas e mais eficientes de troca alélica permitem o estudo detalhado de diversos genes micobacterianos. No presente trabalho, os genes da corismato mutase (CM) e fosforilase de nucleosídeos purínicos (PNP) de M. tuberculosis e Mycobacterium smegmatis foram estudados. A CM catalisa a conversão de corismato em prefenato na rota de biossíntese dos aminoácidos aromáticos fenilalanina e tirosina em bactérias, fungos e plantas. Dois genes de CMs monofuncionais (aroQ e *aroQ) foram identificados, clonados, expressos e bioquimicamente caracterizados em ambas as espécies de micobactérias. Esses genes também foram investigados usando uma metodologia de recombinação homóloga e ensaios de atividade promotora. Os resultados indicam que os genes aroQ são provavelmente essenciais ao crescimento in vitro de M. tuberculosis e M. smegmatis, enquanto uma linhagem mutante para o gene *aroQ de M. smegmatis pôde ser obtida. A PNP catalisa a interconversão e reciclagem de bases, nucleosídeos e nucleotídeos purínicos na via de salvamento das purinas. A construção de mutantes para o gene deoD (que codifica a PNP) de M. tuberculosis e M. smegmatis, usando um método eficiente de troca alélica em duas etapas, não foi possível. Assim, sugere-se que, nas condições testadas, o gene deoD seja essencial ao crescimento in vitro dessas micobactérias. A identificação de genes essenciais é de fundamental importância, pois indica tanto a relevância biológica dos mesmos como, no caso de M. tuberculosis, que seus produtos constituem alvos moleculares interessantes para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. / Tuberculosis (TB), a serious infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, still remains a public health problem in the world. New drugs and second generation vaccines are urgently required to control TB, but the complex biology of M. tuberculosis has hindered the development of novel therapeutic tools. Genetic manipulation of M. tuberculosis is also difficult, but currently new, more efficient gene replacement techniques have allowed detailed studies of many mycobacterial genes. In the present work, the chorismate mutase (CM) and purine nucleoside phosphorylase (PNP) genes from M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis were studied. CM catalyzes the rearrangement of chorismate to prephenate in the biosynthetic pathway that forms phenylalanine and tyrosine in bacteria, fungi, and plants. Two monofunctional CM genes (aroQ and *aroQ) were identified, cloned, expressed, and biochemically characterized in both mycobacteria. Those genes were also investigated by homologous recombination methods and promoter activity assays. AroQ genes seem to be essential for the growth of M. tuberculosis and M. smegmatis, while an *aroQ mutant strain could be generated in M. smegmatis. PNP promotes the interconversion and recycling of purine bases, nucleosides, and nucleotides in the purine salvage pathway. Construction of deoD (which codes for PNP) deletion mutants of M. tuberculosis and M. smegmatis using an efficient two-step gene replacement technique was not possible. Thus, it is suggested that deoD is also essential for mycobacterial growth under the conditions tested. The identification of essential genes is of great importance, both because it indicates their biological significance, and because, with pathogens like M. tuberculosis, these may also indicate attractive molecular targets for the development of new antimycobacterial drugs.

No / Background: Ethiopia has an extremely high rate of extrapulmonary tuberculosis, dominated by tuberculous lymphadenitis (TBLN). However, little is known about Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc) lineages re-sponsible for TBLN in Southwest Ethiopia.Methods:A total of 304 MTBc isolates from TBLN patients in Southwest Ethiopia were genotyped primarily by spoligotyping. Isolates of selected spoligotypes were further analyzed by 15-loci mycobacterial interspersed repetitive unit–variable number tandem repeat (MIRU-VNTR) (n = 167) and qPCR-based single nucleotide polymorphism (n = 38). Isolates were classified into main phylogenetic lineages and families by using the re-ference strain collections and identification tools available at MIRU-VNTRplus data base. Resistance to rifampicin was determined by Xpert MTB/RIF. Results: The majority of isolates (248; 81.6%) belonged to the Euro-American lineage (Lineage 4), with the ill-defined T and Haarlem as largest families comprising 116 (38.2%) and 43 (14.1%) isolates respectively. Of the T family, 108 isolates were classified as being part of the newly described Ethiopian families, namely Ethiopia_2(n = 44), Ethiopia_3 (n = 34) and Ethiopia_H37Rv-like (n = 30). Other sub-lineages included URAL (n = 18), S(n = 17), Uganda I (n = 16), LAM (n = 13), X (n = 5), TUR (n = 5), Uganda II (n = 4) and unknown (n = 19).Lineage 3 (Delhi/CAS) was the second most common lineage comprising 44 (14.5%) isolates. Interestingly, six isolates (2%) were belonged to Lineage 7, unique to Ethiopia. Lineage 1 (East-African Indian) and Lineage 2(Beijing) were represented by 3 and 1 isolates respectively.M. bovis was identified in only two (0.7%) TBLN cases. The cluster rate was highest for Ethiopia_3 isolates showing clonal similarity with isolates from North Ethiopia. Lineage 3 was significantly associated with rifampicin resistance. Conclusions: In TBLN in Southwest Ethiopia, the recently described Ethiopia specific Lineage 4 families were predominant, followed by Lineage 3 and Lineage 4-Haarlem. The contribution of M. bovis in TBLN infection is minimal. / This work was supported by the Mycobacteriology Unit of Instituteof Tropical Medicine, Antwerp, Belgium and interuniversity coopera-tion between Jimma University and Flemish Universities (VLIR-OUSproject).

published_or_final_version / Microbiology / Master / Master of Medical Sciences

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