Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T03:34:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 249429.pdf: 3363259 bytes, checksum: 38f8dd99b759ea476f6268236b2e2462 (MD5) / Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) de diversos microrganismos possuem importantes papéis na determinação da patogenicidade por modificação do equilíbrio entre fosforilação/defosforilação dentro do hospedeiro. Deste modo, a identificação de substratos das PTPs torna-se um passo essencial para compreensão de seus papéis fisiológicos, e também contribuem para o desenvolvimento de novos fármacos. Neste trabalho, a metodologia de 'mutant substrate-trapping' foi utilizada como ferramenta para identificação de potenciais substratos fisiológicos de PtpA, uma das duas únicas tirosina-fosfatases presentes em Mycobacterium tuberculosis. A mutação do Asp126 no sítio ativo de PtpA converteu uma enzima ativa em um 'mutant substrate-trapping': PtpA-D126A. Ambas as enzimas, ativa/não mutada ('wild-type' - wt) e mutante D126A, foram purificadas e caracterizadas por estudos cinéticos e estruturais. O mutante D126A mostrou ser uma boa ferramenta para 'mutant substrate-trapping', apresentando valor de Km semelhante à proteína ativa, todavia com Vmax reduzido, mantendo os possíveis substratos mais tempo unidos ao seu sítio ativo. Para identificar prováveis substratos de PtpA, ensaios in vitro foram realizados, por incubação de PtpA-D126A com diferentes extratos de macrófagos humanos da linhagem THP-1. Os experimentos foram realizados na escala de Ressonância Plasmônica de Superfície e posteriormente passados a miligramas de proteína. Os complexos PTP-substrato foram isolados por imobilização covalente da PtpA-D126A à resina de agarose e analisados por SDS-PAGE. A identificação por espectrometria de massa dessas proteínas, bem como das proteínas de E. coli co-eluídas com PtpA-D126A durante cromatografias de afinidade e exclusão molecular, revelou alguns possíveis substratos de PtpA. Outros ensaios estão programados para confirmação dos resultados e identificação de substratos fisiológicos da proteína tirosina-fosfatase PtpA de M. tuberculosis.

DANTAS, João Carlos Pinheiro. Ação antimicrobiana de óleos essenciais sobre a cepa padrão H37RV de Mycobacterium tuberculosis. 2014. 94 f. Dissertação (mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-08-22T16:03:01Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_jcpdantas.pdf: 2411680 bytes, checksum: 563e23b65904e199158e3f937b406cb5 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-08-22T16:04:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_jcpdantas.pdf: 2411680 bytes, checksum: 563e23b65904e199158e3f937b406cb5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-22T16:04:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_jcpdantas.pdf: 2411680 bytes, checksum: 563e23b65904e199158e3f937b406cb5 (MD5) Previous issue date: 2014 / The infectious agent is the Mycobacterium tuberculosis, one mycobacteria with high capacity to acquire resistance to agents used in the treatment. The development of new drugs or treatments with antimicrobial activity is necessary for reducing the prevalence of the disease. Plants through secondary metabolic pathways produce various compounds, being already observed biological activity against mycobacteria in some classes of terpenoids. This study evaluated the antimicrobial activity of essential oils from Lippia alba, Lippia sidoides, Cymbopogon citratus, Plectranthus amboinicus and Cinnamomun zeylanicum against standard strain (H37Rv) of M. tuberculosis. The technique used was in 96-well microdilution (Resazurin Microtiter Assay - REMA) card, which uses the rezasurina, redox indicator for the evaluation of the bacterial growth. The yield of extraction of oils from L. alba, L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus and C. zeylanicum was 0.49%, 0.68%, 0.30%, 0.009% and 0.13%, respectively. Citral was found as the major constituent of oil of L. alba (70.6%) and C. citratus (80.7%). The oil of L. sidoides has as the main constituent the caryophyllene (30.2%). The thymol (64.3%) was found in a higher percentage of oil concentration in P. amboinicus. In the oil of C. zeylanicum the trans-cinnamaldehyde (86.0%) was found as the main constituent. The essential oil of L. alba do not showed antimicrobial activity. The oil of L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus and C. zeylanicum showed MIC of 299.5±117.2mg/ml, 1.250μg/ml, 351.6±55.2mg/ml and 286.5±130.2g/ml, respectively. The oil that showed higher antimicrobial activity was the of L. sidoides, with power of 5.4 x 10-4. The results show that essential oils of L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus and C. zeylanicum contains substances with properties of inhibiting the growth of the standard strain H37Rv of M. tuberculosis. Essential oils are promising alternatives in the discovery of new therapeutic agents. / A doença tuberculose é altamente infecciosa e estima-se que um terço da população mundial esteja infectada. Em 2012, foi estimado que 8,6 milhões de pessoas no mundo tiveram a doença, representando umas das doenças infecciosas que mais matam no mundo. O agente causador da infecção é o Mycobacterium tuberculosis, uma micobactéria com alta capacidade de adquirir resistência aos fármacos usados no tratamento. O desenvolvimento de novas drogas ou opções terapêuticas com atividade antimicobacteriana se faz necessário para a redução da prevalência da doença. As plantas através de vias metabólicas secundárias produzem diversos compostos, sendo já verificada atividade biológica contra micobactérias em algumas classes de terpenóides. Este estudo avaliou a atividade antimicobacteriana de óleos essenciais de Lippia alba, Lippia sidoides, Cymbopogon citratus, Plectranthus amboinicus e Cinnamomun zeylanicum contra a cepa padrão (H37Rv) de M. tuberculosis. A técnica utilizada foi de microdiluição em placa de 96 poços (Resazurin Microtiter Assay - REMA), onde se utiliza a rezasurina, indicador de oxirredução, para a avaliação do crescimento bacteriano. O rendimento da extração dos óleos de L. alba, L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus e C. zeylanicum foi de 0,49%, 0,68%, 0,30%, 0,009% e 0,13%, respectivamente. O citral foi encontrado como o principal constituinte dos óleos de L. alba (70,6%) e C. citratus (80,7%). O óleo de L. sidoides teve como principal constituinte o cariofileno (30,2%). O timol (64,3%) foi encontrado em maior percentual de concentração no óleo do P. amboinicus. No óleo de C. zeylanicum foi encontrado o trans-cinamaldeído (86,0%) como principal constituinte. O óleo essencial de L. alba não apresentou atividade antimicobacteriana. Os óleos de L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus e C. zeylanicum apresentaram CIM de 299,5±117,2µg/ml, 1.250µg/ml, 351,6±55,2µg/ml e 286,5±130,2µg/ml, respectivamente. O óleo que apresentou maior atividade antimicobacteriana foi o de L. sidoides, com potência de 5,4 x 10-4. Os resultados mostram que os óleos essenciais de L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus e C. zeylanicum, contém substâncias com propriedades de inibição do crescimento da cepa padrão H37Rv de M. tuberculosis. Os óleos essenciais são alternativas promissoras na descoberta de novos agentes terapêuticos.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6776_Dissertação final (corrigida).pdf: 1783247 bytes, checksum: 5b17d1a4a0dcae9cf20689c293eb3d5f (MD5) Previous issue date: 2013-08-22 / A resistência a fármacos antituberculose tem constituído uma grande ameaça ao controle da tuberculose em âmbito mundial. A sua detecção precoce permite ao médico instituir um esquema de tratamento mais adequado ao paciente e consequentemente quebrar a cadeia de transmissão dos bacilos. Os testes de sensibilidade a antimicrobianos atuais, embora eficientes, são caros e/ou demorados e/ou trabalhosos. Com base nesta premissa, nos propusemos a desenvolver e padronizar um método fenotípico direto para determinação da sensibilidade do Mycobacterium tuberculosis a antimicrobianos de primeira linha do tratamento da tuberculose. Para o desenvolvimento deste novo teste, utilizaram-se os princípios do método das proporções e do exame de cultura pelo método de OgawaKudoh. O estudo foi dividido em duas fases. A primeira, caracterizada pelo desenvolvimento e padronização do método proposto e a segunda, pela análise da concordância entre o método desenvolvido e o método do MGIT (padrão-ouro). Na primeira fase, foram realizados diversos ensaios para definir: os volumes de absorção e de liberação de líquidos de diferentes tipos de swab, o meio de cultura, as concentrações dos antimicrobianos e o tempo de leitura/interpretação das culturas. Além disso, foi verificado se a amostra deveria ou não ser diluída. Com base nos resultados destes ensaios, padronizou-se o método com: swab comercial, em meio de cultura Ogawa-Kudoh contendo separadamente 0,2 µg/mL de isoniazida, 40,0 µg/mL de rifampicina, 10,0 µg/mL de estreptomicina e 500,0 µg/mL de ácido para-nitrobenzóico. Padronizou-se ainda a inoculação da amostra de escarro de forma direta, ou seja, sem diluir e a leitura/interpretação do resultado do teste no período entre 21 e 28 dias. A análise comparativa entre este método e o teste de ensibilidade a antimicrobianos no sistema MGIT realizada na segunda fase do projeto indicou um índice kappa igual a 1,000, ou seja, uma concordância muito boa em relação ao padrão-ouro. Diante desses resultados promissores, acreditamos que o método desenvolvido apresente um grande potencial para ser utilizado em laboratórios com pouca infra-estrutura, por ser de baixo custo, fácil execução e relativamente rápido. Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, escarros, antimicrobianos, testes de sensibilidade bacteriana, resistência a drogas.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6785_Dissertação Luciana Covre.pdf: 8157330 bytes, checksum: a64b5294ff76df4f2f66506071de3e87 (MD5) Previous issue date: 2013-08-29 / Acredita-se que indivíduos PPD+ representam um dos maiores reservatórios de transmissão da tuberculose, pois podem sofrer uma reativação da tuberculose latente e transmitir silenciosamente o bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) para seus contactantes. Em relação aos casos de tuberculose ativa existentes, sabe-se que a maioria é devido à reativação da infecção latente. Portanto a latência ainda é um grande obstáculo para alcançar o controle da tuberculose. A capacidade de controlar a infecção pelo Mtb está correlacionada com as funções imunológicas do hospedeiro. Os receptores Tipo Toll, principalmente TLR2 e TLR4, podem exercer participação direta a respeito dessa função imune, visto que possuem capacidade de iniciarem e direcionarem tanto a resposta inata quanto a adaptativa. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel de receptores do tipo Toll 2 e 4 na resposta imune de indivíduos sadios reativos ou não ao teste tuberculínico (PPD+ e PPD-) frente ao desafio in vitro com Mycobacterium tuberculosis. Para isso, foram arrolados 13 indivíduos PPD+ e 11 indivíduos PPD-, nos quais avaliamos: 1) a frequência de células T reguladoras, 2) a atividade microbicida, e o 3) perfil de citocinas e óxido nítrico, após a infecção com o Mtb com ou sem o bloqueio dos receptores TLR2 e TLR4. Observamos que indivíduos PPD+ apresentaram maior frequência de células T reguladoras e carga bacilar que o grupo PPD- e que os receptores TLR2 e TLR4 possuem papel distinto na ativação da resposta imune. O bloqueio do receptor TLR2 reduziu a frequência de células T reguladoras e a capacidade microbicida do grupo PPD+. Por outro lado o bloqueio do receptor TLR4 aumentou a capacidade microbicida dos grupos PPD+ e PPD-, o que pode estar associado à redução na produção da citocina IL10. Dessa forma, nossos dados sugerem que a pré-exposição ao Mtb e/ou micobactérias ambientais, apesar de levar a uma memória imunológica nos indivíduos PPD+, não influencia na capacidade de eliminação do patógeno por esse grupo. Diversos mecanismos podem estar associados a essa dificuldade na eliminação do Mtb sendo a imunorregulação provocada pelo aumento de células T reguladoras um desses mecanismos. Além disso, observamos que os receptores TLR 2 e TLR4 possuem capacidade de modular a resposta imune contra o Mtb e podem ser futuros alvos para tratamentos anti-TB e quimioprofilaxia da TB latente. Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, tuberculose latente, Purified Protein Derivative, PPD, células T reguladoras, receptores tipo Toll.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8103_Dissertação Kaymerê Final Corrigida.pdf: 1721673 bytes, checksum: 349a8b28df3024da428191034c651c47 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / A parede celular de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é constituída por 60% de lipídios, impedindo a passagem de uma grande quantidade de substâncias, além de desempenhar um importante papel na munopatogênese. A apresentação desses antígenos aos linfócitos se dá por meio de moléculas do tipo CD1. Por sua vez a Apolipoproteína-E (ApoE), glicoproteína amplamente distribuída nos tecidos, pode facilitar a apresentação de lipídios pelo CD1. A ApoE possui três principais alelos ApoE- 2, 3 e 4, que codificam três isoformas de proteínas, tipos 2, 3 e 4, que possuem diferentes estruturas e funções. A presença de determinadas isoformas da ApoE está associada a doenças infecciosas, como herpes labial, dano hepático severo causado pelo vírus da hepatite C, diarréia infantil e tuberculose pulmonar. Neste contexto, avaliamos a participação da ApoE na atividade microbicida in vitro frente ao Mtb. Para tanto, foram arrolados 13 indivíduos PPD-, 17 indivíduos PPD+ e 4 indivíduos com tuberculose pulmonar ativa. O uso de plasma humano depletado de ApoE nos experimentos de atividade microbicida in vitro mostraram um aumento significante (p=0,02) no número de micobactérias (431.5 ± 81.92 UFC) quando comparado ao grupo controle (313.0 ± 74.61 UFC). Esses resultados foram confirmados por um modelo experimental utilizando esplenócitos de camundongos de camundongos C57BL/6 (815.9 ± 76.32 UFC) e animais APOE nocaute (1133 ± 86.85 UFC) (p= 0.021). Quanto à produção de IL-10, no grupo PPD+, observamos que o grupo com depleção de ApoE (866.7 ± 447.8) apresentou uma produção menor desta citocina com relação ao controle infectado (1089 ± 481.3) (p=0,023). Já em relação ao IFN-, em ambos os grupos observou-se, após 72 horas, uma tendência à diminuição da produção dessa citocina no grupo com depleção, com relação ao grupo controle. Esses dados sugerem que a ApoE tem papel distinto na ativação da resposta imune e sua ausência pode prejudicar a resposta imune frente à tuberculose.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:35:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8567_Tese de doutorado Renata Nóbrega.pdf: 3031933 bytes, checksum: 14ff2b6175baee37b4eaad172d5cbb11 (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / Introdução: Técnicas de tipagem molecular têm colaborado para o entendimento da dinâmica de transmissão da tuberculose (TB). Apesar de inúmeros trabalhos terem sido publicados a esse respeito, poucos estudos, no entanto, foram realizados levando-se em consideração a dinâmica de modificação dos perfis genotípicos de M. tuberculosis (Mtb) em um intervalo de tempo longo. Objetivos: Caracterizar os genótipos e identificar os fatores de risco associados com transmissão recente e tamanho de cluster de Mtb na Região Metropolitana de Vitória ES (RMV) e analisar a dinâmica de modificação dos genótipos de Mtb na Região Metropolitana de Vitória ES em intervalo de 10 anos. Métodos: Este estudo foi constituído de duas partes. Primeira parte: Estudo transversal de casos novos de TB diagnosticados na RMV, entre 2000 e 2010 para identificar fatores de risco associados à transmissão recente da TB e o tamanho do cluster de Mtb. A genotipagem dos isolados de Mtb foi realizada com base nos métodos de RFLP IS 6110, Spoligotyping e na análise de deleção RDRio. Foram realizados Modelos de regressão hierárquica polinomial para identificar os fatores associados com o tamanho do cluster. Segunda Parte: Estudo observacional para analisar a dinâmica de modificação dos genótipos de Mtb na RMV em intervalo de 10 anos (com cortes transversais nos períodos de 2000 2001 e 2011) com base nas técnicas de RFLP IS 6110 e MIRU- VNTR 24 loci tendo como fonte de dados registros laboratoriais e o SINAN. Resultados: Primeira Parte: Dentre os 959 isolados de Mtb, 461 (48%) casos pertenciam a um cluster. Nossos modelos de regressão polinomial mostraram que os isolados de Mtb pertencentes a família LAM e ao genótipo RDRio foram mais prováveis de estarem em clusters com 6-9 isolados (OR = 1,17, 95% IC 1,08 1,26; OR=1,25, 95% IC 1,14- 1,37; respectivamente) em relação aos outros grupos. Os pacientes com ≥10 isolados foram mais prováveis de pertencerem a família LAM e a família de RFLP ES14 (OR = 1,14, 95% IC 1,06 1,23; OR= 7,03, 95% IC 4,00 12,34, respectivamente). Segunda Parte: No período de 2000-2001, dentre os 329 isolados, 109 (33,2%) foram agrupados em 38 clusters enquanto, em 2011, dentre os 485 isolados de Mtb, 176 (36,2%) foram distribuídos em 39 clusters. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os períodos analisados em relação a formação de um cluster (p=0,35). A análise dos padrões gerados pelo RFLP IS 6110 identificou 8 clusters, ao quais estão mais envolvidos com transmissão recente na RMV. A correlação entre as duas técnicas de genotipagem mostrou em 2000-2001 uma concordância de 42,1%, e 42,5% em 2011. Conclusão: Esses resultados confirmam que a família LAM e o genótipo RDRio são mais encontrados em clusters com 6-9 isolados, e que a família de RFLP ES14 é o genótipo mais prevalente na RMV, sugerindo que a proporção de casos de TB em uma cidade pode ser causada por um pequeno número de genótipos circulantes dentro de uma região e que fatores relacionados ao patógeno devem ser melhor estudados para melhoria no controle da doença. Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, técnicas de genotipagem, epidemiologia molecular, dinâmica de modificação do Mtb.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-12-01T03:15:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336196.pdf: 14963139 bytes, checksum: 131e91e921afd609f67ff9ee7827cde7 (MD5) Previous issue date: 2015 / Após a infecção com o bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), causador da tuberculose (TB), observa-se a formação de uma estrutura celular característica denominada granuloma. Esse agregado celular é responsável por restringir a infecção e manter a doença em estado latente. Porém, quando a forma ativa da doença se desenvolve, o infiltrado de células apresenta necrose caseosa e as bactérias entram em intenso estado replicativo. Diante deste quadro, faz-se uso de antibióticos como a isoniazida (INH), um dos pilares da quimioterapia da TB. A INH é uma pró-droga que requer ativação por uma catalase peroxidase bacteriana codificada pelo gene katG, a fim de inibir a síntese de ácidos micólicos, importantes componentes estruturais da bactéria. Entretanto, dados recentes indicam que a INH pode também ser ativada por enzimas presentes em células do hospedeiro. É possível que este fármaco aja diretamente em células que abrigam o Mtb, contribuindo para o controle do seu crescimento intracelular. Entretanto, estudos que avaliam os efeitos da INH em sistemas biológicos complexos como o granuloma são escassos. Dessa forma, a partir de um modelo de granuloma humano in vitro investigamos os mecanismos iniciais do tratamento com INH que promovem a morte micobacteriana nesse sistema. Nossos resultados demonstram que o modelo utilizado mimetiza a fase ativa da infecção, com populações celulares semelhante às encontradas na infecção in vivo, como macrófagos, células dendriticas, linfócitos e granulócitos. Ainda mais, o granuloma apresenta intensa replicação bacteriana associada à necrose celular. Verificamos ainda que a INH possui capacidade bactericida nesse sistema celular, mas que, ao menos nas fases iniciais de tratamento in vitro, esse efeito não está relacionado com ativação de células T ou monócitos e independe de importantes citocinas, como IL-1ß ou TNF. Utilizando cepas clínicas resistentes à INH, bem como experimentos de coinfecção do granuloma com cepas sensível e resistente à INH, constatamos que o fármaco age diretamente sobre a bactéria, e sua forma ativa não age diretamente nas células do granuloma para promover a morte bacteriana. O desenvolvimento desta tese, em conjunto com outros dados presentes na literatura, confirmou a necessidade de ativação do fármaco pelo patógeno para a atividade inicial bactericida da INH localmente no granuloma.<br> / Abstract : Following infection with the bacilli Mycobacterium tuberculosis (Mtb), causative agent for tuberculosis (TB), there is formation of a characteristic cellular structure named granuloma. This cellular aggregate is responsible for restricting infection and keeping disease in its latent form. However, when the active disease manifests, the cellular infiltrate undergoes caseous necrosis and bacteria start intense replication. In this scenario, it is initiated the use of antibiotics such as isoniazid (INH), one of the pillars for TB chemotherapy. INH is a pro drug that needs activation by a bacterial catalase peroxidase encoded by katG gene, in order to inhibit mycolic acids synthesis, important bacteria structural components. Nevertheless, recent data indicate that INH can also be activated by cell host enzymes. It is possible that the drug acts directly on host cells infected with Mtb, contributing to the control of intracellular growth. However, studies that evaluate INH s effect in complex biologic systems such as the granuloma are scarce. Therefore, using an in vitro human granuloma model we investigated the early mechanisms by which treatment with INH promotes mycobacterial killing in this system. Our results show that the model mimics the active phase of infection, with the same cellular population seen in in vivo infection, such as macrophages, dendritic cells, lymphocytes and granulocytes. Moreover, the granuloma presents intense bacterial replication associated to cellular necrosis. We could also confirm INH s bactericidal activity in this cellular system, though at least during early in vitro treatment, this effect was not related to T cells or monocytes activation and does not depend on important cytokines, such as IL-1ß or TNF. By using INH resistant clinical strains, as well as performing coinfection experiments with sensible and resistant INH strains, we could confirm the drug s direct action over bacteria, and that its active form does not act directly upon granuloma cells to promote bacterial killing. These thesis conclusions, together with literature data, confirmed the need of pathogen drug activation for early bactericidal activity of INH locally in the granuloma.

Os estudos sobre a resistência de Mycobacterium tuberculosis aos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (TB), vêm sendo cada vez mais explorados com o objetivo de entender melhor como funcionam os mecanismos utilizados pela micobactéria. A partir do aumento da transmissão ativa de linhagens de M. tuberculosis resistentes às drogas, tanto no Rio Grande do Sul quanto em outras regiões do Brasil, fez-se necessário um estudo relativo à resistência de M. tuberculosis à pirazinamida (PZA) e etambutol (EMB). Sabe-se até o momento que existem genes específicos que, possivelmente sejam alvos de alterações e podem proporcionar resistência ao M. tuberculosis, no entanto ainda não se têm relatos do tipo e da freqüência destas mutações nos isolados do nosso Estado e de outros locais do Brasil. Sendo assim, neste trabalho buscou-se estudar isolados de M. tuberculosis, fenotipicamente caracterizados como resistentes à PZA e/ou EMB e determinar seu perfil de susceptibilidade a partir de caracterização das mutações nos genes pncA e embB, envolvidos respectivamente com a resistência à PZA e EMB. A metodologia utilizada foi baseada primeiramente na caracterização dos isolados pelos métodos tradicionais (testes fenotípicos de susceptibilidade) seguida de extração de DNA, amplificação dos genes alvo e posteriormente seqüenciamento dos mesmos. A partir da análise das seqüências obtidas foi possível caracterizar 12 novas mutações no gene pncA, distribuídas ao longo de todo o gene, que possivelmente estejam envolvidas com a resistência dos respectivos isolados à PZA. A análise dos isolados resistentes à EMB demonstrou que nossos isolados apresentam alterações somente no códon 306 do gene embB de M. tuberculosis. Após este estudo, será possível avaliar a ocorrência das mutações nos genes específicos e inferir sobre a possível interferência das mesmas nos mecanismos relacionados com a resistência a essas drogas. Conhecendo melhor os isolados de nosso país, poderemos fornecer informações para o desenvolvimento de um melhor método de detecção da resistência. Este método, depois de adequadamente testado poderá colaborar de forma decisiva nos programas de controle da tuberculose. / Extensive research about Mycobacterium tuberculosis resistance to drugs used in tuberculosis (TB) treatment has been performed in order to have a better understanding of the mechanisms used by mycobacteria. Once active transmission of drug resistant strains of M. tuberculosis has been occurring both in Rio Grande do Sul State and in other regions of Brazil, it brought up the need of performing a study related to M. tuberculosis pyrazinamide (PZA) and ethambutol (EMB) resistance. It is known that specific genes are targets of alterations, which can lead to M. tuberculosis resistance, however, up to this moment there are no records about types or frequencies of those mutations in isolates from Rio Grande do Sul State and other sites in Brazil. Thus, in this study we aimed to evaluate M. tuberculosis isolates phenotypically characterized as PZA and/or EMB resistant, in order to determine their susceptibility profile based on the characterization of mutations in pncA and embB genes, involved in PZA and EMB resistance, respectively. Methodology used in the study was primarily based on the characterization of isolates by conventional methods (phenotypic susceptibility tests) followed by DNA extraction, target genes amplification and DNA sequencing. Sequence analysis revealed 12 novel mutations in pncA gene distributed all along the gene and they are possibly involved with PZA resistance in those isolates. Analysis of EMB resistant isolates showed our isolates presented alterations at codon 306 of embB gene of M. tuberculosis only. From this study it will be possible to evaluate the presence of mutations in specific genes in order to establish a correlation between their occurrence and the effects in the mechanisms related to the emergence of resistance to those drugs. Improving our knowledge about the isolates in our country we will be able to provide information that can be useful for the development of a methodology for the early detection of resistance. This methodology, if properly tested and validated can be highly helpful for the improvement of TB control programs.

A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de mortalidade em todo o mundo por um único agente infeccioso. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), todos os anos cerca de 8 milhões de pessoas são infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e aproximadamente 2 milhões morrem em todo mundo. Desde a década de 80, o aumento da prevalência da TB em países em desenvolvimento, o aumento e a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas, a falta de recursos públicos adequados para o tratamento e a alta incidência de pacientes infectados pelo HIV, destacou a necessidade de desenvolver novos agentes antimicobacterianos. A via do ácido chiquímico ou chiquimato está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitas do filo apicomplexa. Esta via leva a biossíntese de corismato, um importante precursor metabólico de ácido fólico, menaquinonas, micobactinas e aminoácidos aromáticos. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina é catalizada pela corismato mutase e involve a conversão de corismato a prefenato. A segunda reação é catalisada pela prefenato desidratase que realiza a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato. As enzimas presentes na via do chiquimato e biossíntese de fenilalanina parecem ser essenciais ao M. tuberculosis, o que as torna promissoras como alvo para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O gene pheA que codifica a enzima prefenato desidratase (PDT) foi amplificado por PCR do DNA genômico, clonado em vetor pET23a(+) e superexpresso em células E.coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada por FPLC e a cristalização foi realizada pela técnica de difusão de vapor “hanging drop”. Os primeiros cristais apareceram sete dias após as gotas terem sido feitas. Cristais difrataram a 3.2 Å de resolução usando uma fonte de radiação síncrotron e pertencem ao grupo orthorrombico I222 ou I212121. Análise da estrutura por substituição molecular foi realizada, contudo os resultados não foram satisfatórios. Assim, outras ferramentas foram utilizadas para inferir a estrutura da PDT. A técnica de modelagem molecular foi usada para inferir a estrutura tridimensional da PDT. Dicroísmo circular e ferramentas de bioinformática mostraram resultados similares quanto à estrutura secundária, sendo formada por 33% de hélices alfas e 18% de fitas betas. Dessa maneira, técnicas de espalhamento de raios X a baixo ângulo somado com ultracentrifugação analítica mostraram que o estado oligomérico da PDT é um homotetrâmero e com forma de um disco achatado. Dinâmica molecular demonstrou que o modelo predito é estável durante uma trajetória de 6ns. Dados experimentais e ferramentas de bioinformática corroboram os resultados aqui apresentados, dando evidências da estrutura tetramérica da PDT em solução. Além disso, este é o primeiro relato da caracterização estrutural da PDT de M.tuberculosis. / Tuberculosis (TB) is one of the major causes of deaths worldwide from an infectious agent. According to the World Health Organization (WHO), every year 8 million people are infected by Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, and approximately 2 million people died in the world. Since 1980’s the increasing of prevalence of TB in developing countries, the emergence and proliferation of multidrug-resistant and extensively drug resistant strains, the lack of adequate public resources for treatment and the high incidence of HIV-infected populations have highlighted the need for developing new antimycobacterial agents. The shikimate pathway is present in mycobacteria and absent in algae, plants, fungi and parasite of the phylum apicomplexa. This pathway leads to the biosynthesis of chorismate, an important metabolic precursor of folic acid, menaquinones, mycobactinas and aromatic amino acids. The first reaction in phenylalanine biosynthesis is catalysed by chorismate mutase and involves the conversion of chorismate to prephenate. The second reaction is catalysed by prephenate dehydratase and involves the decarboxilation and dehydratation of prephenate to phenylpiruvate. The enzymes of this pathway seem to be essential to M. tuberculosis and can thus be used as targets for the development of new antimycobacterial drugs. The pheA gene that encodes to prephenate dehydratase (PDT) was amplified by PCR from genomic DNA, cloned in pET23a(+) and overexpressed in E. coli BL21(DE3). The recombinant protein was purified by FPLC, and crystallization was performed by the hanging drop vapor diffusion method. Crystals appear seven days after drops were done. The crystal diffracted at 3.2 Å resolution using a synchrotron radiation source and belong to the orthorhombic group I222 or I212121. Molecular replacement was used to solve the structure of PDT, but did not yield meaningful results. Other tools were used to infer the structural arrangement of PDT. Molecular modeling were used to infer the three dimensional structure of PDT. Circular dicroism and bioinformatics tools were in agreement in about secondary structure, showing 33% of -helix e 18% of beta sheet. Small Angle X-Ray scattering and analytical centrifugation showed that the oligomeric state of this protein is a homotetramer and the PDT is a flat disk protein. Molecular dynamics showed that this model is stable at a trajectory of 6ns. Experimental and bioinformatics tools were in agreement and provide evidence for a tetrameric structure of PDT at solution. Therefore, this is the first report of a structural characterization of PDT from M.tuberculosis.

A tuberculose permanece sendo a principal causa de morte no mundo devido a um único agente infeccioso, Mycobacterium tuberculosis. O surgimento de cepas multi- e extensivamente-resistentes tem aumentado a perspectiva de uma futura epidemia de casos de tuberculose sem tratamento. Faz-se cada vez mais urgente a necessidade do desenvolvimento de novas drogas e vacinas, tanto para encurtar o prazo de tratamento, como para combater as cepas resistentes e o processo de latência que é estabelecido pelo bacilo. Os mecanismos moleculares pelos quais esta micobactéria estabelece infecção e latência ainda precisam ser esclarecidos. O estudo de proteínas associadas ao nucleóide tem sido um tema bastante promissor para o entendimento de mecanismos de invasão e persistência em vários microorganismos patogênicos, podendo auxiliar, também, no esclarecimento do metabolismo do bacilo para estas atividades. Neste estudo, descrevemos a caracterização inicial de uma fase de leitura identificada para uma proteína H-NS putativa de M. tuberculosis. A H-NS é uma das proteínas associadas ao nucleóide mais bem caracterizadas. O gene foi clonado, expresso, e seu produto foi, então, purificado até sua homogeneidade. Ensaios de ligação a DNA qualitativo, utilizando o EMSA, e quantitativo, por meio de ressonância plasmônica de superfície, foram realizados para a comprovação de sua atividade, tendo sido proposto um mecanismo de ligação ao DNA. Além disso, estudos de complementação realizados com a utilização de uma cepa de Escherichia coli mutante para hns sugerem que esta proteína pertence a uma nova classe de proteínas associadas ao nucleóide presentes em Mycobacterium. / Tuberculosis remains the major cause of mortality due to a bacterial pathogen, Mycobacterium tuberculosis. The emergence of multidrug- and extensively drug-resistant strains have raised the bleak prospect of a future epidemic of virtually untreatable TB. More effective antimycobacterial agents, besides new vaccines or vaccination strategies, are thus needed to improve the treatment of resistant strains, to shorten the treatment course, and to provide more effective treatment of latent infection. The molecular mechanisms by which the bacillus establishes infection and persistence have not been completely elucidated. Studies involving nucleoid-associated proteins, which have been related to the control and influence of virulence genes in pathogenic bacteria, can help unveil the virulence process of M. tuberculosis. In this study, we describe the initial characterization of an open reading frame for the M. tuberculosis putative H-NS. This protein is one of the most studied members of the nucleoid-associated proteins family. The gene was cloned, expressed and its product purified to homogeneity. A qualitative protein-DNA binding assay was carried out by gel-retardation and the protein affinity for specific DNA sequences was assessed quantitatively by surface plasmon resonance. A protein-DNA binding mechanism is proposed. In addition, functional complementation studies of an E. coli hns mutant reinforce the likelihood that Rv3852 protein represents a novel nucleoid-associated protein in M. tuberculosis.