Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Tuberculosis (TB) has become a global health epidemic affecting millions of people worldwide with a high incidence in third-world countries. The emergence of multi-drug and extremely-drug resistant M. tuberculosis strains together with the HIV/AIDS pandemic warrants the need for new drugs or new drug combinations. The folic acid synthesis pathway is one of the key pathways that are essential for the survival of bacteria in general. Sulfonamides are a group of compounds that target folic acid synthesis, particularly dihydropteroate synthetase, the first enzyme in the folate pathway. Some of these sulfonamides were used during the introduction of chemotherapy for the treatment of TB in the 1930s, but had toxic side effects. Newer derivatives became safer, but were not employed again for TB treatment. In a recent case study it was reported that the combination of trimethoprim-sulfamethoxazole (Bactrim), which is used to treat various bacterial infections, such as urinary tract infections, had activity against M. tuberculosis. In light of this and the fact that trimethoprim-sulfamethoxazole is well tolerated by humans, we have investigated their antimycobacterial activity with particular interest in the combinational effect of sulfamethoxazole and trimethoprim with the first-line anti-TB drugs, Isoniazid, Rifampicin and Ethambutol against M. tuberculosis. Since sulfonamides are known to produce oxidative stress, we also investigated the contribution of this factor to the efficacy of sulfamethoxazole using a mycothiol deficient strain of M. tuberculosis, ΔmshA. Though trimethoprim-sulfamethoxazole targets the folic acid pathway, we also investigated the possibility that trimethoprim-sulfamethoxazole may have other cellular targets and applied proteomic analysis. We have found that Trimethoprim-Sulfamethoxazole has activity against M. tuberculosis and that Sulfamethoxazole is the active compound. However, our observation was that not all sulfonamides are active against M. tuberculosis. In addition we observed that sulfamethoxazole enhances the activity of Rifampicin against M. tuberculosis in a synergistic way. We also observed that a mycothiol deletion mutant was more susceptible to Sulfamethoxazole compared to the wild type strain CDC 1551. Through global protein expression profiling (Proteomics) we were also able to show that sulfamethoxazole could also kill M. tuberculosis by oxidative stress production as we identified oxidative stress responsive proteins that were differentially regulated upon exposure to sulfamethoxazole. As trimethoprim-sulfamethoxazole is a registered drug combination, inexpensive and widely available, we propose that this regimen could be used in our fight against M. tuberculosis infection. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Tuberkulose (TB) is ‘n globale gesondheidsprobleem wat miljoene mense wêreldwyd affekteer met ‘n besoderse hoë voorkoms in die derdewêreld lande. Die voorkoms van multi-middel weerstandige en uitersweerstandige M. tuberculosis stamme, tesame met die HIV/VIGS pandemie, steun die erns vir die ontwikkeling van nuwe middels teen M.tuberculosis . Die foliensuur sintesepad is essensieël tot die oorlewing van bakterieë in die algemeen. Vir daardie rede is daar vele middels ontwerp om hierdie metaboliese pad te teiken. Die sulfonamiedes is ‘n groep antibiotika wat foliensuursintese, spesifiek dihidropteroaatsintese, die eerste ensiem in die foliensuursintese pad, teiken. Van hierdie sulfonamiedes is voorheen in die 1930’s gebruik vir die behandeling van tuberkulose, maar het toksiese newe-effekte getoon. Nuwe, minder toksiese derivate, is later ontwikkel maar is nooit vir TB behandeling weer aangewend nie. In ‘n onlangse gevallestudie is daar gerapporteer dat die kombinasie trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP/SMX. Handelsnaam: Bactrim), wat normaalweg gebruik word vir die behandeling van algemene bakteriële infeksies soos blaasinfeksies, aktiwiteit teen M. tuberculosis getoon het. Na aanleiding hiervan en dat Bactrim veilig in mense gebruik kan word, het ons die aktiwiteit van Bactrim komponente teen M. tuberculosis bepaal en in die besonder die aktiwiteite van SMX en TMP in kombinasie met die eerstelinie anti-tuberkulose middels Isoniasied, Rifampisien en Ethambutol. Aangesien sulfonamiedes ook oksidatiewe stres intrasellulêr genereer, het ons ook die bydrae van hiervan tot die doeltreffendheid van SMX bepaal deur gebruik te maak van ‘n mycothiol-gemuteerde M. tuberculosis stam ( mshA). Omdat TMP/SMX die foliensuur-pad hoofsaaklik teiken het ons ook die moontlikheid ondersoek dat SMX ander sellulêre teikens het en het ons proteomiese (Proteomics) tegnieke hiervoor aangewend. Ons het gevind dat TMP/SMX aktiwiteit teen M. tuberculosis toon en dat SMX die aktiewe komponent van Bactrim is teen M. tuberculosis . Ons wys ook dat sulfonamiedes in die algemeen nie noodwendig ook aktiwiteit teen M. tuberculosis toon nie. Ons het ook waargeneem dat SMX die aktiwiteit van rifampisien bevorder en dat die twee middels saamwerk op ‘n sinergistiese wyse. Ons het ook getoon dat oksidatiewe stres ‘n rol speel deurdat‘n mycothiol delesie-mutant meer vatbaar was vir SMX in vergelyking met die wilde-tipe stam van M. tuberculosis (CDC1551). Met globale proteïenkartering (Proteomics) het ons ook getoon dat SMX M. tuberculosis kan doodmaak deur oksidatiewe stres te genereer omdat ons oksidatiewe stres reaktiewe proteïne geïdentifiseer het wat differensieël gereguleer is gedurende blootstelling aan SMX. Aangesien Bactrim ‘n reeds geregistreerde middel is, goedkoop is en geredelik beskikbaar is, stel ons voor dat Bactrim moontlik geïnkorporeer kan word in die huidige behandeling van Tuberkulose.

A Tuberculose é uma das doenças infecciosas mais antiga e bem descrita. Entretanto, ainda permanece como um dos principais problemas de saúde pública a ser enfrentado em âmbito global. A implantação de novas estratégias no controle da Tuberculose requer uma melhor compreensão dos mecanismos que sucedem a fagocitose das micobactérias por macrófagos. Após a fagocitose, as micobactérias dão início a um conjunto de ações para sobreviverem e se replicarem no ambiente intracelular, entre as quais a provável interferência no processo de morte celular. Estudos mostram que M. tuberculosis pode apresentar habilidade de interferir no mecanismo de morte celular. Essa habilidade se tornou um desafio a ser estudado devido às implicações que isso deve ter na patogênese da doença. O nosso estudo teve por objetivo analisar a expressão de genes anti-apoptóticos (bcl-2, bcl-x e mcl-1) e pro-apoptóticos (bak, bax e bid) por PCR em tempo Real em macrófagos humanos derivados de células THP-1 após diferenciação induzida por PMA. Além disso, analisar a porcentagem de fragmentação de DNA nesses macrófagos, utilizando a citometria de fluxo, pois a fragmentação internucleossômica do DNA é uma das características apresentadas por células apoptóticas. Para as infecções foram utilizados isolados clínicos de M. tuberculosis com perfil de suscetibilidade a fármacos diferentes e a cepa padrão H37Rv (ATCC). Os dados de expressão foram analisados pela diferença de entre os isolados clínicos sensíveis, resistentes a três dos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose humana e a cepa padrão H37Rv, utilizando-se o método de 2-ΔΔCT. Para comparar os resultados de expressão gênica, bem como a porcentagem de fragmentação de DNA, nos macrófagos infectados com os diferentes isolados clínicos, foram utilizados análise de variância (ANOVA) e o teste de comparação múltipla de Tukey. Os resultados sugerem, que os isolados clínicos resistentes a INH, RIF e EMB utilizados no nosso estudo, bem como a cepa padrão H37Rv (ATCC), não induzem mecanismos anti-apoptóticos para evadir da resposta imune. A ocorrência de fragmentação de DNA nos macrófagos infectados é um indicativo de morte por apoptose ou pyroptose. Além disso, o tempo de infecção éum fator importante e, com certeza, infecções com tempos maiores poderiam induzir ainda mais a morte dos macrófagos infectados. / Tuberculsis, an ancient infection disease, continues to thrive. Although well described, it remains a world health problem to overcome. The development and application of new strategies to control Tuberculosis requires a better understanding of mechanisms involved in mycobacteria-macrophages interaction. Following phagocytosis, mycobacteria initiates a variety of actions to survive and multiply themselves inside macrophages. According to researches, mycobacteria might interfere in the cell death mechanism. This ability became a challenge to be studied due to its implications in the pathogenesis of the disease. The aim of this study was to analyze the gene expression of anti-apoptotic (bcl-2, bcl-x e mcl-1) and pro-apoptotic genes (bak, bax e bid) in PMA-treated THP-1 cells by Real Time qPCR. Moreover, the percentage of macrophage DNA fragmentation was assessed by flow citometry because internucleosomal DNA fragmentation is characteristic of apoptotic and pyroptotic cell death. The infection was carried out using clinical isolates of M. tuberculosis resistent to multiple drugs, drug susceptibility and the M. tuberculosis H37Rv strain. The difference in the expression profile among clinical isolates, susceptible and resistant to three drugs used in the TB treatment, and the M. tuberculosis H37Rv were evaluated with the method 2-ΔΔCT. In order to compare gene expression patterns as well as the percentage of DNA fragmentation in macrophages infected with different clinical isolates, it was used analysis of variance (ANOVA) and Tukey`s multiple comparison test. The results suggest that M. tuberculosis H37Rv and the clinical isolates presenting higher drug resistant profile might induce programmed cell death in macrophages after 24-h infection. This was observed in the gene expression pattern and also in the macrophage DNA fragmentation profile, which indentifies apoptosis or pyroptosis. Therefore, it is suggested these clinical isolates and M. tuberculosis H37Rv do not present anti-apoptotic mechanisms to evade immune response. Moreover, the infection time is an important factor and, definitely, infections for long time could induce increase death of the infectados macrophages.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1998. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [135]-168).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-27Bitstream added on 2014-06-13T19:43:42Z : No. of bitstreams: 1 malaspina_ac_dr_arafcf.pdf: 775274 bytes, checksum: 18bf752c95a916660f1a3b09c97c8077 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O estudo da epidemiologia molecular através de diferentes técnicas vigentes como Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Spacer Oligonucleotide Typing (Spoligotyping) e Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRU) revolucionou a compreensão da epidemiologia da tuberculose. Foram analisados isolados clínico de pacientes portadores de tuberculose pulmonar no município de Araraquara, entre os anos 2000 e 2006, através de genotipagem por RFLP e Spoligotyping (n=122). A técnica de RFLP permitiu a identificação de um índice de 26,4% de casos de tuberculose proveniente de infecção recente na cidade de Araraquara, no período de 2000 a 2006. Verificou-se relação epidemiológica em cerca de 68% dos casos envolvendo grupos genéticos identificados pelo RFLP. Destaca-se as transmissões intradomiciliares e a moradia em condomínios residenciais do CDHU. A técnica de RFLP permitiu a distinção de dois grandes grupos genéticos, A e B, dentre os isolados de Araraquara. Cerca de 73% dos spoligotipos obtidos foram identificados no Banco Internacional de Spoligotyping SpolDB4, sendo as famílias LAM, T e H as mais predominantes e cerca de 27% dos spoligotipos encontrados apresentaram perfis não descritos no SpolDB4. A associação do RFLP, Spoligotyping e MIRU não foi uma boa ferramenta para a análise genética dos isolados clínicos visando esclarecimentos epidemiológicos. Embora a genotipagem através do RFLP permita uma melhor discriminação entre os isolados bem como uma excelente associação entre amostras relacionadas epidemiologicamente, a técnica de Spoligotyping associada ao MIRU permite uma boa discriminação entre os isolados clínicos, da mesma forma que propicia uma satisfatória correlação entre casos ligados epidemiologicamente / Molecular epidemiology study using different current methods such as Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Spacer Oligonucleotide Typing (Spoligotyping) and Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRU) modified tuberculosis epidemiology comprehension. Clinical isolates from pulmonary tuberculosis patients from Araraquara, between 2000 and 2006, were genotyped through RFLP and Spoligotyping (n=122). RFLP provided the identification of a 26.4% level of tuberculosis cases caused by recent infection in the period. Epidemiologic association were verified in 68% of the cases in clusters identified by RFLP. Intradomiciliary transmissions and living in residential condominiums from CDHU were important factors. RFLP fingerprint provides the distinction of two big genetic groups, A and B, among Araraquara isolates. About 73% of spoligotypes were described in the International Spoligotyping Database SpolDB4 and LAM, T and H families were the most frequent, in the other hand, 27% of spoligotypes had unique profifes not described in SploDB4. RFLP, Spoligotyping and MIRU association was not a good tool to genotype clinical isolates in order to provide epidemiological understandings. Although RFLP fingerprinting allows a better discrimination as well as an excellent association among epidemiological related isolates, Spoligotyping associated with MIRU provides a good discrimination among clinical isolates as well as provides a satisfactory correlation among cases epidemiological connected

Orientador: Ida Maria Foschiani Dias Baptista / Resumo: Tuberculosis (TB) is a major cause of mortality, and Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), the causative agent. The study of molecular epidemiology associated with classical epidemiology, provides an understanding of the spread of M. tuberculosis and ads in epidemiological investigation, determining outbreaks and risk factors for transmission in the population. This study aimed to provide a more accurate view of the molecular epidemiology and genetic diversity of M. tuberculosis by MIRU-VNTR technique and get a better understanding of the relevance of the epidemiological and clinical potential of RDRio genotype in municipalities in the state of São Paulo, investigating possible associations with clinical and epidemiological data. Besides this study investigate possible transmission between contacts of patients with TB. Heterogeneity was observed in both regions that were grouped independently in phylogenetic analysis. Nevertheless some specific isolated from both regions showed high genetic similarity. When investigated epidemiological data of these patients 30% were from prisons. This suggests a recent transmission process within the penitentiaries to the general community between these two regions. Although the clustering rate found to be low, we noted in cluster formation the presence again of patients sharing the same genetic profile in different penitentiaries suggesting once more a transmission between distinct prision units. Regarding RDRio deletion was found h... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

A tuberculose humana (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis, continua sendo uma ameaça à saúde pública no mundo, tendo resistido às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. A emergência de cepas resistentes a drogas levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novos compostos anti-TB. Estes agentes quimioterápicos podem ser desenhados baseados em vias metabólicas que sejam essenciais ao patógeno. Há uma necessidade contínua de estudos do metabolismo micobacteriano, como tentativa de identificar enzimas de relevância biológica, uma vez que estas podem representar alvos promissores para o desenvolvimento de novos agentes anti-TB. A fosforilase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtPNP), uma enzima chave da rota de salvamento de purinas, foi recentemente proposta como sendo essencial para a sobrevivência micobacteriana. Foi sugerido que esta enzima possa desempenhar um papel no processo de latência. Entretanto, não houve nenhum relato sobre o mecanismo enzimático e especificidade de substrato de MtPNP. No presente trabalho, demonstramos que MtPNP é mais específica por 2'-desoxiguanosina (2dGuo) e não catalisa a fosforólise de adenosina. Dados de velocidade inicial, inibição por produto e ligação em equilíbrio sugerem que MtPNP catalisa a fosforólise de 2dGuo por um mecanismo cinético ordenado em estado estacionário do tipo bi bi, onde o fosfato inorgânico liga-se primeiro, seguido pela ligação de 2dGuo para formar o complexo ternário cataliticamente competente, e ribose 1-fosfato é o primeiro produto a se dissociar, seguido pela guanina. Dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação de produto é o passo limitante da velocidade para a reação catalisada por MtPNP. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para o desenho de inibidores de MtPNP com potencial ação contra M. tuberculosis. / Human tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains a public health threat worldwide, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. The emergence of drug-resistant strains has led to an urgent need for the development of new anti-TB compounds. These chemotherapic agents can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism, as an attempt to identify enzymes of biological significance, as these might represent promising targets for the development of new anti-TB agents. M. tuberculosis purine nucleoside phosphorylase (MtPNP), a key enzyme of the purine salvage pathway, has been recently proposed to be essential for mycobacterial survival. It has been suggested that this enzyme may play a role in the latency process. However, there has been no report on MtPNP enzyme mechanism and substrate specificity. In the present work, we demonstrate that MtPNP is more specific to 2'-deoxyguanosine (2dGuo) and does not catalyze the phosphorolysis of adenosine. Initial velocity, product inhibition and equilibrium binding data suggest that MtPNP catalyzes 2dGuo phosphorolysis by a steady-state ordered bi bi kinetic mechanism, in which inorganic phosphate binds first followed by 2dGuo binding to form the catalytically competent ternary complex, and ribose 1-phosphate is the first product to dissociate followed by guanine. Pre-steady-state kinetic data indicate that product release is the ratelimiting step for MtPNP-catalyzed reaction. The results described here should be useful to the design of MtPNP inhibitors with potential action against M. tuberculosis.

A tuberculose humana (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis, continua sendo uma ameaça à saúde pública no mundo, tendo resistido às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. A emergência de cepas resistentes a drogas levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novos compostos anti-TB. Estes agentes quimioterápicos podem ser desenhados baseados em vias metabólicas que sejam essenciais ao patógeno. Há uma necessidade contínua de estudos do metabolismo micobacteriano, como tentativa de identificar enzimas de relevância biológica, uma vez que estas podem representar alvos promissores para o desenvolvimento de novos agentes anti-TB. A fosforilase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtPNP), uma enzima chave da rota de salvamento de purinas, foi recentemente proposta como sendo essencial para a sobrevivência micobacteriana. Foi sugerido que esta enzima possa desempenhar um papel no processo de latência. Entretanto, não houve nenhum relato sobre o mecanismo enzimático e especificidade de substrato de MtPNP. No presente trabalho, demonstramos que MtPNP é mais específica por 2'-desoxiguanosina (2dGuo) e não catalisa a fosforólise de adenosina. Dados de velocidade inicial, inibição por produto e ligação em equilíbrio sugerem que MtPNP catalisa a fosforólise de 2dGuo por um mecanismo cinético ordenado em estado estacionário do tipo bi bi, onde o fosfato inorgânico liga-se primeiro, seguido pela ligação de 2dGuo para formar o complexo ternário cataliticamente competente, e ribose 1-fosfato é o primeiro produto a se dissociar, seguido pela guanina. Dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação de produto é o passo limitante da velocidade para a reação catalisada por MtPNP. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para o desenho de inibidores de MtPNP com potencial ação contra M. tuberculosis. / Human tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains a public health threat worldwide, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. The emergence of drug-resistant strains has led to an urgent need for the development of new anti-TB compounds. These chemotherapic agents can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism, as an attempt to identify enzymes of biological significance, as these might represent promising targets for the development of new anti-TB agents. M. tuberculosis purine nucleoside phosphorylase (MtPNP), a key enzyme of the purine salvage pathway, has been recently proposed to be essential for mycobacterial survival. It has been suggested that this enzyme may play a role in the latency process. However, there has been no report on MtPNP enzyme mechanism and substrate specificity. In the present work, we demonstrate that MtPNP is more specific to 2'-deoxyguanosine (2dGuo) and does not catalyze the phosphorolysis of adenosine. Initial velocity, product inhibition and equilibrium binding data suggest that MtPNP catalyzes 2dGuo phosphorolysis by a steady-state ordered bi bi kinetic mechanism, in which inorganic phosphate binds first followed by 2dGuo binding to form the catalytically competent ternary complex, and ribose 1-phosphate is the first product to dissociate followed by guanine. Pre-steady-state kinetic data indicate that product release is the ratelimiting step for MtPNP-catalyzed reaction. The results described here should be useful to the design of MtPNP inhibitors with potential action against M. tuberculosis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-11Bitstream added on 2014-06-13T18:56:00Z : No. of bitstreams: 1 mendes_nh_me_arafcf.pdf: 650825 bytes, checksum: 5f25430d19f2f2c2a96d1d63836fe97c (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O estudo da epidemiologia molecular através de diferentes técnicas vigentes revolucionou a compreensão da epidemiologia da tuberculose. A técnica Spoligotyping tem sido extensamente aplicada no estudo da epidemiologia molecular da tuberculose, para abordar estrutura populacional do M. tuberculosis, atentando para identificar principais linhagens e distribuições geográficas. Por outro lado, técnicas moleculares para diferenciar cepas de M. tuberculosis, tais como RFLP e MIRU possibilitam agrupar isolados clínicos de M. tuberculosis provenientes de pacientes que apresentam ligações epidemiológicas, identificando cadeias de transmissão e discriminando os isolados a nível clonal. A presente dissertação objetivou utilizar as técnicas de Spoligotyping e MIRU, para compreender um pouco mais sobre a tuberculose de uma metrópole, avaliando isolados provenientes do Ambulatório do Instituto Clemente Ferreira (referência no tratamento de tuberculose) na cidade de São Paulo. Os isolados clínicos de pacientes atendidos no período de agosto de 2006 a julho de 2008 foram reidentificados pela técnica molecular de PCR, e as cepas identificadas como de M. tuberculosis foram submetidas à genotipagem pelas técnicas de Spoligotyping e MIRU. Foi confirmada a identificação de M. tuberculosis em 93 isolados clínicos pela técnica de PCR-IS6110. No Spoligotyping, do total de 93 isolados, 21 amostras (22,6%) revelaram spoligotipos ainda não descritos na base de dado mundial (SpolDB4, SITVIT e Spotclust) e 51 (54,8%) estavam envolvidos em 12 cluster, 7 diferentes famílias e 36 spoligotipos. A família mais freqüente foi a LAM (26 isolados), seguida de T (24 isolados) e Haarlem (11 isolados), que juntos representaram 65,4% de todos os isolados. Essas 3 famílias representam os genótipos mais freqüentemente encontrados na África, América Central, América do Sul e Europa. Seis SITs... / The molecular epidemiology study using different techniques has improved the epidemiology of tuberculosis understanding. The Spoligotyping technique has been widely applied in the study of molecular epidemiology of tuberculosis, to address population structure of M. tuberculosis, focusing on the identification of the main lines and geographic distributions. Furthermore, molecular techniques used to differentiate strains of M. tuberculosis, such as RFLP and MIRU can be used for clustering clinical isolates of M. tuberculosis from patients with epidemiological links, identifying chains of transmission and discriminating isolates at the clonal level. In this work the techniques of Spoligotyping and MIRU were used to understand a little more about tuberculosis in a metropolis, assessing isolates from the Ambulatory Clemente Ferreira Institute (reference in the treatment of tuberculosis) in São Paulo. Clinical isolates from patients treated between August 2006 and July 2008 were re-identified by the molecular technique of PCR, were strains identified as M. tuberculosis were evaluated through genotyping the use of Spoligotyping and MIRU techniques. By PCR-IS6110 the identification of M. tuberculosis was confirmed in 93 clinical isolates. The total of 93 isolates, 21 samples (22.6%) in Spoligotyping showed spoligotypes have not yet been described in the world’s data base (SpolDB4, SITVIT and Spotclust) and 51 (54.8%) were involved in 12 clusters, seven different families and 36 spoligotypes. The most frequent family was the LAM (26 isolates), followed by T (25 isolates) and Haarlem (11 isolates), which together accounted 65,4% of all isolates. These three families represent the most frequently genotypes found in Africa, Central America, South America and Europe. Six SITs accommodated 51.4% (37/72) of all isolates identified in SpolDB4 (SIT53, SIT50, SIT42, SIT60, SIT17 and SIT1). By technique... (Complete abstract click electronic access below)

A Tuberculose é uma das doenças infecciosas mais antiga e bem descrita. Entretanto, ainda permanece como um dos principais problemas de saúde pública a ser enfrentado em âmbito global. A implantação de novas estratégias no controle da Tuberculose requer uma melhor compreensão dos mecanismos que sucedem a fagocitose das micobactérias por macrófagos. Após a fagocitose, as micobactérias dão início a um conjunto de ações para sobreviverem e se replicarem no ambiente intracelular, entre as quais a provável interferência no processo de morte celular. Estudos mostram que M. tuberculosis pode apresentar habilidade de interferir no mecanismo de morte celular. Essa habilidade se tornou um desafio a ser estudado devido às implicações que isso deve ter na patogênese da doença. O nosso estudo teve por objetivo analisar a expressão de genes anti-apoptóticos (bcl-2, bcl-x e mcl-1) e pro-apoptóticos (bak, bax e bid) por PCR em tempo Real em macrófagos humanos derivados de células THP-1 após diferenciação induzida por PMA. Além disso, analisar a porcentagem de fragmentação de DNA nesses macrófagos, utilizando a citometria de fluxo, pois a fragmentação internucleossômica do DNA é uma das características apresentadas por células apoptóticas. Para as infecções foram utilizados isolados clínicos de M. tuberculosis com perfil de suscetibilidade a fármacos diferentes e a cepa padrão H37Rv (ATCC). Os dados de expressão foram analisados pela diferença de entre os isolados clínicos sensíveis, resistentes a três dos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose humana e a cepa padrão H37Rv, utilizando-se o método de 2-ΔΔCT. Para comparar os resultados de expressão gênica, bem como a porcentagem de fragmentação de DNA, nos macrófagos infectados com os diferentes isolados clínicos, foram utilizados análise de variância (ANOVA) e o teste de comparação múltipla de Tukey. Os resultados sugerem, que os isolados clínicos resistentes a INH, RIF e EMB utilizados no nosso estudo, bem como a cepa padrão H37Rv (ATCC), não induzem mecanismos anti-apoptóticos para evadir da resposta imune. A ocorrência de fragmentação de DNA nos macrófagos infectados é um indicativo de morte por apoptose ou pyroptose. Além disso, o tempo de infecção éum fator importante e, com certeza, infecções com tempos maiores poderiam induzir ainda mais a morte dos macrófagos infectados. / Tuberculsis, an ancient infection disease, continues to thrive. Although well described, it remains a world health problem to overcome. The development and application of new strategies to control Tuberculosis requires a better understanding of mechanisms involved in mycobacteria-macrophages interaction. Following phagocytosis, mycobacteria initiates a variety of actions to survive and multiply themselves inside macrophages. According to researches, mycobacteria might interfere in the cell death mechanism. This ability became a challenge to be studied due to its implications in the pathogenesis of the disease. The aim of this study was to analyze the gene expression of anti-apoptotic (bcl-2, bcl-x e mcl-1) and pro-apoptotic genes (bak, bax e bid) in PMA-treated THP-1 cells by Real Time qPCR. Moreover, the percentage of macrophage DNA fragmentation was assessed by flow citometry because internucleosomal DNA fragmentation is characteristic of apoptotic and pyroptotic cell death. The infection was carried out using clinical isolates of M. tuberculosis resistent to multiple drugs, drug susceptibility and the M. tuberculosis H37Rv strain. The difference in the expression profile among clinical isolates, susceptible and resistant to three drugs used in the TB treatment, and the M. tuberculosis H37Rv were evaluated with the method 2-ΔΔCT. In order to compare gene expression patterns as well as the percentage of DNA fragmentation in macrophages infected with different clinical isolates, it was used analysis of variance (ANOVA) and Tukey`s multiple comparison test. The results suggest that M. tuberculosis H37Rv and the clinical isolates presenting higher drug resistant profile might induce programmed cell death in macrophages after 24-h infection. This was observed in the gene expression pattern and also in the macrophage DNA fragmentation profile, which indentifies apoptosis or pyroptosis. Therefore, it is suggested these clinical isolates and M. tuberculosis H37Rv do not present anti-apoptotic mechanisms to evade immune response. Moreover, the infection time is an important factor and, definitely, infections for long time could induce increase death of the infectados macrophages.

A tuberculose humana (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis, continua sendo uma ameaça à saúde pública no mundo, tendo resistido às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. A emergência de cepas resistentes a drogas levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novos compostos anti-TB. Estes agentes quimioterápicos podem ser desenhados baseados em vias metabólicas que sejam essenciais ao patógeno. Há uma necessidade contínua de estudos do metabolismo micobacteriano, como tentativa de identificar enzimas de relevância biológica, uma vez que estas podem representar alvos promissores para o desenvolvimento de novos agentes anti-TB. A fosforilase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtPNP), uma enzima chave da rota de salvamento de purinas, foi recentemente proposta como sendo essencial para a sobrevivência micobacteriana. Foi sugerido que esta enzima possa desempenhar um papel no processo de latência. Entretanto, não houve nenhum relato sobre o mecanismo enzimático e especificidade de substrato de MtPNP. No presente trabalho, demonstramos que MtPNP é mais específica por 2'-desoxiguanosina (2dGuo) e não catalisa a fosforólise de adenosina. Dados de velocidade inicial, inibição por produto e ligação em equilíbrio sugerem que MtPNP catalisa a fosforólise de 2dGuo por um mecanismo cinético ordenado em estado estacionário do tipo bi bi, onde o fosfato inorgânico liga-se primeiro, seguido pela ligação de 2dGuo para formar o complexo ternário cataliticamente competente, e ribose 1-fosfato é o primeiro produto a se dissociar, seguido pela guanina. Dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação de produto é o passo limitante da velocidade para a reação catalisada por MtPNP. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para o desenho de inibidores de MtPNP com potencial ação contra M. tuberculosis. / Human tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains a public health threat worldwide, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. The emergence of drug-resistant strains has led to an urgent need for the development of new anti-TB compounds. These chemotherapic agents can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism, as an attempt to identify enzymes of biological significance, as these might represent promising targets for the development of new anti-TB agents. M. tuberculosis purine nucleoside phosphorylase (MtPNP), a key enzyme of the purine salvage pathway, has been recently proposed to be essential for mycobacterial survival. It has been suggested that this enzyme may play a role in the latency process. However, there has been no report on MtPNP enzyme mechanism and substrate specificity. In the present work, we demonstrate that MtPNP is more specific to 2'-deoxyguanosine (2dGuo) and does not catalyze the phosphorolysis of adenosine. Initial velocity, product inhibition and equilibrium binding data suggest that MtPNP catalyzes 2dGuo phosphorolysis by a steady-state ordered bi bi kinetic mechanism, in which inorganic phosphate binds first followed by 2dGuo binding to form the catalytically competent ternary complex, and ribose 1-phosphate is the first product to dissociate followed by guanine. Pre-steady-state kinetic data indicate that product release is the ratelimiting step for MtPNP-catalyzed reaction. The results described here should be useful to the design of MtPNP inhibitors with potential action against M. tuberculosis.