Introduction: Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae) has been a major cause of community-acquired pneumonia (CAP), accounting for about 10-30% of the cases. Previously, a local study revealed that more than 60% of clinical isolates of M. pneumoniae exerted A2063G mutation, which confers a high level of macrolide drug resistance and results in treatment failure. While A2063G is the only mutation identified locally, a rapid diagnostic assay for detection of this single point mutation is urgently needed for switching the drug of choice. Aims: This study aims to develop a rapid PCR assay for detection of A2063G mutation of M. pneumoniae isolates for our locality, to compare with other commercially available assays and to further confirm the prevalence of A2063G mutation in macrolide-resistance M. pneumoniae (MRMP) in Hong Kong. Methods: A total of 110 respiratory tract samples were collected from 102 patients in Hong Kong Sanatorium and Hospital during April 2013 to April 2014. They were analyzed by an in-house hybridization-probe real-time PCR assay coupled with melting curve analysis to detect the presence of M. pneumoniae and the target A2063G point mutation. Results were compared with a commercial real-time PCR assay and the A2063G point mutation was further confirmed by 23S rRNA gene sequencing. The limit of detection (LOD), mutation threshold determination and cross reactivity of the in-house assay were also evaluated. Results: Over 40% (47/110) of the respiratory tract samples were tested positive for M. pneumoniae by the in-house assay and 36.2% (17/47) of the positive samples exerted A2063G mutation. The limit of detection was 500 copies/ml as evaluated using external quality control samples. Twenty well-characterized clinical isolates of M. pneumoniae were used to evaluate the A2063G mutation threshold. The mutation threshold for A2063G mutant detection was above 60%. This assay did not show any cross-reactivity with common clinical isolates from the respiratory tract samples. Conclusion: In this study, an in-house real-time PCR assay was evaluated and demonstrated its great potential as a rapid clinical diagnostic tool. The assay was highly sensitive and specific in detecting M. pneumoniae and its A2063G mutation from clinical samples in Hong Kong. The results were almost concordant to the current routine testing, with the advantage of lower cost and shorter turnaround time for rapid detection. / published_or_final_version / Microbiology / Master / Master of Medical Sciences

Thesis (PhD(HealthSciences))--University of South Australia, 2001.

Thesis (Ph. D.)--Washington State University, May 2010. / Title from PDF title page (viewed on July 19, 2010). "College of Veterinary Medicine." Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1970. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Universiẗat, Diss., 2003--Giessen.

A caracterização do repertório de proteínas expostas na superfície celular do Mycoplasma hyopneumoniae, agente etiológico da pneumonia enzootica suína (PES), é essencial para o entendimento dos processos fisiológicos associados a capacidade de infecção bacteriana, sobrevivência no hospedeiro e patogênese. Análises in silico indicam que aproximadamente um terço dos genes bacterianos codificam proteínas de superfície. Entretanto, até momento poucas proteínas de M. hyopneumoniae tiveram sua expressão e localização na superfície celular confirmadas experimentalmente, fazendo-se necessária a prospecção experimental destas proteínas utilizando ferramentas de proteômica, aumentando assim a confiabilidade dos dados obtidos in silico. Neste contexto, nós desenvolvemos uma abordagem experimental baseada na marcação in vivo da superfície celular com biotina seguida pela identificação por espectrometria de massas, associada à predições in silico, que nos possibilitou a identificação de proteínas expostas na superfície do M. hyopneumoniae. Como resultado, obtivemos 167 identificações proteicas, correspondendo a 59 proteínas não reduntantes, na abordagem proteômica experimental. A análise in silico resultou na identificação de 292 proteínas transmembrana e de 25 lipoproteínas. A análise comparativa revelou que 39 proteínas (66%) identificadas experimentalmente por espectrometria de massas como expostas na superfície celular, também foram preditas in silico com tal, sendo representadas principalmente por proteínas relacionadas com adesão, lipoproteínas e proteínas hipotéticas. As outras 20 proteínas (34%) correspondem principalmente a proteínas tradicionalmente relacionadas ao metabolismo, porém com várias delas previamente descritas atuando na superfície celular, participando de processos como interação patógeno-hospedeiro. Os resultados obtidos nesta tese fornecem uma visão geral da composição proteíca da superfície celular do M. hyopneumoniae, permitindo a seleção de alvos para futuros estudos funcionais visando melhorar o entendimento dos processos de patogenicidade bacteriana, além do desenvolvimento de drogas, vacinas e testes diagnósticos mais eficientes. / The characterization of the repertoire of proteins exposed on the cell surface by Mycoplasma hyopneumoniae, the etiological agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs, is critical to understanding physiological processes associated with bacterial infection capacity, survival and pathogenesis. It is predicted that about a third of the genes in the M. hyopneumoniae genome code for surface proteins, but so far, just a few of them have experimental confirmation of their expression and surface localization. An experimental proteomic survey of a surface protein enriched sample is necessary to better define the M. hyopneumoniae set of proteins exposed to the host, adding confidence to in silico predictions. In this work, we developed an experimental approach based on cell surface labeling followed by mass spectrometry coupled to an in silico analysis, which enabled us to survey the surface exposed proteins in M. hyopneumoniae. A total of 167 protein identifications corresponding to 59 different protein species were identified in proteomic approach. An in silico survey of M. hyopneumoniae transmembrane proteins and lipoproteins results in the prediction of 292 and 25 proteins, respectively. A comparative analysis revealed that 39 proteins (66%) experimentally identified in surface were also in silico predicted as transmembrane proteins or lipoproteins and are represented mainly by adhesion related proteins, lipoproteins and hypothetical proteins. The other 20 proteinas (34%) comprise mainly proteins traditionally related to metabolism, but some of them were previously suggested to be involved in bacterial-host interactions and pathogenicity of Mycoplasma species. The obtained results provided a better picture of the M. hyopneumoniae cell surface that will help in the understanding of processes important for bacterial pathogenesis, selection of targets for further functional studies and development of more efficient drugs, vaccines and diagnostic tools for EP treatment, prevention and control.

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES), uma doença crônica, caracterizada pela alta morbidade e baixa mortalidade, e que infecta 200 milhões de suínos anualmente, gerando milhões de dólares de perdas em todo o mundo. M. hyopneumoniae adere-se aos cílios das células do epitélio traqueal, causando a redução do movimento ciliar, predispondo o animal a patógenos secundários. É uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido, sem parede celular e com alto conteúdo de guanina+citosina. Atualmente, estão disponíveis as sequências dos genomas de três linhagens de M. hyopneumoniae, duas patogênicas (7448 e 232) e uma não patogênica (J), porém pouco se sabe a respeito das sequências que regulam e controlam a expressão gênica em espécies de Mycoplasma ou das proteínas que ligam ao DNA, que desempenham um papel fundamental em todos os aspectos genéticos do organismo, como transcrição, replicação e reparo. Tipicamente, 2-3% de um genoma procariótico e 6-7% de um eucariótico codificam proteínas que ligam ao DNA. A interação mais comum entre proteína e DNA ocorre entre uma alfa-hélice da proteína com a cavidade maior do DNA, sendo que aproximadamente 84% dos fatores de transcrição de um componente utilizam o motivo hélice-volta-hélice para a ligação ao DNA Sendo assim, a hélice-volta-hélice assume um papel central na regulação da trancrição e, portanto, torna-se um excelente alvo para análises in silico. Não há relatos de trabalhos de identificação de proteínas que ligam ao DNA de M. hyopneumoniae utilizando métodos experimentais e predições in silico. Neste trabalho foi empregado um método de cromatografia de afinidade DNA-celulose para obter amostras enriquecidas com proteínas de superfície, onde foram identificas 32 proteínas, sendo que muitas delas são conhecidas e estão realmente envolvidas em processos que requerem a ligação ao DNA. Além da análise experimental, uma análise utilizando o genoma de M. hyopneumoniae 7448 foi realizada, utilizando vários algoritmos designados a encontrar genes que codificam proteínas que ligam ao DNA, sendo que 59 proteínas foram preditas como ligantes a DNA. Da sobreposição dos dados obtidos in silico e experimentalmente foram identificadas sete proteínas, sendo duas hipotéticas. A identificação destas proteínas disponibiliza um grupo de proteínas-alvo para futuros estudos de regulação e controle da expressão gênica de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of Enzootic Pneumonia (EP), a chronical disease, characterized by high morbidity and low mortality that infects 200 million pigs every year causing hundreds of millions of dollars of loss for swine farmers worldwide. M. hyopneumoniae attaches to the cilia of the tracheal epithelial cells, causing a reduction in the ciliary action, predisposing the swine to secondary pathogens. M. hyopneumoniae is one of the smallest bacteria present in nature with a small genome, no cell wall and high guanine/cytosine content. Published genome sequences of three M. hyopneumoniae strains, two pathogenic (232 and 7448) and one nonpathogenic (J) are available, but little is understood about the sequences that regulates and control gene expression in Mycoplasma species and its DNA-binding proteins (DBPs), that plays a central role in all aspects of genetic activity within an organism, such transcription, replication and repair. Typically 2-3% of a prokaryotic genome and 6-7% of a eukaryotic genome encodes genes that codify DBPs proteins. The common protein-DNA interaction region in bacteria occurs between an alpha-helix present in the protein and the major groove of DNA. Among the bacterial one-component transcription factors (TFs), up to 84% of the output domains comprise a DNA-binding helix–turn–helix (HTH) region. Therefore, the HTH motif assumes a central role in the transcription regulation and becomes a main target to in silico predictions. There have been no reports of the in silico and experimental identification of DBPs in M. hyopneumoniae. In this work we employed a method of DNA-cellulose column chromatography to obtain a DBPs enriched sample, for later mass espectrometry analysis, were we identify 32 proteins, many of which are involved in biological processes that require DNA binding. In addition to the proteomic approach, genomic analysis of the M. hyopneumoniae 7448 genome was performed in silico with several algorithms designed to identify genes that encoded DBPs and we have characterized 59 proteins predict as DBPs. The overlap analyzes between bioinformatics and proteomics has resulted in the identification of seven proteins, two of which are hypothetical proteins. The identification of these proteins has provided a valuable set of proteins that may be used in the studies to analyze the regulation and control of the gene expression in M. hyopneumoniae.

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES), uma doença crônica, caracterizada pela alta morbidade e baixa mortalidade, e que infecta 200 milhões de suínos anualmente, gerando milhões de dólares de perdas em todo o mundo. M. hyopneumoniae adere-se aos cílios das células do epitélio traqueal, causando a redução do movimento ciliar, predispondo o animal a patógenos secundários. É uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido, sem parede celular e com alto conteúdo de guanina+citosina. Atualmente, estão disponíveis as sequências dos genomas de três linhagens de M. hyopneumoniae, duas patogênicas (7448 e 232) e uma não patogênica (J), porém pouco se sabe a respeito das sequências que regulam e controlam a expressão gênica em espécies de Mycoplasma ou das proteínas que ligam ao DNA, que desempenham um papel fundamental em todos os aspectos genéticos do organismo, como transcrição, replicação e reparo. Tipicamente, 2-3% de um genoma procariótico e 6-7% de um eucariótico codificam proteínas que ligam ao DNA. A interação mais comum entre proteína e DNA ocorre entre uma alfa-hélice da proteína com a cavidade maior do DNA, sendo que aproximadamente 84% dos fatores de transcrição de um componente utilizam o motivo hélice-volta-hélice para a ligação ao DNA Sendo assim, a hélice-volta-hélice assume um papel central na regulação da trancrição e, portanto, torna-se um excelente alvo para análises in silico. Não há relatos de trabalhos de identificação de proteínas que ligam ao DNA de M. hyopneumoniae utilizando métodos experimentais e predições in silico. Neste trabalho foi empregado um método de cromatografia de afinidade DNA-celulose para obter amostras enriquecidas com proteínas de superfície, onde foram identificas 32 proteínas, sendo que muitas delas são conhecidas e estão realmente envolvidas em processos que requerem a ligação ao DNA. Além da análise experimental, uma análise utilizando o genoma de M. hyopneumoniae 7448 foi realizada, utilizando vários algoritmos designados a encontrar genes que codificam proteínas que ligam ao DNA, sendo que 59 proteínas foram preditas como ligantes a DNA. Da sobreposição dos dados obtidos in silico e experimentalmente foram identificadas sete proteínas, sendo duas hipotéticas. A identificação destas proteínas disponibiliza um grupo de proteínas-alvo para futuros estudos de regulação e controle da expressão gênica de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of Enzootic Pneumonia (EP), a chronical disease, characterized by high morbidity and low mortality that infects 200 million pigs every year causing hundreds of millions of dollars of loss for swine farmers worldwide. M. hyopneumoniae attaches to the cilia of the tracheal epithelial cells, causing a reduction in the ciliary action, predisposing the swine to secondary pathogens. M. hyopneumoniae is one of the smallest bacteria present in nature with a small genome, no cell wall and high guanine/cytosine content. Published genome sequences of three M. hyopneumoniae strains, two pathogenic (232 and 7448) and one nonpathogenic (J) are available, but little is understood about the sequences that regulates and control gene expression in Mycoplasma species and its DNA-binding proteins (DBPs), that plays a central role in all aspects of genetic activity within an organism, such transcription, replication and repair. Typically 2-3% of a prokaryotic genome and 6-7% of a eukaryotic genome encodes genes that codify DBPs proteins. The common protein-DNA interaction region in bacteria occurs between an alpha-helix present in the protein and the major groove of DNA. Among the bacterial one-component transcription factors (TFs), up to 84% of the output domains comprise a DNA-binding helix–turn–helix (HTH) region. Therefore, the HTH motif assumes a central role in the transcription regulation and becomes a main target to in silico predictions. There have been no reports of the in silico and experimental identification of DBPs in M. hyopneumoniae. In this work we employed a method of DNA-cellulose column chromatography to obtain a DBPs enriched sample, for later mass espectrometry analysis, were we identify 32 proteins, many of which are involved in biological processes that require DNA binding. In addition to the proteomic approach, genomic analysis of the M. hyopneumoniae 7448 genome was performed in silico with several algorithms designed to identify genes that encoded DBPs and we have characterized 59 proteins predict as DBPs. The overlap analyzes between bioinformatics and proteomics has resulted in the identification of seven proteins, two of which are hypothetical proteins. The identification of these proteins has provided a valuable set of proteins that may be used in the studies to analyze the regulation and control of the gene expression in M. hyopneumoniae.

A caracterização do repertório de proteínas expostas na superfície celular do Mycoplasma hyopneumoniae, agente etiológico da pneumonia enzootica suína (PES), é essencial para o entendimento dos processos fisiológicos associados a capacidade de infecção bacteriana, sobrevivência no hospedeiro e patogênese. Análises in silico indicam que aproximadamente um terço dos genes bacterianos codificam proteínas de superfície. Entretanto, até momento poucas proteínas de M. hyopneumoniae tiveram sua expressão e localização na superfície celular confirmadas experimentalmente, fazendo-se necessária a prospecção experimental destas proteínas utilizando ferramentas de proteômica, aumentando assim a confiabilidade dos dados obtidos in silico. Neste contexto, nós desenvolvemos uma abordagem experimental baseada na marcação in vivo da superfície celular com biotina seguida pela identificação por espectrometria de massas, associada à predições in silico, que nos possibilitou a identificação de proteínas expostas na superfície do M. hyopneumoniae. Como resultado, obtivemos 167 identificações proteicas, correspondendo a 59 proteínas não reduntantes, na abordagem proteômica experimental. A análise in silico resultou na identificação de 292 proteínas transmembrana e de 25 lipoproteínas. A análise comparativa revelou que 39 proteínas (66%) identificadas experimentalmente por espectrometria de massas como expostas na superfície celular, também foram preditas in silico com tal, sendo representadas principalmente por proteínas relacionadas com adesão, lipoproteínas e proteínas hipotéticas. As outras 20 proteínas (34%) correspondem principalmente a proteínas tradicionalmente relacionadas ao metabolismo, porém com várias delas previamente descritas atuando na superfície celular, participando de processos como interação patógeno-hospedeiro. Os resultados obtidos nesta tese fornecem uma visão geral da composição proteíca da superfície celular do M. hyopneumoniae, permitindo a seleção de alvos para futuros estudos funcionais visando melhorar o entendimento dos processos de patogenicidade bacteriana, além do desenvolvimento de drogas, vacinas e testes diagnósticos mais eficientes. / The characterization of the repertoire of proteins exposed on the cell surface by Mycoplasma hyopneumoniae, the etiological agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs, is critical to understanding physiological processes associated with bacterial infection capacity, survival and pathogenesis. It is predicted that about a third of the genes in the M. hyopneumoniae genome code for surface proteins, but so far, just a few of them have experimental confirmation of their expression and surface localization. An experimental proteomic survey of a surface protein enriched sample is necessary to better define the M. hyopneumoniae set of proteins exposed to the host, adding confidence to in silico predictions. In this work, we developed an experimental approach based on cell surface labeling followed by mass spectrometry coupled to an in silico analysis, which enabled us to survey the surface exposed proteins in M. hyopneumoniae. A total of 167 protein identifications corresponding to 59 different protein species were identified in proteomic approach. An in silico survey of M. hyopneumoniae transmembrane proteins and lipoproteins results in the prediction of 292 and 25 proteins, respectively. A comparative analysis revealed that 39 proteins (66%) experimentally identified in surface were also in silico predicted as transmembrane proteins or lipoproteins and are represented mainly by adhesion related proteins, lipoproteins and hypothetical proteins. The other 20 proteinas (34%) comprise mainly proteins traditionally related to metabolism, but some of them were previously suggested to be involved in bacterial-host interactions and pathogenicity of Mycoplasma species. The obtained results provided a better picture of the M. hyopneumoniae cell surface that will help in the understanding of processes important for bacterial pathogenesis, selection of targets for further functional studies and development of more efficient drugs, vaccines and diagnostic tools for EP treatment, prevention and control.

A caracterização do repertório de proteínas expostas na superfície celular do Mycoplasma hyopneumoniae, agente etiológico da pneumonia enzootica suína (PES), é essencial para o entendimento dos processos fisiológicos associados a capacidade de infecção bacteriana, sobrevivência no hospedeiro e patogênese. Análises in silico indicam que aproximadamente um terço dos genes bacterianos codificam proteínas de superfície. Entretanto, até momento poucas proteínas de M. hyopneumoniae tiveram sua expressão e localização na superfície celular confirmadas experimentalmente, fazendo-se necessária a prospecção experimental destas proteínas utilizando ferramentas de proteômica, aumentando assim a confiabilidade dos dados obtidos in silico. Neste contexto, nós desenvolvemos uma abordagem experimental baseada na marcação in vivo da superfície celular com biotina seguida pela identificação por espectrometria de massas, associada à predições in silico, que nos possibilitou a identificação de proteínas expostas na superfície do M. hyopneumoniae. Como resultado, obtivemos 167 identificações proteicas, correspondendo a 59 proteínas não reduntantes, na abordagem proteômica experimental. A análise in silico resultou na identificação de 292 proteínas transmembrana e de 25 lipoproteínas. A análise comparativa revelou que 39 proteínas (66%) identificadas experimentalmente por espectrometria de massas como expostas na superfície celular, também foram preditas in silico com tal, sendo representadas principalmente por proteínas relacionadas com adesão, lipoproteínas e proteínas hipotéticas. As outras 20 proteínas (34%) correspondem principalmente a proteínas tradicionalmente relacionadas ao metabolismo, porém com várias delas previamente descritas atuando na superfície celular, participando de processos como interação patógeno-hospedeiro. Os resultados obtidos nesta tese fornecem uma visão geral da composição proteíca da superfície celular do M. hyopneumoniae, permitindo a seleção de alvos para futuros estudos funcionais visando melhorar o entendimento dos processos de patogenicidade bacteriana, além do desenvolvimento de drogas, vacinas e testes diagnósticos mais eficientes. / The characterization of the repertoire of proteins exposed on the cell surface by Mycoplasma hyopneumoniae, the etiological agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs, is critical to understanding physiological processes associated with bacterial infection capacity, survival and pathogenesis. It is predicted that about a third of the genes in the M. hyopneumoniae genome code for surface proteins, but so far, just a few of them have experimental confirmation of their expression and surface localization. An experimental proteomic survey of a surface protein enriched sample is necessary to better define the M. hyopneumoniae set of proteins exposed to the host, adding confidence to in silico predictions. In this work, we developed an experimental approach based on cell surface labeling followed by mass spectrometry coupled to an in silico analysis, which enabled us to survey the surface exposed proteins in M. hyopneumoniae. A total of 167 protein identifications corresponding to 59 different protein species were identified in proteomic approach. An in silico survey of M. hyopneumoniae transmembrane proteins and lipoproteins results in the prediction of 292 and 25 proteins, respectively. A comparative analysis revealed that 39 proteins (66%) experimentally identified in surface were also in silico predicted as transmembrane proteins or lipoproteins and are represented mainly by adhesion related proteins, lipoproteins and hypothetical proteins. The other 20 proteinas (34%) comprise mainly proteins traditionally related to metabolism, but some of them were previously suggested to be involved in bacterial-host interactions and pathogenicity of Mycoplasma species. The obtained results provided a better picture of the M. hyopneumoniae cell surface that will help in the understanding of processes important for bacterial pathogenesis, selection of targets for further functional studies and development of more efficient drugs, vaccines and diagnostic tools for EP treatment, prevention and control.